SOP_021_Fermentation (hier bes.: S. cerevisiae)

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1 SOP_021_Fermentation (hier bes.: S. cerevisiae) Inhalt Version erstellt am erstellt durch freigegeben durch Aufbau und Benutzung des Versuchsaufbaus für anaerobe und aerobe Hefefermentationen. Hierbei werden gleichzeitig die Gase CO2, Ethanol und O2 (nur bei aerob) sowie das produzierte Volumen gemessen. Glasfermenter Holger Müller Frank Eiden Frank Eiden Frank Eiden ergänzende SOP s: SOP_002_Messen, SOP_003_Komplexmedium, SOP_005_Gaszähler, SOP_006_Begasung, SOP_011_Biomasse mitgeltende Dokumente: Einsatzgebiet: Mittels anaerober bzw. aerober Fermentation soll unter definierten Bedingungen mit Hilfe von Hefen Ethanol produziert werden. Hinweis: die blau-gefärbten Textpassagen gelten NICHT für das Praktikum (diese SOP ist allgemein angelegt!) Inhalt: 1. Theoretischer Hintergrund 2. Material und Methoden 3. Fermenter 1 / 18

2 4. Abgasanalytik 5. Versuchsdurchführung Fermentation von S. cerevisiae 6. Aufgabenstellung und Diskussion 7. Kurzversion / Versuchsablauf: 1 Theoretischer Hintergrund Hefen Hefen zählen zu den Protoascomyceten oder Sprosspilzen. Charakteristisch sind ein septiertes Mycel sowie die Ausbildung von Kondiosporen. Ascomyceten (Schlauchpilze) gehören zusammen mit den Basidiomyceten zu den höheren Pilzen. Den eigentlichen Hefen (Saccharomycetaceae) fehlt allerdings das Mycel. Bäcker- und Bierhefen sind physiologische Rassen von Saccharomyces cerevisiae. Industriell werden meist diploide oder polyploide Rassen verwandt. Da es sich um Eukaryonten handelt, ist ihre Ähnlichkeit zu höheren Organismen deutlich größer als bei Bakterien. Eine durchschnittliche Hefezelle hat eine näherungsweise ellipsoide Form mit den Ausmaßen 5,5 x 7,0 μm (Escherichia coli, 1,0 x 3,0 μm). Daraus ergibt sich ein Volumen von ca. 100 μm³. Saccharomyces cerevisiae Die Hefe Saccharomyces cerevisiae, nach dem binomischen System mit Gattungs- und Artnamen benannt, lebt einzellig. Die Vermehrung geschieht in der asexuellen Phase durch Sprossung. Dabei werden an den Zellen nacheinander bis zu 30 Knospen gebildet, die nach der Abschnürung an der Mutterzelle sichtbare Narben hinterlassen. Das Genom ist auf einen haploiden Satz von 16 Chromosomen verteilt und umfasst zwölf Mbp (Megabasenpaare). Die Gesamtsequenz ist seit 1996 aufgeklärt und veröffentlicht. S. cerevisiae ist fakultativ anaerob, das bedeutet die Energiegewinnung für Vermehrung und Wachstum kann sowohl durch Atmung (aerob), als auch durch Gärung (anaerob), erfolgen, d.h.: Veratmung von Kohlenhydraten Veratmung von Ethanol Vergärung von Kohlenhydraten. Hefen sind also in der Lage ihren Metabolismus flexibel an Umweltbedingungen anzupassen. 2 / 18

3 Physiologie der Hefe Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae ist möglicherweise die am meisten untersuchte Hefe. Dies ist nicht nur eine Folge ihrer Bedeutung in der Industrie, wo sie in erster Linie zur Erzeugung von Alkohol in der Brennerei und Brauerei und als Biomasseproduzent in der Backhefeindustrie eingesetzt wird. Weitere Anwendungsgebiete dieser Zellen liegen in der Gewinnung von Geschmacks- und Aromastoffen, Enzymen, monoklonalen Antikörpern sowie in der Expression von Proteinen [HEYSE, 1995]. Aber auch ihre besondere Art der Glucose - Verstoffwechselung hat die Neugier mancher Wissenschaftler geweckt, so dass Saccharomyces cerevisiae zum Modellorganismus für die molekulargenetische Forschung an eukaryotischen Mikroorganismen geworden ist. Das kleine haploide Genom, die geringe Anzahl der Chromosomen sowie die unter Standardzuchtbedingungen erreichbare Generationszeit von nur 1,5 Stunden tragen mit dazu bei [SCHLEGEL, 1992]. In der Natur findet man Hefen an allen Standorten, an denen vergärbare, zuckerreiche Säfte frei werden: im Nektarsaft der Blüten und auf Blättern sowie auf reifen Früchten. Taxonomisch gehören die Hefen zur Abteilung der Pilze (Fungi) und zur Klasse der Schlauchpilze (Ascomycetes). Die weitere Einteilung der Hefen basiert im wesentlichen auf ihrer Morphologie und der Art ihrer Vermehrung. Die für Saccharomyces cerevisiae typische Art der asexuellen Vermehrung ist die Zellsprossung oder Knospenbildung. Die Sprosszellen können miteinander verbunden bleiben, oder sich völlig voneinander lösen. In Abbildung 1 ist schematisch das Querschnittsbild einer einzelnen Hefezelle dargestellt. Sie hat eine runde bis ovale Form und einen Durchmesser, der zwischen 6 und 14 μm liegt [HEYSE, 1995]. Die im Cytoplasma eingeschlossenen Organellen sind für die anabolischen und katabolischen Stoffwechselvorgänge sowie deren Energiekopplung notwendig. Nachfolgend sollen nur die im Rahmen dieser Arbeit interessierenden biologischen Grundlagen des Stoffwechsels der Hefen in komprimierter Form beschrieben werden. 3 / 18

4 Abb. 1. Schematische Darstellung einer Hefezelle Das Wachstumsverhalten von Saccharomyces cerevisiae ist typisch für Glucose -sensitive Hefen, bei denen die Glucoseaufnahme nicht über die Atmungsrate kontrolliert ist. Im Anschluss an die Glykolyse, die Umsetzung von Glucose zu Pyruvat, führt der Pyruvat - Stoffwechsel bei einem Überschuss an Glucose zu einer Bildung von Ethanol, anstelle in den Citratzyklus und die Atmungskette zu münden und dort unter Energiegewinnung zu CO2 abgebaut zu werden. Es handelt sich um eine Überlaufreaktion (Crabtree - Effekt), die beim Abbau der Überschüsse durch Wiederaufnahme des Ethanols verschwindet. Maßgebend für den vollständigen Abbau ist die verfügbare Atmungskapazität [FIECHTER, 1994; PRONK ET AL, 1996]. Diese begrenzte respiratorische Kapazität von Hefen der Gattung Saccharomyces ist in Abbildung 2 [nach SONNLEITNER und KÄPPELI, 1986] als Flaschenhals illustriert. Der als respiratorischer Flaschenhals bezeichnete Engpass in Abbildung 2 bestimmt den Weg der Kohlenstoffumsetzung zu Biomasse. Der oxidative Abbau der Glucose ist bevorzugt. Der reduktive Weg wird nur als Ausweg bei entsprechend hohem Glucoseangebot, und damit verbundener Überlastung der Respirationskapazität zugeschaltet. 4 / 18

5 Abb. 2. Erläuterung der Nutzung des Substrats Glucose bzw. Ethanol bei Hefen der Gattung Saccharomyces als respiratorischer Flaschenhals [nach SONNLEITNER und KÄPPELI, 1986]. Dabei wird das zwangsweise gebildete Ethanol ins Medium ausgeschieden. Dieses kann jedoch bei Unterschreitung der aktuellen Atmungskapazität über den oxidativen Weg von den Zellen verbraucht werden. Solange das Überangebot an Glucose nicht abgebaut ist, bleibt der überschüssige Ethanol unangetastet im Medium [FIECHTER,1994]. Hefen sind fakultativ anaerob, d.h. sie sind auch unter anaeroben Bedingungen lebens-, bzw. wachstumsfähig. Die Glucose wird dann rein reduktiv unter Bildung von Ethanol abgebaut. Bei dieser als alkoholische Gärung bezeichneten Kohlenstoffumsetzung kommt es zu einem nur geringen Wachstum der Hefen. Die Anhäufung des Ethanols im Medium fällt entsprechend stärker aus. Demzufolge werden für Hefen der Gattung Saccharomyces für den Umsatz der Kohlenstoffquellen in Biomasse drei verschiedene Stoffwechselwege unterschieden: oxidatives Wachstum auf Glucose reduktives Wachstum auf Glucose unter Bildung von Ethanol oxidatives Wachstum auf Ethanol 5 / 18

6 Anwendung im Versuch: Für die Fermentation kann handelsübliche Bäckerhefe, die in gepresster Form als Frischhefe angeboten wird oder ggfs. in Form einer Agar-Kultur-Platte, verwendet werden. 2 Material und Methoden Medium zur Kultivierung Das Fermentations-Medium enthält gemäß SOP_003_Komplexmedium die folgenden Bestandteile: - Hefeextrakt: 3g/l - Malzextrakt: 3g/l - Pepton: 5g/l - VE-Wasser: 1000ml Sterilisation: gemeinsam (mit dem Zucker bis max. 100 g/l) Bei der Berechnung der Einwaage ist ggfs. zu beachten, dass die Glucose als Monohydrat vorliegt! Für die Fermentation beträgt das Arbeitsvolumen max ml. Die Zugabe der Glucoselösung und des Inokulums stellt also eine Verdünnung des Mediums dar, da davon ausgegangen wird, dass diese keine Medienbestandteile enthalten. Die Einwaagen, sowohl für das Fermentationsmedium, als auch für die Vorkultur, sind vor Beginn des Praktikums zu berechnen! 6 / 18

7 Herstellung des Mediums und der Vorkultur Die Bestandteile der Medien werden exakt, gemäß vorangegangener Berechnung, eingewogen und in Wasser gelöst. Es wird Medium für die Fermentation wie für die Vorkultur benötigt. Jede Gruppe stellt für die jeweils nachfolgende Gruppe das Fermentationsmedium sowie die Vorkultur her. Die Medien werden im Autoklaven thermisch sterilisiert. Die Beschickung und Bedienung des Autoklaven erfolgt, unter Beachtung der Anleitung am Gerät, ausschließlich im Beisein eines/r Betreuers/Betreuerin!. Das Anlegen der Vorkultur erfolgt unter der Sterilbank (s. a. Kapitel 4.2). Der Erlenmeyerkolben mit dem sterilisierten Medium wird unter der clean-bench geöffnet und mit Hilfe einer Impföse von einer Agarplatte (o.ä.) beimpft. Die Zugabe der sterilen Glucose erfolgt selbstverständlich ebenfalls unter der cleanbench. Der beimpfte Kolben wird in einem Schüttel-Inkubator, bei 30 C für ca. 20 h inkubiert, wobei darauf zu achten ist den Schüttelkolben nicht gasdicht zu verschließen. Bei der Verwendung von Schraubdeckeln, diese mit Klebeband fixieren. Das Medium und die Glucoselösung für die Fermentation werden zur späteren Verwendung in einer Kühlzelle gelagert. Hinweis: Es werden fertig sterilisierte Grundmedien bereitgestellt <<< 3 Fermenter Es wird ein selbst entwickelter Glasfermenter mit einer Doppelwand genutzt (s. Abb.1 und 2). Gerührt wird mit einem Magnetrührer. Der Reaktor ist mit verschiedenen Messwertaufnehmern sowie den zugehörigen Transmittern ausgerüstet, welche zusätzlich zur Messwertdarstellung (ggfs. auch über verschiedene Regelungsfunktionen) verfügen. Gemessen werden können: Kohlendioxid-, Sauerstoff-, Ethanolgehalt im Abgas (BlueSens gas sensor GmbH) sowie das entstehende Gasvolumen und der ph-wert Ein Bioreaktor wird in der Praxis üblicherweise zu 70-80% mit Kulturmedium gefüllt, um im Kopfraum ein ausreichendes Volumen für das Absetzen von Flüssigkeitstropfen und ggf. zur Abscheidung von Schaum zu gewährleisten. Das Gesamtvolumen des Reaktors beträgt ca. 2 Liter, das Arbeitsvolumen 1,1. Liter. Der Reaktor sollte vor jedem Versuch zusammen mit dem angesetzten Medium thermisch sterilisiert werden. 7 / 18

8 Anaerober Aufbau Mit dem unten beschriebenen Aufbau (Abb. 1) können anaerobe Fermentationen durchgeführt werden. Neben der stabilen Temperierung mittels des Doppelmantel-Glasfermenters und dem Kryostaten kann der Prozess mit Hilfe des Rührers durchgemischt werden. Die entstehenden gasförmigen Stoffwechselprodukte wie CO2 und Ethanol können durch die angeschlossenen Sensoren direkt gemessen werden. Der Ethanolsensor ist derart kalibriert, dass er direkt die Menge Ethanol in der Flüssigphase in Vol.% anzeigt. Das produzierte Gas geht durch den Abgasschlauch in die Kühlfalle und wird volumenmäßg durch den Volumenmesser, den Milligascounter, erfasst. Die Messdaten werden mittels der beiden Multiplexer BACCom12 für die Sensoren und BACCom12CB für die Milligascounter, per RS232-Schnittstelle oder Ethernet zum Computer übertragen und dort durch die Software BACVis visualisiert und aufgezeichnet. Das gemessene Volumen wird mit dem in der BACCom12 CB integrierten Temperatursensor und dem Drucksensor (in der BACCom12) von der Software auf das Normvolumen umgerechnet. Weitere Einzelheiten entnehmen Sie bitte der Bedienungsanleitungen 3-10 (s. mitgeltende Dokumente). Die Bedienung des Gasvolumenzählers entnehmen Sie bitte SOP_005_Gaszähler. Vergleiche auch :SOP_002_Messen 8 / 18

9 Aufbau: F A B G C H D I E J Abb. 1 A Abgasleitung des Fermenters F Kryostat zur Temeprierung B Kühlfalle G Sensoren zur Bestimmung von CO2 und Ethanol C Volumenmesser (Milligascounter MGC) H Doppelmantel Glasfermenter D BACCom12 CB (Multiplexer für MGC) I Wasserschlauch zum Kryostaten E BACCom12 (Multiplexer für 12 Sensoren und Anschluß f. BACCom12CB J Rührer 9 / 18

10 Aerober Aufbau (vergl. Anaerober Aufbau) Mit dem im Folgenden beschriebenen Aufbau (Abb. 2) können aerobe Fermentationen durchgeführt werden. Neben der stabilen Temperierung mittels des Doppelmantel-Glasfermenters und dem Kryostaten kann der Prozess mit Hilfe des Rührers durchgemischt werden. Die entstehenden gasförmigen Stoffwechselprodukte wie CO2 und Ethanol sowie der Sauerstoffgehalt können durch die angeschlossenen Sensoren direkt gemessen werden. Der Ethanolsensor ist derart kalibriert, dass er direkt die Menge Ethanol in der Flüssigphase in Vol.% anzeigt. Die Besonderheit bei diesem Aufbau ist, dass die Sensoren direkt am Fermenter die Gehalte im Headspace des Fermenters bestimmen, während der im Abgas angeschlossen Sensor BlueInOne die Konzentrationen von CO2 und O2 unabhängig von Feuchtegehalt und Druck bestimmt. Die Messdaten werden mittels der beiden Multiplexer BACCom12 per RS232-Schnittstelle oder Ethernet zum Computer übertragen und dort durch die Software BACVis und BACVisSingle (für BlueInOne) visualisiert und aufgezeichnet. Weitere Einzelheiten entnehmen Sie bitte der Bedienungsanleitungen 3-10 (s. mitgeltende Dokumente). Vergleiche auch :SOP_002_Messen Im aeroben Fall (Begasung) siehe: SOP_006_Begasung 10 / 18

11 D A E B F G H C I J Abb: 2 A Abgasschlauch vom Fermenter zum Analysator BlueInOne F Sensoren für inline Messung von O2, CO2 und Ethanol B BlueInOne für CO2 und O2 Messung G Glasfermenter mit Doppelmantel C BACCom12 Multiplexer für bis zu 12 Sensoren H Wassergefüllter Schlauch vom Kryostaten zum Fermenter D Gaseinlass (einstellbar) I Glasfritte für feinverteilte Beagsung E Kryostat zur Temperierung J Magnetrührer 11 / 18

12 4 Abgasanalytik Für die Abgas-Analytik und die Bestimmung des Ethanolgehaltes im Medium, stehen spezielle Sensoren der Firma BlueSens gas sensor GmbH zur Verfügung. Es können die Konzentrationen von Kohlendioxid und Sauerstoff im Abgas bestimmt werden. Der Ethanolgehalt im Medium wird ebenfalls mittels Messung im Abgas quantifiziert. a) BlueInOne b) Gassensor im PA-Gehäuse 12 / 18

13 IR-Sensoren: Die verwandten Kohlendioxid- (BCP-CO2) und Ethanol-Sensoren arbeiten mit Infrarotlicht (IR). Der Sensorkopf beinhaltet die IR Strahlungsquelle, den Detektor und die Auswertelektronik. Der Lichtstrahl durchstrahlt einen Messraum mit dem Analytgas und wird in dem Messadapter reflektiert. Ein Detektor misst die Intensität des reflektierten Lichts, welche von der jeweiligen Analytgaskonzentration abhängig ist. Der Sensorkopf beheizt den Messadapter, so dass keine Feuchtigkeit kondensieren kann. Das Messprinzip sowohl für Kohlendioxid als auch für Ethanol ist identisch, so dass die Sensoren mit dem entsprechenden Gas von Seiten des Herstellers kalibriert wurden. ZrO2-Sensoren Der Sauerstoff-Sensor (BCP-O2) basiert dagegen auf einer Sauerstoffpumpzelle und besteht aus dem Sensorkopf und dem Messadapter. Der Sensorkopf beinhaltet die Elektronik und den elektrischen Anschluss des Messadapters. Der Messadapter enthält das eigentliche Sensorelement aus Zirkoniumdioxid, welches auf eine Betriebstemperatur von 580 C aufgeheizt wird. Wird eine Spannung an die Zelle angelegt, werden Sauerstoffionen von der Kathode zur Anode gepumpt. Wird die Kathode zusätzlich mit einer Gas- Diffusionsbarriere abgedeckt, so stellt sich bei einer Erhöhung der Spannung ein Sättigungsstrom ein, welcher ein Maß für die Sauerstoffkonzentration ist. O 2 O 2 O 2- A 13 / 18

14 BlueInOne Der BlueInOneferm ist ein kombinierter CO2 und O2 Sensor mit automatischer Feuchte- und Druckkompensation. Das zu untersuchende Gas wird über den integrierten Flussadapter an den drei Messkammern vorbeigeführt und dabei auf die Feuchte, den Druck, den CO2- und O2 Gehalt hin analysiert. Die Flussadapter sind erhältlich für alle Leitungsdurchmesser von 4 mm bis 1 ¼. Bitte beachten Sie, dass die Abmessungen und das Gewicht des Analysators durch den verwendeten Flussadapter variieren können. ELEKTRONIK 14 / 18

15 5 Versuchsdurchführung Fermentation von S. cerevisiae Die Hefe wird im Batch-Verfahren kultiviert. Dies erfordert Herstellung eines Fermentationsmediums und der Vorkultur (Inokulum) sowie die Vorbereitung des Fermenters. Anschließend wird die Fermentation, durchgeführt. Stellen Sie die Betriebsparameter der durchzuführenden Fermentation ein: Temperatur [ C] => am Kryostat einstellen Rührerdrehzahl [U min-1] (variabel) 5.1 Vorbereitung des Reaktors Für die Ethanolmessung im Abgas muss die zugehörige Thermostatisiereinheit hinter dem Fermenter rechtzeitig (ca. 1 Stunde vorher) eingeschaltet werden. Die benötigte Temperatur (je nach Temp. des Doppelmantels) ist bereits voreingestellt (s. Kryostat). Der Reaktor wurde vor dem Gebrauch mit VE-Wasser gespült, so dass dieser vor dem Einfüllen des Mediums geleert werden muss. Danach wird das vorbereitete gelöste Medium eingefüllt. Den Magnetrührer einschalten und das Rührwerk, an dem dafür vorgesehenen Potentiometer, auf die Soll-Drehzahl justieren. Der Kühlkreislauf wird eingeschaltet und die Funktion anhand des eingebauten Thermometers kontrolliert. Hinweis: Der Heizstab des Kryostaten würde ohne Flüssigkeitsbedeckung und bereits voreingestellter Prozesstemperatur, in kürzester Zeit zerstört werden! Füllstand kontrollieren und ggf. auffüllen. Aus der Nullstellung (s. vorher), kann nun die Prozesstemperatur eingestellt werden. Im aeroben Fall: Begasungsfritte vorbereiten (s. SOP_006_Begasung) Der Fermenter wird mit dem Medium befüllt. 15 / 18

16 5.2 Start der Fermentation Nach Aktivierung der Datenaufzeichnung können die restlichen Vorbereitungen zum Start der Fermentation getroffen werden. Sofern die Prozesstemperatur bereits erreicht ist, kann der Fermenter mit der Vorkultur angeimpft werden. 5.3 Ende der Fermentation Nach Beendigung der Fermentation ist der Reaktorinhalt in eine vorbereitete geeignete, Flasche (o.ä,) zu entleeren, die später ggfs. autoklaviert wird um alle MO (Mikroorganismen) thermisch zu inaktivieren. Nach der vollständigen Entleerung, den Fermenter so oft mit VE-Wasser zu spülen bis keine Spuren von Medium oder Schaum mehr sichtbar sind. Vorher unbedingt den Kryostaten abschalten, da der Heizstab ohne Flüssigkeitsbedeckung in kürzester Zeit zerstört wird! Den Reaktor wieder bis zur Marke mit VE Wasser füllen. Zuletzt sämtliche Regler an der Kontrolleinheit ausschalten. Im aeroben Fall: Begasung abdrehen! (s. SOP_006_Begasung) <<< 6 Aufgabenstellung und Diskussion am Versuchstag: Fermentation starten, incl. Mess-Software die Werte der Messungen der Abgasmessung notieren Reinigen des benutzten Equipments und Aufräumen der Arbeitsplätze Es besteht die Möglichkeit Betriebs-Parameter zu verändern, so dass mit Hilfe bestehender Vorkenntnisse Ideen entwickelt werden können, welche Änderung einer Stellgröße, zu einer Reaktion des Systems führt und in welcher Weise sich diese Änderung auf den Versuch auswirkt. Die Änderungen müssen sorgfältig dokumentiert werden. 16 / 18

17 Auswertung: Als Ergebnis können sowohl die Konzentration des enstehenden CO2s als auch die des Ethanols online gemessen werden. Parallel wird das produzierte Gasvolumen bestimmt. Beim aeroben Aufbau kann zusätzlich der Sauerstoffgehalt bestimmt werden. Zusammen mit der Begasungsrate ist somit eine Berechung der Sauerstoffverbrauchsrate (Oxygen transfer rate OTR), der Kohlendioxidbildungsrate (carbon dioxide production rate CPR) und des Respirationsquotienten (RQ) möglich (siehe SOP_OTR_CPR_RQ_Berechnung). 17 / 18

18 7. Kurzversion / Versuchsablauf: Komplexmedium ansetzen, s.o. 500ml Komplexmedium in den Glasfermenter gießen, sowie einen Rührfisch mit hineingeben Glasfermenter auf eine Rührplatte stellen Glasfermenter an die Schläuche des Kryostaten schließen (oben und unten am Fermenter sind spezielle Öffnungen für die Schläuche; es handelt sich hierbei um einen doppelwandigen Glasfermenter, der von außen durch warmes Wasser aus dem Kryostaten erwärmt wird) an alle drei runden Öffnungen oberhalb des Fermenters die Sensoren mit ihren roten Verschlusskappen draufdrehen gewünschte Menge S.cerevisiae (Bäckerhefe) hineingeben (üblich: 1 Packung) Fermenterdeckel oben draufdrehen, der ebenfalls vier kleine Öffnungen beinhaltet, davon wird eine genutzt indem man einen Schlauch draufsteckt, der in ein Gefäß mit Wasser führt (dient zur Druckentlastung im Fermenter) auf dem PC: Programm BacVis starten Rührrate auf mittlere Stufe einstellen (nur grobe Skalierung vorhanden!) und starten Kryostat auf 30 C einstellen und starten 18 / 18