SOP_017_Fermentation (hier bes.: S. cerevisiae)

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1 SOP_017_Fermentation (hier bes.: S. cerevisiae) Inhalt Version erstellt am erstellt durch freigegeben durch Versuchsaufbau und Benutzung von Schüttelkolben zur Kultivierung von z.b. Hefen mit gleichzeitiger Messung von gasförmigem CO2 und O Holger Müller Frank Eiden ergänzende SOP s: mitgeltende Dokumente: SOP_002_Messen, SOP_003_Komplexmedium, SOP_011_Biomasse MD_ MD_015_sterile_Verwendung_von Schüttelkolben_und_Abgasanalytik Einsatzgebiet: Einsatz von Schüttelkolben zur Prozessoptimierung und Ermittlung von Parametern wie z.b. OUR, CTR, RQ für das Scale-up Hinweis: die blau-gefärbten Textpassagen gelten NICHT für das Praktikum (diese SOP ist allgemein angelegt!) ACHTUNG WICHTIG: DIE KOLBEN SIND O F F E N zu betreiben => Vermeidung von zu hohen Innendrücken! Inhalt: 1. Theoretischer Hintergrund 2. Material und Methoden 3. Schüttler / Schüttelkolben 4. Abgasanalytik 5. Versuchsdurchführung Fermentation von S. cerevisiae 1 / 10

2 6. Aufgabenstellung und Diskussion 1 Theoretischer Hintergrund Hefen Hefen zählen zu den Protoascomyceten oder Sprosspilzen. Charakteristisch sind ein septiertes Mycel sowie die Ausbildung von Kondiosporen. Ascomyceten (Schlauchpilze) gehören zusammen mit den Basidiomyceten zu den höheren Pilzen. Den eigentlichen Hefen (Saccharomycetaceae) fehlt allerdings das Mycel. Bäcker- und Bierhefen sind physiologische Rassen von Saccharomyces cerevisiae. Industriell werden meist diploide oder polyploide Rassen verwandt. Da es sich um Eukaryonten handelt, ist ihre Ähnlichkeit zu höheren Organismen deutlich größer als bei Bakterien. Eine durchschnittliche Hefezelle hat eine näherungsweise ellipsoide Form mit den Ausmaßen 5,5 x 7,0 μm (Escherichia coli, 1,0 x 3,0 μm). Daraus ergibt sich ein Volumen von ca. 100 μm³. Saccharomyces cerevisiae Die Hefe Saccharomyces cerevisiae, nach dem binomischen System mit Gattungs- und Artnamen benannt, lebt einzellig. Die Vermehrung geschieht in der asexuellen Phase durch Sprossung. Dabei werden an den Zellen nacheinander bis zu 30 Knospen gebildet, die nach der Abschnürung an der Mutterzelle sichtbare Narben hinterlassen. Das Genom ist auf einen haploiden Satz von 16 Chromosomen verteilt und umfasst zwölf Mbp (Megabasenpaare). Die Gesamtsequenz ist seit 1996 aufgeklärt und veröffentlicht. S. cerevisiae ist fakultativ anaerob, das bedeutet die Energiegewinnung für Vermehrung und Wachstum kann sowohl durch Atmung (aerob), als auch durch Gärung (anaerob), erfolgen, d.h.: Veratmung von Kohlenhydraten Veratmung von Ethanol Vergärung von Kohlenhydraten. Hefen sind also in der Lage ihren Metabolismus flexibel an Umweltbedingungen anzupassen. 2 / 10

3 Anwendung im Versuch: Für die Fermentation kann handelsübliche Bäckerhefe, die in gepresster Form als Frischhefe angeboten wird oder ggfs. in Form einer Agar-Kultur-Platte, verwendet werden. 2 Material und Methoden Medium zur Kultivierung Das Fermentations-Medium enthält gemäß SOP_003_Komplexmedium die folgenden Bestandteile: - Hefeextrakt: 3g/l - Malzextrakt: 3g/l - Pepton: 5g/l - VE-Wasser: 1000ml Sterilisation: gemeinsam (mit dem Zucker bis max. 100 g/l) Bei der Berechnung der Einwaage ist ggfs. zu beachten, dass die Glucose als Monohydrat vorliegt! Das Volumen im Schüttelkolben wird je nach Versuchsplan und Schüttelkolbengröße angegeben (Normalerweise zwischen 100 und 250 ml) Die Zugabe der Glucoselösung und des Inokulums stellt also eine Verdünnung des Mediums dar, da davon ausgegangen wird, dass diese keine Medienbestandteile enthalten. Die Einwaagen, sowohl für das Fermentationsmedium, als auch für die Vorkultur, sind vor Beginn des Praktikums zu berechnen! 3 / 10

4 Herstellung des Mediums und der Vorkultur Die Bestandteile der Medien werden exakt, gemäß vorangegangener Berechnung, eingewogen und in Wasser gelöst. Es wird Medium für die Fermentation wie für die Vorkultur benötigt. Jede Gruppe stellt für die jeweils nachfolgende Gruppe das Fermentationsmedium sowie die Vorkultur her. Die Medien werden im Autoklaven thermisch sterilisiert. Die Beschickung und Bedienung des Autoklaven erfolgt, unter Beachtung der Anleitung am Gerät, ausschließlich im Beisein eines/r Betreuers/Betreuerin!. Das Anlegen der Vorkultur erfolgt unter der Sterilbank (s. a. Kapitel 4.2). Der Erlenmeyerkolben mit dem sterilisierten Medium wird unter der clean-bench geöffnet und mit Hilfe einer Impföse von einer Agarplatte (o.ä.) beimpft.(hier hätte ich noch einen Film!) Die Zugabe der sterilen Glucose erfolgt selbstverständlich ebenfalls unter der clean-bench. Der beimpfte Kolben wird in einem Schüttel-Inkubator, bei 30 C für ca. 20 h inkubiert, wobei darauf zu achten ist den Schüttelkolben nicht gasdicht zu verschließen. Bei der Verwendung von Schraubdeckeln, diese mit Klebeband fixieren. Das Medium und die Glucoselösung für die Fermentation werden zur späteren Verwendung in einer Kühlzelle gelagert. Hinweis: Es werden fertig sterilisierte Grundmedien bereitgestellt <<< 3 Schüttler / Schüttelkolben Es steht ein Orbitalschüttler der Firma Infors zur Verfügung (Abb. 1). Dieser sollte mit den vorhanden Schüttelkolben und Sensoren bis maximal 250 rpm genutzt werden. Höhere Drehzahlen können zu Beschädigung der Geräte und Kolben führen! Es stehen bis zu 6 Messplätze zur Verfügung. Hier können 3 x 500 ml Schüttelkolben als auch 3 x 1000 ml Kolben platziert und mit Messtechnik bestückt werden. Die Auswahl der Kolben, ob mit oder ohne Schikane, hängt dabei von den gewünschten Versuchsbedingungen ab. 4 / 10

5 Versuchsaufbau Auf dem Schüttler (Abb. 1) befindet sich eine Schüttelplatte für bis zu 6 Schüttelkolben. Die Schüttelkolben können jeweils mit einem CO2 und einem O2 Sensor bestückt werden, so dass online die entsprechenden Konzentrationen gemessen werden können. Die Sensoren sind wiederum an die BACCom12, einem elektronischen Multiplexer, angeschlossen. Dieser versorgt die Sensoren mit Spannung und leitet die aufgenommen Messwerte an die Software BACVis (alle Sensorsignale) oder FermVis (nur CO2 und O2 Signale) per RS232 oder Ethernetschnittstelle weiter. Weitere Einzelheiten entnehmen Sie bitte der Bedienungsanleitungen 3-10 (s. mitgeltende Dokumente). Vergleiche auch :SOP_002_Messen 5 / 10

6 Aufbau: A F B C G D E H Abb. 1 Gassensoren für CO2, O2 oder Ethanol F Sterile Begasungsöffnung (PTFE-Filter mit 0,22µm Poren) B Schüttelkolben G Klammerhorde zum Halten von Schüttelkolben C BACCom12 (Multiplexer) Datentransfer per TCP/IP zu PC H Einstellung eines Timers (wird nicht benötigt!) D Schüttelplatte E Einstellung der Drehzahl (max 250 rpm!!) 6 / 10

7 4 Abgasanalytik IR-Sensoren Die verwandten Kohlendioxid- (BCP-CO2) und Ethanol-Sensoren arbeiten mit Infrarotlicht (IR). Der Sensorkopf beinhaltet die IR Strahlungsquelle, den Detektor und die Auswertelektronik. Der Lichtstrahl durchstrahlt einen Messraum mit dem Analytgas und wird in dem Messadapter reflektiert. Ein Detektor misst die Intensität des reflektierten Lichts, welche von der jeweiligen Analytgaskonzentration abhängig ist. Der Sensorkopf beheizt den Messadapter, so dass keine Feuchtigkeit kondensieren kann. Das Messprinzip sowohl für Kohlendioxid als auch für Ethanol ist identisch, so dass die Sensoren mit dem entsprechenden Gas von Seiten des Herstellers kalibriert wurden. ZrO2-Sensoren Der Sauerstoff-Sensor (BCP-O2) basiert dagegen auf einer Sauerstoffpumpzelle und besteht aus dem Sensorkopf und dem Messadapter. Der Sensorkopf beinhaltet die Elektronik und den elektrischen Anschluss des Messadapters. Der Messadapter enthält das eigentliche Sensorelement aus Zirkoniumdioxid, welches auf eine Betriebstemperatur von 580 C aufgeheizt wird. Wird eine Spannung an die Zelle angelegt, werden Sauerstoffionen von der Kathode zur Anode gepumpt. Wird die Kathode zusätzlich mit einer Gas- Diffusionsbarriere abgedeckt, so stellt sich bei einer Erhöhung der Spannung ein Sättigungsstrom ein, welcher ein Maß für die Sauerstoffkonzentration ist. O 2 O 2 O 2- A 7 / 10

8 5 Versuchsdurchführung Fermentation von S. cerevisiae Die Hefe wird im Batch-Verfahren kultiviert. Dies erfordert Herstellung eines Fermentationsmediums sowie die Vorbereitung des Schüttelkolbens. Anschließend wird die Fermentation, durchgeführt. Stellen Sie die Betriebsparameter der durchzuführenden Fermentation ein: Wahl des Schüttelkolbens: 1000 ml mit und ohne Schikanen, 500ml mit und ohne Schikanen Füllhöhe im Schüttelkolben: max. 250 ml (nur 1000 ml-kolbern) / max. 100 ml im 500 ml-kolben Einwaage der Hefe: Schüttlerdrehzahl [U min-1] (max 250 prm) 5.1 Vorbereitung des Versuchsaufbaus - Sensoren an BACCom12 anschließen und diese an Spannung anschließen, denn Sensoren benötigen 1 Stunde Aufwärmzeit. - Schüttelkolben mit Medium füllen und nach Anleitung im Autoklaven sterilisieren. Software (BACVis oder FermVis) starten. 8 / 10

9 5.2 Start der Fermentation Nachdem Abkühlen des Kolbens diesen mit Hefe unter der Clean-bench animpfen. Schüttelkolben zum Schüttler bringen und dort schnellstmöglich die Sensoren ankoppeln (siehe MD_015_sterile_Verwendung_von Schüttelkolben_und_Abgasanalytik). Schüttelfrequenz einstellen (max. 250 prm) und Kultivierung laufen lassen. 5.3 Ende der Fermentation Nach Beendigung der Fermentation (Zeit oder Substrat ist alle) sind die Sensoren zu entfernen und der der Schüttelkolbeninhalt in eine vorbereitete geeignete, Flasche (o.ä,) zu entleeren, die später ggfs. autoklaviert wird um alle MOs (Mikroorganismen) thermisch zu inaktivieren. Nach der vollständigen Entleerung, den Schüttelkolben so oft mit VE-Wasser zu spülen bis keine Spuren von Medium oder Schaum mehr sichtbar sind. 6 Aufgabenstellung und Diskussion am Versuchstag: Fermentation starten, incl. Mess-Software die Werte der Messungen der Abgasmessung grafisch in z.b. Excel darstellen und Prozessparameter berechnen. Reinigen des benutzten Equipments und Aufräumen der Arbeitsplätze Es besteht die Möglichkeit Betriebs-Parameter zu verändern, so dass mit Hilfe bestehender Vorkenntnisse Ideen entwickelt werden können, welche Änderung einer Stellgröße, zu einer Reaktion des Systems führt und in welcher Weise sich diese Änderung auf den Versuch auswirkt. Die Änderungen müssen sorgfältig dokumentiert werden. 9 / 10

10 Auswertung: Als Ergebnis können sowohl die Konzentration des entstehenden CO2s und Ethanols und der Verbrauch von Sauerstoff online gemessen werden. Somit kann mit Kenntnis der Diffusionskonstante die Sauerstoffverbrauchsrate (Oxygen transfer rate OTR), die Kohlendioxidbildungsrate (carbon dioxide production rate CPR) und der Respirationsquotient (RQ) berechnet werden. (Siehe SOP_OTR_CPR_RQ_Berechnung.) 10 / 10