5 Ergebnisse und Diskussion

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1 5 Ergebnisse und Diskussion 5.1 Etablierung einer Trichobilharzia spezifischen npcr Sequenzierung der 18s rdna von T. ocellata Die Sequenzierung der 18s rdna von T. ocellata (s. Kap ) lieferte die DNA-Sequenz für ein 1982 bp langes DNA-Fragment (s. Anh., S. 138). LOCKYER et al. (2003) veröffentlichten nachfolgend 18s rdna Sequenzen verschiedener Trichobilharzia-Arten, u.a. auch von T. ocellata, die er von der Arbeitsgruppe von Prof. Haas (Universität Erlangen) erhielt. Der Vergleich der beiden Sequenzen ergibt erwartungsgemäß ein hohes Maß an Übereinstimmung. Die von LOCKYER et al. (2003) gefundene 1870 bp lange DNA-Sequenz weicht lediglich für vier Basen (0,2%) von der hier gefunden entsprechenden Sequenz ab. Die Sequenzen sind somit zu 99,8 % identisch. Die erhaltene rdna-sequenz von T. ocellata kann daher als hinreichend gesichert angesehen werden, um eine auf ihr basierende npcr zuzulassen. Zur Verdeutlichung befindet sich im Anhang (S. 138) ein Alignment der beiden für T. ocellata gefundenen 18s rdna-sequenzen. Generell zeichnen sich jedoch nach JOHNSTON et al. (1993) Schistosomatidae durch eine hohe Homologie ihrer 18s rdna Sequenzen aus. So sind die Sequenzen von S. haematobium und S. mansoni zu 98,8 % identisch. Dies wird auch durch die vorliegende Arbeit bestätigt, da die für T. ocellata ermittelte 18s rdna Sequenz mit der durch LOCKYER et al. (2003) für T. regenti gefundenen Sequenz sogar zu 99,5% identisch ist (vgl. Kap ). Dennoch lassen sich die beiden Arten durch ihre unterschiedliche Biologie klar als eigene Arten abgrenzen (HORAK et al., 2003). An dieser Stelle wird die mögliche Schwierigkeit einer molekularbiologischen, auf DNA-Sequenzen beruhenden Artabgrenzung deutlich. Aufgrund der Unterschiede der 18s rdna von T. regenti und T. ocellata wäre nicht unbedingt von eigenständigen Arten auszugehen gewesen. So weichen die von LOCKYER et al. (2003) gefunden Sequenzen für T. ocellata und T. regenti beide nur geringfügig von der in dieser Arbeit ermittelten Sequenz für T. ocellata ab. Nach JOHNSTON et al. (1993) müssen demnach für eine Artabgrenzung innerhalb der Schistosomatidae weitere Gensequenzen als die der 18s rdna herangezogen werden Fragmentlängen der Trichobilharzia npcr Nach Amplifikation der T. ocellata DNA konnten für beide Primerpaare die vorhergesagten Fragmentlängen nachgewiesen werden. Die Amplifikation mit Hilfe des äußeren Primerpaares Toc1/Toc2 ergab ein Fragment der Länge 1653 bp. Die Länge des Amplikons für das innere Primerpaar Toc3/Toc4 betrug 816 bp (s. Abb. 5.1). Die PCR der ersten Runde weist 56

2 schwache zusätzliche Banden bei ca. 500 bp und 680 bp auf. Diese Banden werden als unspezifisch angesehen, da sie aufgrund der eingesetzten Primerpaare nicht vorhersagbar waren. Gleiches gilt für zusätzliche Banden der 2. Runde bei ungefähr 250 bp, 520 bp, 1000 bp und weniger prominent bei ungefähr 1250 bp, 1400 bp, 1650 bp und 2600 bp. Die Herkunft dieser Banden beruht vermutlich auf unspezifischen Annealingvorgängen der Primer oder DNA Bruchstücken. Für die Analyse einer Probe sind sie ohne Bedeutung, da sie nur in Zusammenhang mit dem jeweiligen Zielfragment auftreten und zumeist deutlich schwächer ausgebildet sind. Abb. 5.1: Agarose-Gelelektrophorese von Produkten der Trichobilharzia npcr. 4 Spuren. Von links nach rechts: Spur 1: DNA Längenmarker (GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus, Fragmentlängen links stehend) Spur 2: 1653 bp Produkt (Primer Toc1/Toc2) Spur 3: 816 bp Produkt (Primer Toc3/Toc4) Spur 4: keine DNA / Kontrolle Bestimmung der Nachweisgrenze der Trichobilharzia npcr Die Bestimmung der Nachweisgrenze erfolgte wie in Kap beschrieben. Abb. 5.2 zeigt das Ergebnis des durchgeführten Sensitivitätstests für das äußere Primerpaar Toc1/Toc2. Die Nachweisgrenze wurde für das Primerpaar Toc1/Toc2 mit 10 pg T. ocellata DNA ermittelt. Geringere DNA Konzentrationen konnten durch den alleinigen Einsatz des äußeren Primerpaares nicht nachgewiesen werden. HANELT et al. (1997) stellten bei ihrer npcr zum spezifischen Nachweis von S. mansoni eine identische Nachweisgrenze von 10 pg DNA für das äußere Primerpaar fest. 57

3 Abb. 5.2: Agarose-Gelelektrophorese zur Bestimmung der Nachweisgrenze der Primer Toc1 und Toc2 bei Anwesenheit von 100 ng L. stagnalis DNA. 11 Spuren. Von links nach rechts: Spur 1: DNA Längenmarker (GeneRulerTM 100 Spur 2: Spur 3: Spur 4: Spur 5: Spur 6: Spur 7: Spur 8: Spur 9: bp DNA Ladder Plus, Fragmentlängen links stehend) 10 ng T. ocellata DNA 1 ng T. ocellata DNA 100 pg T. ocellata DNA 10 pg T. ocellata DNA 1 pg T. ocellata DNA 100 fg T. ocellata DNA 10 fg T. ocellata DNA 1 fg T. ocellata DNA Spur 10: 100 ag T. ocellata DNA Spur 11: keine DNA / Kontrolle Abb. 5.3: Agarose-Gelelektrophorese zur Bestimmung der Nachweisgrenze der npcr mit den Primerpaaren Toc1/Toc2 und Toc3/Toc4 bei Anwesenheit von 100 ng L. stagnalis DNA. 11 Spuren. Von links nach rechts: Spur 1: DNA Längenmarker (GeneRulerTM 100 Spur 2: Spur 3: Spur 4: Spur 5: Spur 6: Spur 7: Spur 8: Spur 9: bp DNA Ladder Plus, Fragmentlängen links stehend) 10 ng T. ocellata DNA 1 ng T. ocellata DNA 100 pg T. ocellata DNA 10 pg T. ocellata DNA 1 pg T. ocellata DNA 100 fg T. ocellata DNA 10 fg T. ocellata DNA 1 fg T. ocellata DNA Spur 10: 100 ag T. ocellata DNA Spur 11: keine DNA / Kontrolle Die Nachweisgrenze der npcr unter Verwendung beider Primerpaare liegt, wie aus Abb. 5.3 ersichtlich, bei 1 fg T. ocellata DNA. Damit zeigt sich die hohe Sensitivität dieser Methode im Vergleich zu anderen Methoden. So liegt die Nachweisgrenze einer von HERTEL et al. (2002) veröffentlichten PCR, die spezifisch für eine 396 bp große repetitive DNA-Sequenz von T. ocellata ist, bei 100 fg. Eine Hybridisierung auf das gleiche Fragment zeigte eine 58

4 Nachweisgrenze von 100 pg. Auch die von HANELT et al. (1997) entwickelte npcr zum Nachweis von S. mansoni zeigt, obwohl im Prinzip der hier dargestellten npcr gleich, eine geringere Nachweisgrenze von 10 fg. Vermutlich ist der Grund für diesen Unterschied in der seit dem Jahr 1997 fortgeschrittenen Technik zu suchen. Neben der Ermittlung der Nachweisgrenze der verwendeten Primer durch Variierung bekannter DNA-Mengen (s.o.) wurden zusätzlich die Nachweisgrenzen der Detektion von T. ocellata in Proben mit hohem Anteil von Plankton bzw. Schneckengewebe evaluiert, um die Verlässlichkeit der gewonnenen Daten abschätzen zu können. a) Die Detektion von Cercarien in Planktonproben Die Ermittlung der Nachweisgrenze für Planktonproben wurde wie in Kap beschrieben durchgeführt. Es zeigt sich, dass mit Hilfe der angewandten Methodik einzelne Cercarien in 0,75 g Plankton nachgewiesen werden können. Abb. 5.4 macht dabei deutlich, dass die 1. PCR-Runde nicht ausreicht, um DNA über der Nachweisgrenze zu amplifizieren. Erst durch die 2. PCR-Runde wird ausreichend DNA amplifiziert und eine gelelektrophoretische Erkennung ermöglicht. Dies ist erstaunlich, da zumindest für die Probe mit 50 zugesetzten Cercarien aufgrund der Menge an Cercarien auch nach der ersten PCR-Runde eine deutliche Bande erwartet wurde. Auch bei wiederholter Durchführung des Versuchs konnte aber in keinem Fall eine Bande nach der ersten PCR-Runde festgestellt werden. Die Gründe für das Ausbleiben der Bande können vielfältig sein. Möglich erscheint eine durch die Menge an Plankton eingebrachte Kontamination mit PCR-hemmenden Stoffen. Zwar wurde durch Verwendung von CTAB (s. Kap ) versucht, diese Stoffe zu extrahieren, möglicherweise ist aber die Anwendung anderer Methoden der DNA-Isolierung besser geeignet. So erzielte SPRINGORUM (2004) gute Ergebnisse beim Nachweis von T. ocellata aus Kotproben 9 von Wassergeflügel unter Verwendung des QIAamp DNA Stool Mini Kits (Quiagen). Eine dahingehende Veränderung der Methode der DNA-Isolierung könnte mitunter eine weitere Erhöhung der Zuverlässigkeit bewirken. HERTEL et al. (2002) verfolgten ebenfalls die Idee eines Nachweises von Cercarien von T. ocellata in Planktonproben. Sie geben mit 1 Cercarie pro 0,5 g eine vergleichbare Nachweisgrenze an, obwohl sie eine einfache PCR durchführten. Allerdings liegt der amplifizierte DNA-Abschnitt bei dieser PCR in hoher Kopienzahl (ca Kopien) in der DNA von T. ocellata vor. Möglicherweise beeinflusst aber auch die Methode der DNA-Isolierung, die auf einer Verdauung der Proben mit NH 3 beruht (GREVELDING et al., 1997), die Amplifikation der isolierten DNA. 9 Kotproben sind allgemein reich an PCR-hemmenden Stoffen, wie z.b. Abbauprodukten des Hämoglobins (z.b. Bilirubin), Gallensalzen und Huminstoffen (WEYANT et al. 1990, TSAI & OLSON, 1992, WIDJOJOATMODJO et al., 1992). 59

5 Abb. 5.4: Agarose-Gelelektrophorese. Bestimmung der Nachweisgrenze der Methode zum Nachweis von T. ocellata aus Planktonproben. 16 Spuren. Die Spuren 2 bis 8 zeigen PCR-Produkte der 1. PCR-Runde, die Spuren 9 bis 15 PCR- Von links nach rechts: Produkte der 2. PCR-Runde. Spur 1: DNA Längenmarker (GeneRulerTM Spur 8: Plankton ohne Cercarien 100 bp DNA Ladder Plus, Fragment- Spur 9: Plankton mit 50 Cercarien längen links stehend) Spur 2: Plankton mit 50 Cercarien Spur 3: Plankton mit 10 Cercarien Spur 4: Plankton mit 5 Cercarien Spur 5: Plankton mit 1 Cercarie Spur 6: Plankton mit 1 Cercarie Spur 7: Plankton mit 1 Cercarie Spur 10: Plankton mit 10 Cercarien Spur 11: Plankton mit 5 Cercarien Spur 12: Plankton mit 1 Cercarie Spur 13: Plankton mit 1 Cercarie Spur 14: Plankton mit 1 Cercarie Spur 15: Plankton ohne Cercarien Spur 16: keine DNA / Kontrolle b) Die Detektion von Cercarien in Schneckengewebe-Proben Die Ermittlung der Nachweisgrenze für T. ocellata in Schneckengewebe-Proben wurde wie in Kap beschrieben durchgeführt. Mit der verwendeten Methode der DNA-Isolierung ließ sich, wie aus den Abb. 5.5 und 5.6 ersichtlich, eine Cercarie in ca. 2,0 g Schneckengewebe nachweisen. Entsprechend der Ermittlung der Nachweisgrenze von T. ocellata in Planktonproben (s.o.) fand durch die erste PCR-Runde auch hier keine DNA-Vervielfältigung über die Nachweisgrenze statt. Mittels der 2. PCR-Runde wurde dann aber in allen Proben T. ocellata DNA nachgewiesen. Aus diesem Ergebnis lässt sich schlussfolgern, dass 60

6 T. ocellata zuverlässig in Gewebeproben von L. stagnalis nachgewiesen werden kann. Allerdings bleibt aufgrund des durchgeführten Tests eine Unsicherheit bezüglich frischer Infektionen von L. stagnalis. Ein gerade eingedrungenes Miracidium von T. ocellata ist ca. viermal kleiner als das zum Test benutzte Larvalstadium der Cercarie, so dass ein Fehlschlagen des Nachweises aufgrund der vermutlich geringeren DNA-Menge theoretisch möglich erscheint. Allerdings liegt die Nachweisgrenze der Trichobilharzia npcr, wie oben gezeigt wurde, bei 1 fg DNA, was den Nachweis auch eines Miracidiums bzw. einer Muttersporocyste wahrscheinlich macht. Nach NEUHAUS (1952) setzt ca. einen Tag nach Infektion die Weiterentwicklung des eingedrungenen Miracidiums zur Muttersporocyste ein, zunächst jedoch ohne nennenswerten Größenzuwachs. Nach 20 Tagen wiesen die Muttersporocysten eine Durchschnittsgröße auf, die ungefähr halb so groß war wie die einer Cercarie, nach 45 Tagen war ihre Körpergröße ca. doppelt so groß. Ein sicherer Nachweis von Infektionen sollte folglich nach spätestens 45 Tagen, vermutlich aber deutlich früher möglich sein. Klärung würde ein Versuchsansatz bringen, der L. stagnalis sofort nach erfolgter Infektion von T. ocellata mit der Trichobilharzia npcr nachweist. Dieser Ansatz konnte leider nicht durchgeführt werden, da der Zyklus des Parasiten noch nicht bei uns im Labor gehalten werden kann, eine Voraussetzung für das Isolieren von Miracidien. Entsprechende Versuche der Haltung von T. ocellata in A. platyrhynchos und L. stagnalis schlugen bisher fehl (SPRINGORUM, 2004). Abb. 5.5: Agarose-Gelelektrophorese. Bestimmung der Nachweisgrenze der Detektion von T. ocellata in Schneckengewebe. 1. PCR- Runde. 10 Spuren. Von links nach rechts: Spur 1: DNA Längenmarker (GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus, Fragmentlängen links stehend) Spur 2: T. ocellata- DNA / Kontrolle Spur 3: L. stagnalis- DNA / Kontrolle Spur 4: L. stagnalis mit 50 Cercarien von T. ocellata Spur 5: L. stagnalis mit 25 Cercarien von T. ocellata Spur 6: L. stagnalis mit 10 Cercarien von T. ocellata Spur 7: L. stagnalis mit 5 Cercarien von T. ocellata Spur 8: L. stagnalis mit 3 Cercarien von T. ocellata Spur 9: L. stagnalis mit 1 Cercarie von T. ocellata Spur 10: keine DNA / Kontrolle 61

7 Abb. 5.6: Agarose-Gelelektrophorese. Bestimmung der Nachweisgrenze der Detektion von T. ocellata in Schneckengewebe. 2. PCR- Runde. 10 Spuren. Von links nach rechts: Spur 1: DNA Längenmarker (GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus, Fragmentlängen links stehend) Spur 2: T. ocellata-dna / Kontrolle Spur 3: L. stagnalis -DNA / Kontrolle Spur 4: L. stagnalis mit 50 Cercarien von T. ocellata Spur 5: L. stagnalis mit 25 Cercarien von T. ocellata Spur 6: L. stagnalis mit 10 Cercarien von T. ocellata Spur 7: L. stagnalis mit 5 Cercarien von T. ocellata Spur 8: L. stagnalis mit 3 Cercarien von T. ocellata Spur 9: L. stagnalis mit 1 Cercarie von T. ocellata Spur 10: keine DNA / Kontrolle Nachweis der Spezifität der Trichobilharzia npcr Der Nachweis der Spezifität der Trichobilharzia npcr wurde wie in Kap beschrieben durchgeführt. Dargestellt ist lediglich die Agarosegelelektrophorese der 2. PCR-Runde, da die 1. PCR-Runde ein entsprechendes Bandenmuster bei 1653 bp zeigte. Abb. 5.7 zeigt, dass ausschließlich Vertreter der Gattung Trichobilharzia mit ihren Arten T. ocellata und T. franki von der Trichobilharzia npcr nachgewiesen wurden. Bei allen anderen Trematoden sowie bei Gewebe von L. stagnalis und einer T. ocellata freien Planktonprobe fand keine nachweisbare Amplifikation der DNA statt. Die hohe Spezifität der entwickelten npcr wird auch dadurch angezeigt, dass sie für phylogenetisch nah stehende Organismen wie S. mansoni und insbesondere B. polonica negativ ausfiel. Für S. mansoni verwundert dies nicht, da, wie in Kap beschrieben, die Primer in Regionen gesucht wurden, die sich durch eine stark abweichende Basensequenz auszeichnete. Der Arbeit von LOCKYER et al. (2003) ist es zu verdanken, dass mittlerweile auch Teilsequenzen der 18s rdna von T. ocellata nah stehenden Trematoden bekannt sind. Unter anderem liegen Sequenzen für T. regenti, T. szidati und B. polonica vor, wobei T. szidati als 62

8 Abb. 5.7: Agarose-Gelelektrophorese. Spezifitätsnachweis der Trichobilharzia npcr. 16 Spuren. Von links nach rechts: Spur 1: DNA Längenmarker (GeneRulerTM Spur 9: P. echinatum 100 bp DNA Ladder Plus, Fragment- Spur 10: O. ranae längen links stehend) Spur 11: Plagiorchis sp. Spur 2: T. ocellata Spur 12: Astiotrema sp. Spur 3: T. franki Spur 13: O. nigrivasis Spur 4: B. polonica Spur 14: Haematoloechus sp. Spur 5: S. mansoni Spur 15: L. stagnalis Spur 6: Diplostomum sp. Spur 16: Plankton Spur 7: E. revolutum Spur 8: H. conoidum Synonym für T. ocellata aufgefasst wird 10. Führt man ein Alignment der genannten Sequenzen mit der in dieser Arbeit gefunden 18s rdna Sequenz durch, so zeigt sich für T. regenti eine Übereinstimmung der Sequenzen von 99,8 %. Ungünstigerweise bindet der Primer Toc3 in einem Bereich der Sequenz, der 5 der insgesamt 9 Nukleotidsubstitutionen zwischen den beiden Sequenzen aufweist (s. Abb. 5.8). Die DNA-Abschnitte der Primer Toc1, Toc2 und Toc4 stimmen hingegen vollständig überein. Durch Modifikation des Primers Toc3 ließe sich ein npcr entwickeln, die auch den Nachweis von T. regenti einschließt und somit die nach KOLAROVA et al. (1997) wichtigsten Dermatitis erregenden Trichobilharzia Arten (T. ocellata, T. franki, T. regenti) hiesiger Breiten umfasst. Ein entsprechender Primer (Toc3plus) 10 Die 18s rdna Sequenz von T. szidati (LOCKYER et al., 2003) ist dahingehend interessant, dass die 1867 bp lange Sequenz zu 99,9% identisch mit der in dieser Arbeit gefunden Sequenz von T. ocellata ist. Dies unterstützt die gut begründete Ansicht von ODENING (1996), KOCK (2001) und LOY & HAAS (2001), die T. szidati Neuhaus 1952 als Synonym für T. ocellata (La Valette 1855) Brumpt 1931 auffassen. Wie in Kap dargestellt, bleibt eine Artbestimmung allein anhand der 18s rdna Sequenz für die Gattung Trichobilharzia aber zweifelhaft. 63

9 wurde mit Hilfe des PC-Programms Primer 3 (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge) gesucht. Er wurde so gewählt, dass er trotz Übereinstimmung zur Basensequenz der genannten Trichobilharzia-Arten hinreichend unterschiedlich zu den nächsten hier getesteten Verwandten B. polonica und S. mansoni ist. Der Primer Toc3 konnte in der Trichobilharzia npcr durch den Primer Toc3plus ersetzt werden, ohne dass erkennbare Unterschiede in Sensitivität oder Spezifität der npcr auftraten. Toc3 Toc3plus T. ocellata 5 GTGCTGACGGAGATGGGTGAGCTTGTATCGCCCGCTATCTGTTGGCATGCTTCCGGA 3 T. regenti 5 GTGCTGACGGAGATGGGTGAGTTCTTCTTGCCCGCTATCTGTTGGCATGCTTCCGGA 3 ********************* * * * **************************** Abb. 5.8: Ausschnitt der 18s rdna von T. ocellata und T. regenti mit Lage der Primer Toc3 (gelb) und Toc3plus (rot). Die Sterne geben identische Basen der beiden DNA-Sequenzen an. Ein Test, ob mit Hilfe dieses Primers T. regenti tatsächlich nachgewiesen werden kann, wurde bis zum jetzigen Zeitpunkt in Ermangelung des Parasiten nicht durchgeführt. Ob die Trichobilharzia npcr alle der ca. 40 bekannten Trichobilharzia-Arten nachweisen kann und in wie weit ein Artabgrenzung durch entsprechend gewählte Primer möglich ist, müssen weitere Untersuchungen ergeben. Wahrscheinlich ist aber, dass eine Artabgrenzung aller Trichobilharzia-Arten allein aufgrund der 18s rdna Sequenzen nicht realisierbar ist. Als nächste Verwandte der Gattung Trichobilharzia gilt die Gattung Bilharziella (LOCKYER et al., 2003) mit der in Mitteleuropa weit verbreiteten Art B. polonica (BUSA, 1962, BIROVA et al., 1989). Diese Art nutzt den gleichen Endwirt wie T. ocellata und besiedelt ähnlich wie diese Art ebenfalls die visceralen Venen mit Schwerpunkt der Mesenterialvenen. Untersuchungen zur Parasitenfauna von Wildenten konnten zeigen, dass B. polonica mit einer Prävalenz von bis zu 46% (KULISIC & LEPOJEV, 1994) deutlich häufiger in den Enten anzutreffen ist als T. ocellata (SPAKULOVA et al., 1989, KOLAROVA et al., 1997). Dies konnte auch durch die Untersuchung von zwölf Wildenten aus dem Raum Extertal bestätigt werden: in 3 Fällen waren die Tiere mit B. polonica infiziert (25 %), während in keiner der Enten T. ocellata nachgewiesen werden konnte. Eine sichere Unterscheidung von diesem Parasiten durch die npcr ist demnach von besonderer Bedeutung, da es sich um einen häufigen Parasiten handelt, dessen Cercarien nicht in der Lage sind, in die Haut des Menschen einzudringen und somit keine Dermatitis hervorrufen (ZBIKOWSKA, 2003). Die 18s rdna Sequenz von B. polonica (LOCKYER et al., 2003) zeigt eine große Übereinstimmung mit der entsprechenden Sequenz von T. ocellata, die aber mit 97,9 % geringer als innerhalb der Gattung Trichobilharzia ausfällt. Der Vergleich der Sequenzen in Bezug auf die Lage der Primer zeigt (s. Anh. S. 144), dass bei Primer Toc1 zwei von 24 Basen unter- 64

10 schiedlich sind, während Toc2 keine Unterschiede aufweist. Primer Toc3 weist 4 von 20 unterschiedliche Basen auf, Toc4 eine Base von 18. Demnach bindet Primer Toc2 im gleichen Maße an die DNA von B. polonica, ist also nicht T. ocellata spezifisch. Aufgrund der Ähnlichkeit der Sequenzen besteht für die Primer Toc4 und Toc1 ebenfalls die Möglichkeit vereinzelter Annealings an das Template, die mit zunehmender Konzentration an Template DNA ansteigt. Obwohl der Spezifitätstest keinen positiven Nachweis für B. polonica erbringt, da zumindest ein Primer des jeweiligen Primerpaares nicht an die DNA bindet, könnten bei hohen DNA Konzentrationen eventuell falsch positive Ergebnisse für T. ocellata ermittelt werden. Eine dahingehende Verbesserung der Primer (insbesondere des Primers Toc2) sollte dabei zu einer sichereren Abgrenzung von B. polonica führen. In der Praxis stellt sich das Problem von falsch positiven Proben durch eine Kontamination mit B. polonica in der Regel nicht. Grund hierfür sind zunächst die im Allgemeinen niedrigen DNA Konzentrationen. Weiterhin ist die Biologie von B. polonica deutlich abweichend (SZIDAT, 1929). So ist als Wirtsschnecke ausschließlich P. corneus (Planorbidae) bekannt, während Trichobilharzia Arten Lymnaeidae als Zwischenwirte nutzen. Bei einer Untersuchung der Zwischenwirte ist eine Verwechslung daher auszuschließen. Auch das Auftreten der Cercarien im Gewässer ist unterschiedlich. Während die Gattung Trichobilharzia verstärkt um die Mittagsstunden im Gewässer auftreten, verlassen die Cercarien von B. polonica bei Dunkelheit ihren Zwischenwirt. Sie schwimmen dann zur Oberfläche und sondern aus Drüsen ein schleimiges Sekret ab. In den so gebildeten Schleimflößen umher kriechend warten sie, bis sich das Floß im Gefieder eine Vogels verfängt. Über den Federschaft gelangen die Cercarien dann zur Haut des Vogels und dringen in ihn ein. Bei der Entnahme von Planktonproben besteht also zur Mittagszeit ein geringes Risiko, Cercarien von B. polonica aufzunehmen, da sie nicht frei im Wasserkörper schwimmend vorkommen und nur in der Dunkelheit ihren Zwischenwirt verlassen. Vorsicht sollte allerdings geboten sein, wenn bspw. Mesenterialgewebe auf den Befall mit T. ocellata untersucht werden soll. Aufgrund der hohen Prävalenz von B. polonica und der zum Teil hohen Individuenanzahl erscheinen hier falsch positive Nachweise als möglich. Für alle anderen untersuchten Trematoden sind bisher keine 18s rdna Sequenzen bekannt, so dass ein Vergleich mit T. ocellata entfällt. Da aber alle getesteten Arten phylogenetisch weiter von T. ocellata entfernt sind als B. polonica und S. mansoni (CAMPOS et al., 1998, LITTLEWOOD et al., 1999), ist nicht von einer ähnlich gearteten Übereinstimmung der Sequenzen wie innerhalb der Schistosomatidae auszugehen. 65

11 5.2 Vergleich verschiedener Methoden der Erfassung von Infektionsraten: Cercarienschlupftest, Sektion, npcr Vergleich der Methoden Cercarienschlupftest und Sektion bei Ermittlung von Infektionsraten von L. stagnalis in Tümpel J2 Die tabellarische Darstellung der ermittelten Daten ist im Anhang (S. 146) aufgeführt. Abb. 5.9: Vergleich der durch Cercarienschlupftest und Sektion gewonnenen Infektionsraten von L. stagnalis in den Jahren 2001 und Betrachtet wurde die Gesamtinfektionsrate von L. stagnalis ohne auf einzelne Trematodenarten einzugehen. Es zeigt sich, dass Cercarienschlupftest und Sektion zum Teil zu erheblich divergierenden Ergebnissen bezüglich der Infektionsrate kommen. Dahingehend bestätigt die Untersuchung eine Beobachtung von CURTIS & HUBBARD (1990). Allerdings zeigen die Ergebnisse in Abb. 5.9 auch, dass innerhalb beider Jahre eine Annährung der beiden Infektionsraten zu verzeichnen ist. So ist im Jahr 2001 bis zum Monat Juni ein deutlicher Unterschied festzustellen, im Jahr 2002 bis zum Monat Juli. Mittels des Cercarienschlupftests werden dabei im günstigsten Fall ca. 67 % der Infektionen angezeigt, die durch eine Sektion ermittelt werden konnten. Ungefähr ein Drittel der Infektionen würde bei alleiniger Anwendung des Cercarienschlupftests also unentdeckt bleiben. Ab den Monaten Juli 2001 und August 2002 wird der Anteil nicht entdeckter Infektionen durch den Cercarienschlupftest dann deutlich geringer. So werden im Juli 2001 bereits 83,5 % der durch Sektion ermittelten Infektionen festgestellt, im August 2002 sind es 91,8 %. Im Oktober des Jahres 2002 ist dann kein 66

12 Unterschied mehr zwischen den beiden Methoden festzustellen, allerdings wurden in diesem Monat nur eine geringe Anzahl von Schnecken (n = 15) untersucht. Der größte Unterschied der Infektionsraten wurde in beiden Jahren für den Monat April nachgewiesen. In diesem Monat konnten keine Infektionen durch einen Cercarienschlupftest nachgewiesen werden, per Sektion wurden aber Raten von 41,7 % bzw. 30,4 % diagnostiziert. Diese hohe Divergenz zwischen den beiden verglichenen Methoden erklärt sich durch das generell beobachtete Verhalten der Trematoden in L. stagnalis, während der Winterpause keine Cercarien zu produzieren. Zwei L. stagnalis (Schnecken Nr. 242 und 244, s. Anh., S. 162), die im Vorjahr patente Infektionen aufwiesen, zeigten bei den ersten Wiederfunden im Jahr keine Cercarienabgabe. Ab Mitte Mai hatte die Cercarienabgabe aber erneut eingesetzt. Da sie bereits nach 2 bzw. 4 Wochen erneut eingesammelt wurden und Cercarienausstoß aufwiesen, kann eine Neuinfektion nicht der Grund für die erneute Cercarienproduktion sein. Zumal bei den in diesen Monaten noch recht kühlen Wassertemperaturen die Entwicklung der Sporocysten vermutlich deutlich länger in Anspruch nimmt als die in Kap erwähnten acht Wochen. Wahrscheinlich ist hingegen ein Pausieren der Cercarienproduktion. Zum Nachweis des Phänomens wurden Ende 2002 dreißig mit Trematoden infizierte L. stagnalis aus Tümpel J2 entnommen und den Winter über bei 4 C und permanenter Dunkelheit in 10 l Aquarien in Gruppen zu je zehn Schnecken gehalten. Als Futter wurde Salat im Überschuss gereicht. Es zeigte sich, dass alle Trematoden ihre Cercarienproduktion nach 3 Wochen eingestellt hatten. Es scheint sich dabei um eine generell von Trematoden gezeigte Anpassung zu handeln, da dieses Verhalten von allen Trematoden (T. ocellata, O. ranae, P. echinatum, H. conoidum) gezeigt wurde. Die Cercarienproduktion setzte erst nach zweiwöchiger Haltung bei Zimmertemperatur wieder ein. Von dreißig Versuchstieren starben unter den genannten Bedingungen lediglich zwei Tiere. Eine Cercarienproduktion während der Wintermonate wäre unökonomisch, da eine erfolgreiche Infektion von Endwirten oder 2. Zwischenwirten i.d.r. nicht erfolgen kann. Der Parasit scheint seine Cercarienproduktion daher zu unterbrechen. Dies ist auch im Sinne der Stoffwechselleistung der Schnecke von Vorteil, deren Metabolismus dadurch nicht zusätzlich beansprucht wird, was im Extremfall den Tod des Zwischenwirtes zur Folge haben könnte. Zwar konnte im Labor festgestellt werden, dass L. stagnalis bei 4 C (wie sie in den tieferen Regionen des Gewässers herrschen) noch Nahrung in beträchtlichem Maße zu sich nimmt, jedoch dürfte der Stoffwechsel aufgrund der niedrigen Temperatur deutlich reduziert sein. Auch die im Frühjahr festzustellenden äußerst fragilen Gehäusezuwächse deuten darauf hin. Auf die erstaunliche Fähigkeit trematodischer Parasiten, ihre Cercarienproduktion an die Stoffwechselleistung ihrer Zwischenwirte anzupassen, soll nachfolgend kurz eingegangen werden. DE JONG-BRINK (1995) fasst zusammen, wie T. ocellata in den Metabolismus von L. stagnalis eingreift, um Metabolite für sein Wachstum bereitzustellen (s. Kap. 5.6). Keine Erwähnung findet allerdings, wie der Parasit gewährleistet, dass er nur den von der Schnecke produzierten Überschuss für sich nutzt. Dies wäre im Sinne einer möglichst langen Parasit-Wirt-Beziehung von Vorteil, wodurch T. ocellata seinen Reproduktionserfolg optimieren könnte. Während einer Überwinterung lässt sich der reduzierte Energie- 67

13 bedarf des Parasiten noch mit den niedrigen vorherrschenden Temperaturen erklären, aber auch während der Sommermonate muss der Parasit die Möglichkeit besitzen, seinen Energiebedarf auf den Metabolismus der Schnecke abzustimmen. Ansonsten würde die massenhafte Produktion von Cercarien schnell zum Tod der Schnecke führen, was für einen Parasiten, der in einem isolierten Gewässer sitzt, das nur gelegentlich von potentiellen Endwirten aufgesucht wird, ein entscheidender Selektionsnachteil wäre. Tatsächlich konnte aber festgestellt werden, dass infizierte Schnecken gleich lang oder sogar länger leben als ihre nicht infizierten Artgenossen (s. Kap. 5.6). Dies impliziert entsprechende Mechanismen des Parasiten, sich an die jeweilige Stoffwechselsituation seines Wirtes zu adaptieren. Wie schon in Kap erwähnt, wurde weiterhin für das Parasit-Wirt-System S. mansoni / B. glabrata eine Unterbrechung des Cercarienausstoßes des Parasiten bei für die Schnecke ungünstigen Lebensbedingungen beobachtet. Beides deutet daraufhin, dass eine Abstimmung der Stoffwechselleistung von Parasit und Zwischenwirt erfolgt. Da die Sektion der Schnecken auch ruhende Infektionen sprechend weit entwickelt sind, zeigt sich hier ein klarer Vorteil dieser Methode. nachweisen kann, wenn sie ent- Die im Jahresverlauf auftretende Angleichung der Aussagekraft von Cercarienschlupftest und Sektion lässt sich dahingehend erklären, dass während des Sommers eine zunehmende Reifung der Infektionen bis zu ihrer Patenz hin auftritt. Da die Hauptreproduktionsphase von L. stagnalis im Mai liegt, stehen in den darauf folgenden Wochen eine hohe Anzahl infizierbarer Jungschnecken (s. Kap. 5.8) zur Verfügung. Nach Infektion dauert es dann mehrere Wochen bis zur Patenz. In der Zwischenzeit kann die Infektion bereits durch eine Sektion nachgewiesen werden, wenn sich entsprechend viele Tochtersporocysten bereits im Mitteldarmdrüsen- und Gonaden-Bereich angesiedelt haben. Zwar lassen sich auch jüngere Infektionsstadien theoretisch nachweisen, allerdings ist deren Diagnose nicht verlässlich, da sie in den entsprechenden Organen und Geweben leicht übersehen werden können. NEUHAUS (1952) fand bei im Freiland gehaltenen L. stagnalis nach 45 Tagen Tochtersporocysten von T. ocellata im Mitteldarmdrüsengewebe vor, so dass für diesen Parasiten nach diesem Zeitraum eine sichere Diagnose per Sektion angenommen werden kann. Nachteil der Sektion ist neben dem massiven Eingriff in die Schneckenpopulation, dass auch mit ihrer Hilfe frühe Infektionen nicht erfasst werden können. Weiterhin ist eine Identifizierung der Art anhand der Tochtersporocysten oder redien nur schwer möglich. Nur einige besonders charakteristische Formen, wie z. B. die mit sehr großem Pharynx ausgestatteten Redien von P. echinatum, können zweifelsfrei zugeordnet werden. Tochtersporocysten sind aufgrund ihrer Morphologie nicht einer bestimmten Art zuzuordnen. So konnten bei den durchgeführten Sektionen Tochtersporocysten von Plagiorchis sp., O. ranae und T. ocellata nicht unterschieden werden. Erst wenn sich in den Sporocysten Cercarien einer recht fortgeschrittenen Entwicklungsstufe befanden, konnte eine Artbestimmung anhand dieser erfolgen. Allerdings ist zu diesem Zeitpunkt i.d.r. auch der Nachweis mit dem Cercarienschlupftest in 68

14 Kürze möglich. Für Erhebungen von Infektionsraten auf Artniveau ist also die Sektion nicht wesentlich effektiver als der Cercarienschlupftest Vergleich der Methoden Cercarienschlupftest, Sektion und npcr bei Ermittlung von Infektionsraten am Beispiel T. ocellata infizierter L. stagnalis aus Weiher J1 Die Darstellung aller ermittelten Daten und der fotografische Nachweis der Agarosegelelektrophoresen sind im Anhang (S. 146 ff.) aufgeführt. Als Beispiele für die durchgeführte npcr und nachfolgende Restriktionsanalyse sollen exemplarisch die Abb und 5.11 stehen. Nachfolgend sind die für T. ocellata durch die drei Methoden ermittelten Infektionsraten dargestellt (Tab. 5.1). L. stagnalis n = 162 Infektionsrate in % Cercarienschlupftest Infektionsrate in % Sektion Infektionsrate in % npcr T. ocellata 6,5 8,4 31,5 Tab. 5.1: Infektionsraten von T. ocellata in L. stagnalis ermittelt durch drei verschiedenen Methoden. Zunächst ist darauf hinzuweisen, dass die für die Methode Sektion ermittelte Infektionsrate ein additiver Wert ist. D. h. sie setzt sich zusammen aus der Infektionsrate des Cercarienschlupftests zuzüglich der tatsächlich bei der Sektion festgestellten Rate (1,9%). Wie in Kap erwähnt, wird dabei davon ausgegangen, dass patente Infektionen in jedem Fall durch eine Sektion nachgewiesen werden können. Es zeigt sich, dass durch die Methoden Cercarienschlupftest und Sektion eine vergleichbar hohe Infektionsrate für T. ocellata ermittelt wird, während durch die npcr eine Infektionsrate ermittelt wird, die ca. 4 bis 5 mal so hoch ist. Die durch Sektion ermittelte Infektionsrate weicht nur geringfügig von der durch einen Cercarienschlupftest erhobenen ab, da von 162 untersuchten L. stagnalis per Sektion nur in drei Fällen (1,9 %) eine Infektion mit T. ocellata zweifelsfrei nachgewiesen werden konnte. Weitere 33 Schnecken wiesen dabei Sporocysten auf, die aber aufgrund des frühen Entwicklungsstadiums nicht T. ocellata zuzuordnen waren. Hier zeigt sich ein klarer Vorteil der npcr. Aufgrund ihrer hohen Spezifität kann mit ihrer Hilfe klar zwischen den Sporocysten von T. ocellata und anderen Arten differenziert werden. Von den insgesamt 33 bei der Sektion sichtbar mit Sporocysten besetzten L. stagnalis konnten 12 durch die npcr als mit T. ocellata infiziert identifiziert werden. 69

15 Abb. 5.10: Agarosegelelektrophorese. Nachweis von T. ocellata in L. stagnalis. Die Spuren 4, 5, 7 und 12 zeigen das für T. ocellata spezifische 816 bp Amplifikat. Spur 1: Längenmarker, Fragmentgrößen nebenstehend. Abb. 5.11: Agarosegelelektrophorese. Verifikation des 816 bp Amplifikats von T. ocellata durch Restriktionsanalyse mit der Endonuklease BamH I. Alle getesteten Proben zeigen die erwarteten Banden bei 186 bp und 630 bp. Spur 1: Längenmarker, Fragmentgrößen nebenstehend. Die in Abb positiv getesteten Proben finden sich hier auf den Spuren 6 9 wieder. 70

16 Aufgrund der Vorgehensweise kann aber auch hier keine eindeutige Zuordnung der entdeckten Sporocysten zu T. ocellata vorgenommen werden. Da die DNA aus der gesamten Schnecke isoliert wurde und keine Probe der Sporocysten gesondert per npcr untersucht wurde, besteht die Möglichkeit, dass die als T. ocellata positiv getesteten L. stagnalis eine zweite, bis zu diesem Zeitpunkt noch unauffällige Infektion, in sich trugen. Dies zeigt einen möglichen Nachteil der verwendeten npcr auf. Sie differenziert nicht, in welchem Zustand eine Infektion vorliegt. Aufgrund der hohen Sensitivität der Methode wird T. ocellata unabhängig vom Entwicklungsstadium in der Schnecke nachgewiesen. Dies umfasst frische Infektionen, die sich noch im Stadium der Muttersporocyste befinden, genauso wie eventuell vom Immunsystem der Schnecke bekämpfte und abgewehrte Infektionen. Wie BAYNE (1983), NUNEZ et al. (1994) und ADEMA & LOKER (1997) beschreiben, findet bei erfolgreicher Bekämpfung von Infektionen eine Abkapselung des Parasiten durch Anlagerung von Haemocyten statt. Es ist jedoch anzunehmen, dass innerhalb der abgekapselten Bereiche Parasitengewebe noch relative lange intakt bleibt. Während der DNA-Extraktion wird so auch Parasiten-DNA gewonnen und anschließend molekularbiologisch nachgewiesen. Durch die npcr wurden 25 Infektionen von T. ocellata nachgewiesen, bei denen in der Schnecke durch Sektion keine Anzeichen einer Infektion gefunden wurden, was erneut die hohe Sensitivität der Trichobilharzia npcr aufzeigt. Wie schon dargestellt, kann dabei keine Aussage über die aktuelle Virulenz der Parasiten gemacht werden. In 10 weiteren Fällen wurde T. ocellata durch die npcr in Schnecken nachgewiesen, in denen durch die Sektion Infektionen mit anderen Trematoden festgestellt wurden. Entweder wurden dabei Sporocysten diagnostiziert, die bereits den Arten Plagiorchis sp. oder O. ranae zugeordnet werden konnten, oder es wurden Redien festgestellt, die für die in dieser Arbeit diagnostizierten Digenea nur bei den Arten P. echinatum, E. revolutum und H. conoidum als Vermehrungsstadien auftreten. Die zusätzlich zur Sektion durchgeführte molekularbiologische Untersuchung mittels npcr führte in diesen Fällen also zum Befund einer Doppelinfektion von L. stagnalis mit Trematoden. Dieser Befund weist auf den interessanten Aspekt der interspezifischen Konkurrenz (s. Kap. 5.8) zwischen Trematoden hin. Durch die npcr konnte gezeigt werden, dass neben anderen Arten auch T. ocellata in die Schnecke eingedrungen war. Aufgrund dieser Befunde lässt sich allerdings keine Aussage über den Zustand bzw. die Virulenz der durch npcr diagnostizierten T. ocellata Infektionen treffen. Denkbar wären verschiedene Möglichkeiten. Dazu zählen eine junge Infektion, bei der die Konfrontation zwischen den beiden Parasiten noch bevorsteht, ebenso wie eine durch den anderen Trematoden bereits verdrängte Infektion von 71

17 T. ocellata. Aber auch eine vor Befall des neuen Trematoden bereits von der Schnecke erfolgreich abgewehrte T. ocellata Infektion wäre denkbar. Interessanterweise wurden während der gesamten drei Jahre der Untersuchungen an Weiher J1 nur eine L. stagnalis (Nr. 187, s. Anh. S. 161) mit patenter Doppelinfektion festgestellt, an der T. ocellata beteiligt war. D.h. durch den Cercarienschlupftest konnte neben T. ocellata Cercarien von O. ranae im Gefäß nachgewiesen werden, wobei O. ranae bezüglich des Cercarienausstoßes deutlich dominierte. Generell sind patente Doppelinfektionen im Zwischenwirt zumeist seltene Ereignisse in Bezug auf die mathematische Wahrscheinlichkeit (KURIS, 1990, FERNANDEZ & ESCH, 1991, SOUSA, 1993, KURIS & LAFFERTY, 1994, ESCH et al., 2001), was das Vorhandensein von Mechanismen, die eine solche Koexistenz verhindern, nahe legt (s. Kap. 5.8). KURIS (1990) stellte für die Trematoden seines Untersuchungsobjekts Cerithidea californica eine Dominanzfolge auf. Dabei setzten sich z.b. Redien-bildende Trematoden im Allgemeinen gegen Sporocystenbildner durch. LOY & HAAS (2001) führen in nur 3 von untersuchten L. stagnalis patente Doppelinfektionen von T. ocellata und einem anderen Trematoden an. Die in der vorliegenden Untersuchung nachgewiesene hohe Anzahl von Fällen (ca. 6 %), in denen ein Befall von L. stagnalis mit T. ocellata und einem anderen Trematoden in fortgeschrittenem Entwicklungsstadium festgestellt wurde, mag darauf hinweisen, dass sich T. ocellata häufig nicht gegen andere Trematoden durchsetzen kann. T. ocellata steht also möglicherweise am Ende einer Rangfolge der Dominanz in L. stagnalis (s. Kap. 5.8). Die drei verglichenen Methoden zur Ermittlung von Infektionsraten in L. stagnalis zeigen sowohl Vor- als auch Nachteile und müssen entsprechend der Zielsetzung einer Untersuchung ausgewählt werden. Aussagen über aktuell herrschende Infektionsrisiken lassen sich mit dem Cercarienschlupftest treffen, während eine Sektion auch ein allgemeines bzw. in der nahen Zukunft bestehendes Risiko aufzeigt. Ein Vorteil des Cercarienschlupftest ist, dass er die Erhebung eines Infektionsrisikos ohne nachhaltigen Eingriff in die Population ermöglicht und somit Studien über einen längeren Zeitraum zulässt. Die npcr hingegen hat als großen Vorteil ihre hohe Sensitivität und Spezifität vorzuweisen, die potentielle Infektionsrisiken auch in weiterer Zukunft aufzeigen kann und dabei nicht die Gefahr von Verwechslungen mit anderen Trematoden in sich birgt. Geht man von einer Entwicklungsdauer von T. ocellata in L. stagnalis von ca. 8 Wochen aus (NEUHAUS, 1952), so könnte man vermutlich schon ca. 2 Monate vor der Badesaison das Risiko eines Auftretens von T. ocellata einschätzen. Durch Verwenden der npcr bei Untersuchung von Planktonproben (s. Kap. 5.3) ließe sich zusätzlich auch ein aktuelles Infektionsrisiko zuverlässig einschätzen. Allerdings sollte diese Arbeit nur die generelle Möglichkeit entsprechender Untersuchungen aufzeigen. Ob sich der Einsatz dieser Methode in der Praxis bewährt, muss zukünftige Forschung zeigen. Die durch den Cercarienschlupftest festgestellte Infektionsrate aller Trematoden in den untersuchten 261 L. stagnalis der Sammlung vom betrug 37,9 % (vgl. Anh., S. 158). Zählt man die zusätzlich per Sektion identifizierten Infektionen hinzu, so ergibt sich 72

18 eine Prävalenz von Trematoden in L. stagnalis von 68,6 %. Die durch Sektion und Cercarienschlupftest festgestellte Prävalenz von T. ocellata betrug dabei 8,4 % (s. Tab. 5.1), womit die Prävalenz der anderen Trematoden ungefähr 60 % betrug. Führt man sich nun vor Augen, dass durch die npcr mit 31,5 % eine ca. 4-mal höhere Prävalenz für T. ocellata festgestellt wurde und überträgt dies im Gedankenexperiment auf alle anderen Trematoden, so wir deutlich, in welch hohem Maße L. stagnalis Infektionsversuchen von Trematoden ausgesetzt ist. Es lässt sich also vermuten, dass die Konfrontation von L. stagnalis mit Trematoden sehr häufig ist, was den oben angeführten Aspekt der interspezifischen Konkurrenz zwischen Trematoden um die Ressource Schnecke noch hervorhebt. Zwar lassen sich die für T. ocellata gewonnen Ergebnisse nicht ohne weiteres auf andere Trematoden übertragen, eine ähnliche Tendenz ist aber wahrscheinlich. Auch die Leistung des Immunsystems von L. stagnalis wird hier auf abstrakte Art und Weise deutlich, muss doch die Schnecke offensichtlich einen Großteil der Infektionen erfolgreich abwehren, da im Laufe der drei Untersuchungsjahre nur maximale Patenzen von Trematoden in L. stagnalis von 36,6 %, 23,4 % bzw. 33,9 % festgestellt wurden (s. Kap. 5.4 und s. Anh., S. 158). Allerdings sollte in diesem Zusammenhang nicht außer Acht gelassen werden, dass möglicherweise im Untersuchungsjahr 2003 besondere klimatische Umstände geherrscht haben (s.u.), die eine derart hohe Prävalenz wie die durch npcr und Sektion festgestellte begünstigte. Interessant wäre gewesen, ob sich für das Jahr 2004 deutlich höhere Raten patenter Infektionen als in den Jahren zuvor manifestieren. Aufgrund der in Kap gewonnen Erkenntnisse, dass sich die per Cercarienschlupf und Sektion ermittelten Infektionsraten im Jahresverlauf annähren, wäre zu erwarten gewesen, dass durch die Sektion nicht wesentlich mehr Infektionen zu entdecken gewesen wären. Tatsächlich zeigte sich jedoch, dass knapp die Hälfte (49,4 %) der 162 durch Sektion untersuchten und im Cercarienschlupftest als negativ diagnostizierten L. stagnalis Infektionen trugen. Dieses überraschende Ergebnis lässt sich vielleicht mit den besonderen klimatischen Bedingungen des Winters 2002 / 2003 und des Sommers 2003 (s. Kap. 5.4) erklären. Durch den Neuaufbau der L. stagnalis Population kam es vielleicht zu einer Verzögerung des Auftretens infizierbarer Schnecken (s. Kap. 5.4). Stehen nach normalen Wintern bereits im Mai überwinterte juvenile Schnecken 11 zur Verfügung, so fehlten diese im Jahr 2003 aufgrund des Absterbens im Winter. Die neue Generation ging folglich aus den von den überlebenden Schnecken im Mai abgesetzten Eigelegen hervor. Dementsprechend verzögerten sich das Auftreten der Jungschnecken und auch der Zeitpunkt möglicher Infektionen, da nur diese, wie in Kap. 5.8 näher ausgeführt, erfolgreich infiziert werden können. Diese Verzögerung 11 L. stagnalis zeigt während der Überwinterung nur geringes Wachstum, weshalb im Herbst des Vorjahres als juvenil in die Winterpause gegangene Schnecken auch im Frühjahr des nächsten Jahres als juvenil angesehen werden können. 73

19 hätte dann eine zeitliche Verschiebung der Trematodenentwicklung nach sich gezogen, weshalb zum Zeitpunkt der Probennahme viele Entwicklungen noch nicht abgeschlossen waren. Denkbar ist auch ein Einfluss der im August 2003 auftretenden besonders niedrigen Wasserstände. Dabei wurden große Mengen Schnecken auf kleinem Raum zusammengedrängt, was die Infektionschancen für zu diesem Zeitpunkt durch Endwirte ins Gewässer geratene Miracidien zweifelsohne stark erhöht (KALBE et al., 2000). Als Folge wären im August 2003 mehr erfolgreiche Infektionen als in diesem Monat sonst üblich erfolgt, was eine Vielzahl von im September noch nicht ausgereiften Infektionen nach sich gezogen hätte. BROWN et al. (1988) stellten bei Untersuchung der Trematodenprävalenz von Lymnaea elodes einen starken Anstieg der Prävalenz in trockenen Jahren fest. Vielleicht lässt sich durch solche extremen klimatischen Umstände auch erklären, warum in einigen Kleingewässern der Bielefelder Region überdurchschnittlich hohe Infektionsraten von L. stagnalis von bis zu 70 % mit dem Cercarienschlupftest festgestellt werden konnten (MEIER, 1999). 74

20 5.3 Der Nachweis von T. ocellata in Planktonproben von Weiher J1 mittels der Trichobilharzia npcr Die Planktonproben wurden in den Jahren 2001 und 2002 wie in Kap beschrieben gewonnen und wie in den Kap und aufgelistet molekularbiologisch mit der Trichobilharzia npcr untersucht. Als Beispiele für die durchgeführte npcr und nachfolgende Restriktionsanalyse sollen an dieser Stelle exemplarisch die Abb und 5.13 stehen. Die Darstellungen aller Agarosegelelektrophoresen sind im Anhang (S. 149 ff.) aufgeführt. Abb. 5.12: Agarose-Gelelektrophorese. Nachweis von T. ocellata in Planktonproben von Weiher J1 der Monate April bis Juli Die zugehörigen Kontrollen befinden sich auf dem Gel der Monate Juli bis Oktober 2001 (s. Anh., S. 155) 16 Spuren. Von links nach rechts: Spur 1: DNA Längenmarker (GeneRulerTM Spur 9: Probe B 100 bp DNA Ladder Plus, Fragment- Spur 10: Probe A / positiv längen links stehend) Spur 2: T. ocellata - DNA /Kontrolle Spur 3: Probe A Spur 4: Probe B Spur 5: Probe A / positiv Spur 6: Probe A Spur 7: Probe B Spur 8: Probe A / positiv Spur 11: Probe B Spur 12: Probe A Spur 13: Probe B / positiv Spur 14: Probe A / positiv Spur 15: Probe B Spur 16: Probe A 75

21 Abb. 5.13: Agarose-Gelelektrophorese. Restriktionsanalyse mit BamH I der 816 bp - Amplifikate T. ocellata - positiver Planktonproben des Jahres Alle getesteten Proben zeigen die für T. ocellata typischen Fragmentgrößen von 186 bp und 630 bp. 16 Spuren. Von links nach rechts: Spur 1: DNA Längenmarker (GeneRulerTM Spur 5: / Probe B 100 bp DNA Ladder Plus, Fragment- Spur 6: / Probe A längen links stehend) Spur 2: / Probe A Spur 3: / Probe A Spur 4: / Probe A Spur 7: / Probe B Spur 8: / Probe A Spur 9: / Probe A Spur: 10-16: leer Tab. 5.2 und Tab. 5.3 zeigen eine Aufstellung der für die Jahre 2001 und 2002 gewonnenen Ergebnisse über den Nachweis von T. ocellata in Planktonproben mittels npcr. Zusätzlich zu den Ergebnissen der molekularbiologischen Untersuchung sind als Vergleich die Ergebnisse des Cercarienschlupftests für den jeweiligen Probetag angegeben. Für das Jahr 2001 ist weiterhin das Auftreten einer Cercariendermatitis an den Händen des Probennehmenden angeführt. Ab dem Jahr 2002 wurden aufgrund der Erfahrungen des Vorjahres bei den Sammlungen der Schnecken Gummihandschuhe als Prävention getragen. 76

22 Datum Probenahme 2001 Probe A Probe B Cercarienschlupftest Infektionsrate in % Cercariendermatitis s.u.* keine Beprobung* keine Beprobung* , , , , , , , , , ,8 Tab. 5.2: Untersuchung von Planktonproben aus Weiher J1 des Jahres 2001 durch die T. ocellata npcr. Planktonproben, in den T. ocellata nachgewiesen werden konnte, sind mit (+) gekennzeichnet. Zum Vergleich ist zusätzlich das Ergebnis des Cercarienschlupftests aufgeführt. Das Auftreten einer Cercariendermatitis am Datum der Probenahme ist durch angezeigt. * Am wurde keine Schneckensammlung durchgeführt, so dass keine Angaben zum Cercarienschlupftest und zur Cercariendermatitis gemacht werden können. Planktonprobe B ist während des Transports ausgelaufen und konnte daher nicht getestet werden. Datum Probenahme 2002 Probe A Probe B Cercarienschlupftest Infektionsrate in % , , , , , , , ,0 Tab. 5.3: Untersuchung von Planktonproben aus Weiher J1 des Jahres 2002 durch die T. ocellata npcr. Planktonproben, in den T. ocellata nachgewiesen werden konnte, sind mit (+) gekennzeichnet. Zum Vergleich ist zusätzlich das Ergebnis des Cercarienschlupftests aufgeführt. 77

23 Die aufgeführten Ergebnisse zeigen, dass sich T. ocellata in Planktonproben von Weiher J1 mit Hilfe der Trichobilharzia npcr nachweisen lässt. Im Jahr 2001 konnte der Parasit dabei von Anfang Mai bis Mitte Oktober im Gewässer diagnostiziert werden, im Jahr 2002 von Anfang Mai bis Anfang September. Die Cercariendermatitis tritt in klimatisch gemäßigten Regionen schwerpunktmäßig während der Sommermonate auf (MÜLLER & KIMMIG, 1994, BECHTOLD et al., 1997, CHAMOT et al., 1998, HORAK et al. 2003), wobei nach Information niedergelassener Ärzte im Raum Bielefeld Cercariendermatitiden vor allem in den Monaten Juli und August diagnostiziert werden (DR. KASTRUP, DR. GEBAUER, pers. Mitteilungen). Die Vermutung lag nahe, dass dieses sommerliche Auftreten der Erkrankung als Folge des Freizeitverhaltens der Betroffenen zu erklären ist, da das Auffinden potentieller Endwirte durch die Cercarien des Parasiten auch in anderen Monaten Erfolg versprechend ist. Weiterhin haben Infektionen in jungen A. platyrhynchos eine höhere Erfolgsquote, während adulte Enten häufig immun gegen die Infektion sind (NEUHAUS, 1952, MEULEMAN et al., 1984). Jungenten treten bereits im April häufig auf, was die gleichzeitige Präsenz der Cercarien von T. o- cellata nahe liegend erscheinen lässt. Die Untersuchung bestätigt das Vorkommen der Cercarien von T. ocellata im Gewässer über die Monate Juli und August hinaus. Auch das Auftreten von Cercariendermatitiden ist über diese Monate hinaus hin möglich. So manifestieren sich im Jahr 2001 Cercariendermatitiden von Ende Juni bis Anfang September. Auffallend an der Untersuchung ist die Heterogenität der Proben A und B an vielen Probetagen. In den meisten Fällen wurde nur eine der beiden Proben positiv getestet, während in der anderen der Parasit nicht nachzuweisen war. Eine einzelne L. stagnalis kann bis zu mehreren tausend Cercarien von T. ocellata pro Tag abgeben (SLUITERS et al., 1980, ALLGÖWER & MATUSCHKA, 1993), was einen Nachweis bei gleichmäßiger Verteilung der Cercarien über die Gewässerfläche in jedem Fall ermöglichen müsste. Zusätzlich sind am und am keine T. ocellata positiven Planktonproben ermittelt worden, obwohl der Cercarienschlupftest patente Infektionen des Parasiten an den nachfolgend entnommen Schnecken nachweisen konnte und an beiden Tagen eine auftretende Dermatitis den sicheren Nachweis der Cercarien im Gewässer erbrachte. Da die Sensitivität der verwendeten npcr ausgesprochen hoch ist (s. Kap ) und auch einzelne in der Probe enthaltene Cercarien nachgewiesen worden wäre, lässt sich schlussfolgern, dass bei der Probennahme keine Cercarien mit dem Planktonnetz aufgesammelt wurden. Der Grund hierfür liegt vermutlich im Verhalten der Cercarien von T. ocellata. Im Gegensatz zu anderen Schistosomatiden Cercarien, wie z.b. denen der humanpathogenen Schistosoma-Arten, befinden sich die Cercarien von T. ocellata i.d.r. nicht frei schwimmend im Wasserkörper. 78

24 Abb 5.14: Cercarie von T. ocellata in Ruhestellung. NEUHAUS (1952) und HAAS & VAN DE ROEMER (1998) beschreiben das Verhalten der Cercarie nach Verlassen der Schnecken. Sofort nach dem Freisetzen aus der Schnecke schwimmen sie aufgrund ihrer positiven Phototaxis und negativen Geotaxis auf den hellsten erreichbaren Fleck in der Nähe der Wasseroberfläche und heften sich mit ihrem Bauchsaugnapf fest. Dabei nehmen sie eine charakteristische Ruhehaltung ein, bei der der Körper abgebogen wird und im rechten Winkel zum steif weggestreckten Schwanz gehalten wird (s. Abb. 5.14). Während frisch geschlüpfte Cercarien zuweilen ohne erkennbare Reize kurze Strecken schwimmen, harren ältere Cercarien teilweise mehrere Stunden in der beschriebenen Haltung aus. Bei Beschattung schwimmen sie spontan in Richtung der Beschattung los und kehren nach 3 5 cm diese Schwimmbewegung wieder in Richtung Licht um. Dieses Verhalten ist als Anpassung an das Auffinden eines Wirtes zu sehen (FEILER & HAAS, 1988). Quellen von Beschattung sind in einem Gewässer, wenn man sich an dessen Oberfläche befindet, selten und liegen häufig im Auftreten der Endwirte begründet. Wird kein potentieller Endwirt vorgefunden, so kehrt der Parasit in seine ökonomische Wartehaltung zurück. Wie in Kap erwähnt, wurden die Probenahmen aufgrund der zunehmenden Verkrau- tung des Gewässers dabei im Laufe eines Jahres immer mehr auf die Wasserfreiflächen verlagert, also weg vom bevorzugten Aufenthaltsort von L. stagnalis. Das Sammeln T. ocel- Dieses besondere Verhalten der Wirtsfindung hat entscheidenden Einfluss auf die Verteilung der Cercarien von T. ocellata im Gewässer. In Gewässern ohne stärkere Strömung, wie dem untersuchten Weiher, verteilen sich die Cercarien nicht gleichmäßig, sondern entfernen sich vermutlich nur in geringem Maße von ihrem Schlupfort. Hier heften sie sich in der Nähe der Wasseroberfläche vermutlich an Wasserpflanzen an. Der Aufenthaltsort der Cercarien entspricht folglich in etwa dem des Zwischenwirtes. L. stagnalis hält sich in Weiher J1 häufig im stark verkrauteten Uferbereich auf, der mittels eines Planktonnetzes nur schwer zu beproben ist. 79

25 lata negativer Planktonproben bei gleichzeitigem Nachweis des Parasiten durch andere Methoden lässt sich folglich als im Ort der Probenahme begründet erklären und auf das Verhalten der Cercarien von T. ocellata zurückführen. Als Konsequenz wurde die Methode der Planktonnahme im Jahr 2002 dahingehend verändert, dass bewusst vermehrt im Uferbereich des Gewässers beprobt wurde. Tatsächlich zeigt sich für das Jahr 2002 während der Sommermonate ein regelmäßiger Nachweis des Parasiten zumindest in einer der beiden Proben. An drei Terminen konnte der Parasit in beiden Proben nachgewiesen werden. Möglicherweise lässt sich das Verhalten der Cercarien von T. ocellata aber auch nutzen, um die Methode der Sammlung zu optimieren. Die Cercarien zeigen eine ausgeprägt positive Phototaxis, was im Labor bereits im Aufreinigungsprozess der Cercarien (s. Kap ) genutzt wurde. Dabei schwimmen die Cercarien auf einen Lichtpunkt zu und sammeln sich an der hellsten Stelle. Würde man in ein Gewässer starke Lampen wie zum Beispiel Tauchleuchten einbringen, so könnten die Cercarien im Licht des Strahlers eventuell aufkonzentriert werden. Unmittelbar nach Ausschalten der Strahler (die Cercarien lösen sich bei Beschattung ) könnte die bestrahlte Region dann intensiv mit dem Planktonnetz abgefischt werden oder man versieht den Strahler mit einer abnehmbaren Scheibe, von der anschließend anhaftende Cercarien isoliert werden können. Die Lebensdauer der Cercarien von T. ocellata beträgt bei 20 C etwa Stunden (NEUHAUS, 1952), umfasst also auch die Nachtstunden. Bisher gibt es keine Erkenntnisse darüber, ob das phototaktische Verhalten der Cercarien auch bei Dunkelheit erfolgt. Wäre dies der Fall, so würde die oben beschriebene Methode der Aufkonzentrierung vermutlich bei Nacht noch effektiver funktionieren. Bevor entsprechende Verfahren erprobt sind, bleibt bei der Entnahme von Planktonproben zum Nachweis von T. ocellata als Konsequenz nur, möglichst viele Proben an den Aufenthaltsorten der Schnecke zu entnehmen. Am wurde T. ocellata in einer Planktonprobe nachgewiesen, während die per Cercarienschlupf untersuchten L. stagnalis keine Infektionen mit dem Parasiten aufwiesen. Die Methode des Nachweises aus Planktonproben hat gegenüber dem Cercarienschlupftest den Vorteil, dass die häufig sehr geringe Prävalenz des Parasiten in L. stagnalis von unter 1 % (KOLAROVA et al., 1992, NIEWIADOMSKA et al., 1997, VÄYRYNEN et al., 2000, LOY & HAAS, 2001) nicht zu falsch negativen Ergebnissen führt. Die Anzahl der untersuchten Schnecken sollte bei derart niedrigen Prävalenzen deutlich über 100 Exemplaren liegen, um ein aussagekräftiges Ergebnis zu bekommen. Dies stellt einen erheblichen Arbeitsaufwand dar, soweit überhaupt Schnecken in dieser Menge gesammelt werden können. Da an sonnigen Tagen pro Schnecke mehrere tausend Cercarien abgegeben werden können (ALLGÖWER & MATUSCHKA, 1993), ist der Nachweis über Cercarien in diesem Fall wahrscheinlicher. 80

26 Auch eine zuvor bereits erwähnte Konzentration der Cercarien unter Ausnutzung ihrer stark ausgeprägten positiven Phototaxis und ihres Verharrens am hellsten Punkt in ihrer Ruhehal- tung, könnte eventuell zur Selektion und Vermeidung falsch-positiver Nachweise durch Miracidien von T. ocellata genutzt werden. Zwar reagieren auch die Miracidien von T. ocellata 81 Andererseits ist am mit dem Cercarienschlupftest eine Infektionsrate von 4 % festgestellt worden, während die molekularbiologische Analyse der Planktonproben keinen Nachweis von T. ocellata erbrachte. Hier zeigt sich ein Vorteil des Cercarienschlupftests o- der einer Sektion gegenüber der molekularbiologischen Planktonanalyse. Die Abgabe der Cercarien von T. ocellata ist witterungs- und temperaturabhängig. So schlüpfen an bedeckten Tagen mit Wassertemperaturen unter 17 C keine Cercarien (ALLGÖWER & MATUSCHKA, 1993), weshalb in Frühjahr und Herbst häufig nur wenig Cercarien in das Gewässer abgegeben werden. Unter Laborbedingungen hingegen kann bei Zimmertemperatur und entsprechender Bestrahlung der Cercarienschlupf induziert werden. Der Nachweis des Parasiten über eine npcr stellt also, wenn keinen Ersatz des Cercarienschluptests, so zumindest eine sinnvolle Ergänzung dar. Kritisch anzumerken ist, dass die Planktonuntersuchung mit der Trichobilharzia npcr nicht zwischen Miracidien und Cercarien unterscheiden kann, sondern beides nachweist. Nur die Cercarien von T. ocellata bewirken eine Dermatitis, weshalb für die Ermittlung eines aktuellen Infektionsrisikos der Nachweis eines Miracidiums zu einem falsch-positiven Ergebnis der Planktonprobe führt. Allerdings zeigt der Test auch in diesem Fall ein potentielles Risiko an. Aufgrund der sehr geringen täglichen Eiproduktion von weniger als 10 Eiern pro T. ocellata Weibchen (RAU et al., 1975) ist nicht mit einem Massenauftreten von Miracidien im Gewässer zu rechnen. Auch im Falle eines Massenbefalls des Endwirtes ist die Gesamtmenge abgegebener Eier gering. RAU et al. (1975) fanden in Enten, in die zwischen 160 und 1100 Cercarien eingedrungen waren, nach 19 Tagen einen Durchschnitt von 65 abgegebenen Eiern pro Ente, wobei vor dem 15. Tag und ab dem 22. Tag nur noch deutlich unter 25 Eiern abgegeben wurden. Miracidien sind im Gewässer aufgrund des sporadischen Auftretens der Endwirte also nur selten und in geringen Stückzahlen im Vergleich zu der Anzahl der Cercarien zu erwarten. Trotzdem kann ein positiver Nachweis aufgrund lediglich eines Miracidiums nicht ausgeschlossen werden. Durch Verwendung eines Planktonnetzes, das eine größere Maschenweite als die Körperlänge eines Miracidiums aufweist, könnte der mögliche Nachweis dieses Larvalstadiums eventuell ausgeschlossen werden. Die Körperlänge eines Miracidiums von T. ocellata beträgt nach NEUHAUS (1952) 180 µm, sodass eine Maschenweite von 250 µm ausreichend erscheint, um ein Aufsammeln zu umgehen. Die Sammlung der Cercarien (Körperlänge: ~ 800 µm) sollte dadurch nicht beeinträchtigt werden.

27 positiv phototaktisch (NEUHAUS, 1952), jedoch fehlt ihnen die Möglichkeit der Miracidien sich an einen Untergrund anzuheften. Bei Etablierung einer Methodik, die ausschließlich fest sitzende Cercarien zur Analyse heranzieht (s.o.), könnte eine Kontamination der Proben durch Miracidien ausgeschlossen werden. 5.4 Die Inzidenz digeneischer Trematoden in L. stagnalis des Weihers J1 Abb zeigt Cercarien, der sieben, sich im Untersuchungsgebiet in L. stagnalis entwi- ckelnden Digenea. Abb. 5.15: Fotographische Darstellung der in L. stagnalis in Weiher J1 gefundenen Cercarien. a. Trichobilharzia ocellata (La Valette 1855) Brumpt 1931 (Schistosomatidae) b. Diplostomum sp. (Diplostomatidae); Färbung: Methylenblau c. Opisthioglyphe ranae Froelich 1791 (Plagiorchiidae) d. Plagiorchis sp. (Plagiorchiidae); Färbung: Neutralrot e. Pseudoechinoparyphium echinatum von Siebold 1837 (Echinostomatidae) f. Echinostoma revolutum Froelich 1802 (Echinostomatidae) g. Hypoderaeum conoidum Bloch 1782 (Echinostomatidae) a) c) d) e) b) g) f) 82

28 Wie in Kap beschrieben, wurden für die Jahre 2001 bis 2003 Infektionsraten mit Hilfe des Cercarienschlupftestes (s. Kap ) ermittelt. Die zugehörigen Datentabellen sind im Anhang (S. 158) aufgeführt. Abb. 5.16: Infektionsraten verschiedener Digenea in L. stagnalis des Jahres Abb. 5.17: Infektionsraten verschiedener Digenea in L. stagnalis des Jahres

29 Abb. 5.18: Infektionsraten verschiedener Digenea in L. stagnalis des Jahres Gesamtinfektionsraten in L. stagnalis Die Abb bis 5.18 zeigen, dass in allen drei Jahren im Untersuchungszeitraum ein Anstieg der Gesamtinfektionsrate 12 im Jahresverlauf zu verzeichnen ist. Im Jahr 2001 wurden erste Schneckenfunde im Monat Mai gemacht, während im April noch keine Schnecken im oberflächennahen Bereich des Gewässers anzutreffen waren. Von Mai (5,6%) bis Oktober konnte dann ein Anstieg der Infektionsrate auf 36,6 % verzeichnet werden. Im Jahr 2002 wurde für April zunächst eine Gesamtinfektionsrate von 17,6 % ermittelt, im Monat Mai betrug sie dann nur noch 13,7 %. Im Jahresverlauf erfolgte dann ein Anstieg der Infektionsrate auf 23,4 %. Im Oktober hatten sich die Schnecken bereits in tiefere Wasserschichten zurückgezogen. Im Jahr 2003 wurden Schnecken in den Monaten April bis September gesammelt. In den Monaten April und Mai konnten dabei ungefähr gleich bleibend hohe Infektionsraten von 6,7 % bzw. 6,5 % ermittelt werden, bevor im Juni keine infizierten Schnecken mehr festgestellt werden konnten. Von Juli bis September kam es dann wieder zu einem Anstieg der Gesamtinfektionsrate bis auf 33,9 %. Ungewöhnlich erscheint im Jahr 2002 zunächst das Absinken der Gesamtinfektionsrate im Mai. Erklären lässt sich dies mit der nur geringen Anzahl der untersuchten Schnecken im April. Dabei ist zu berücksichtigen, dass zu Beginn der aktiven Phase im April / Mai vermehrt 12 Gesamtinfektionsrate: Gesamtheit aller durch digeneische Trematoden in L. stagnalis hervorgerufener Infektionen. 84

30 sehr große Schnecken mit einer Gehäusehöhe > 4 cm anzutreffen sind, kleinere Schnecken verlassen die Überwinterungsregion offenbar erst später und sind erst Mitte Mai im Gewässer aufzufinden. Wie in Kap. 5.5 ausgeführt, sind Infektionen bei großen Schnecken aber häufiger anzutreffen als bei kleinen, was bei geringen Stückzahlen zu der beobachteten relativ hohen Infektionsrate führen kann. Das Jahr 2003 zeigt eine abweichende Entwicklung der Gesamtinfektionsraten. Anhand dieses Jahresverlaufs lässt sich ein möglicher Einfluss klimatischer Faktoren auf die Populationen von Trematoden und Wirtsschnecken ablesen. Wie bereits zuvor angeführt, zeichnete sich der Winter 2002 / 2003 durch eine lange Kälteperiode mit Temperaturen aus, die für mehrere Wochen deutlich unter dem Gefrierpunkt lagen. Als Folge überlebte nur ein geringer Teil der Lymnaeen im untersuchten Gewässer, was durch die geringe Anzahl gesammelter Schnecken von Mai bis Juni deutlich wird. Die im Mai ablaichenden überlebenden Schnecken begründeten dann die neue Schneckengeneration, die sich in den darauf folgenden Monaten entwickelte, so dass ab Juli L. stagnalis wieder häufig anzutreffen war. Die gleichzeitig im Sommer 2003 einsetzende lang anhaltende Trockenperiode führte dabei zur einer hohen Anzahl aufgefundener und untersuchter Schnecken in den Monaten Juli bis September (s. Kap ). Da ein Großteil der Schnecken im Winter verstarb, lässt sich schlussfolgern, dass die im Jahr 2003 aufgezeichneten Gesamtinfektionen auf neue Infektionen mit Trematoden des gleichen Jahres zurückzuführen sind (s.u.). So konnten im Juni 2003 bei 66 untersuchten Schnecken keine patenten Infektionen festgestellt werden. Erst ab Juli traten wieder patente Infektionen auf. Ein saisonaler Anstieg der Gesamtinfektionsrate von Trematodeninfektionen innerhalb einer Schneckenpopulation entspricht den Erwartungen. Ein entsprechender Anstieg wurde von verschiedenen Autoren bereits für L. stagnalis beschrieben (YODER & COGGINS, 1998,VÄYRYNEN et al., 2000, LOY & HAAS, 2001) und lässt sich schlüssig erklären. Nach Beendigung der Winterpause werden in den Schnecken zunächst nur Infektionen des Vorjahres nachgewiesen, da eine Infektion während der Wintermonate auszuschließen ist. Während der aktiven Phase können die Schnecken dann neu infiziert werden, wie es der Verlauf der Gesamtinfektionen im Jahr 2003 nahe legt. Die Präpatentperiode von Trematoden in Süßwasserschnecken ist artspezifisch und abhängig von der Umgebungstemperatur, beträgt aber als Faustregel ca. 8 Wochen (DÖNGES, 1988). NEUHAUS (1952) hielt mit T. ocellata infizierte L. stagnalis im Freiland und stellte Präpatenzeiten von 11 bis 14 Wochen fest. Unter Laborbedingungen beobachteten MCCLELLAND & BOURNS (1969) für T. ocellata in L. stagnalis 42 Tage bei 20 C bis zur Patenz der Infektionen, SLUITERS (1981) stellte 4 Wochen bis zum Auftreten erster Cercarien fest, wobei ein erster Höhepunkt der Cercarienproduktion 85

31 nach 8 Wochen erreicht wurde. Bei AMEN & MEULEMAN (1992) wurden nach 7 Wochen reife Cercarien in den Tochtersporocysten von T. ocellata beobachtet. L. stagnalis, die im Juli des Jahres 2003 Cercarien abgaben, wurden also vermutlich im Mai infiziert. Prinzipiell sind aber auch Infektionen denkbar, die bereits im Vorjahr stattgefunden haben und während der Winterpause ruhten, um dann mit Beginn der aktiven Phase ihre Entwicklung fortzusetzen. Eigene Erfahrungen mit dem bei uns im Labor gehaltenen Parasit-Wirt-System Schistosoma mansoni / Biomphalaria glabrata zeigen, dass Trematoden in der Lage sind, ihre Entwicklung an den Zwischenwirt anzupassen und so ungünstige Perioden zu überdauern. Nach Verbesserung der Lebensbedingungen für die Schnecke setzte auch der Parasit seine Entwicklung fort. Da im vorangegangenen Winter aber ein Großteil der Schnecken verstarb, sind für das Jahr 2003 wohl Neuinfektionen von L. stagnalis wahrscheinlicher. Dafür spricht auch, dass einige Trematoden häufiger auftreten als in den Jahren zuvor, andere hingegen völlig fehlen (vgl. Abb ) Es trat also eine Verschiebung der Artenprävalenz innerhalb der Trematodenfauna auf (s. Kap ). Ein Anstieg der Infektionsraten im Jahresverlauf beruht demnach auf einem kumulativen Effekt. Da die Hauptfortpflanzungszeit von L. stagnalis in Weiher J1 im Frühjahr liegt (s. Kap. 5.6) und die Schnecken nur als Jungschnecken eine hohe Empfänglichkeit für Trematodeninfektionen aufweisen (s. Kap. 5.8), ist davon auszugehen, dass der größte Anteil der Infektionen im Frühjahr erfolgt. Zwar werden das ganze Jahr über vereinzelt Eigelege von L. stagnalis im Gewässer angetroffen, allerdings ist deren Anzahl im Vergleich zum Frühjahr verschwindend gering. Da die Gesamtzahl der Schnecken nach der Reproduktion im Frühjahr nicht nennenswert ansteigt und die Infektionen in den Schnecken im Laufe des Jahres bis zur Patenz reifen, wird insgesamt innerhalb eines Jahres eine steigende Patenz der Infektionen ermittelt. Die vereinzelt aus späteren Gelegen nachwachsenden Schnecken scheinen den Effekt der ansteigenden Gesamtinfektionsrate aufgrund ihrer geringen Anzahl nicht entscheidend zu beeinflussen. Die Ergebnisse zeigen, das Trematodeninfektionen von L. stagnalis in Weiher J1 überraschend häufig sind, was aufgrund der niedrigen Infektionsraten einzelner Trematoden (häufig < 1%, s. Kap. 5.7) nicht zu vermuten gewesen wäre. Gegen Ende der aktiven Phase der Schnecken im September / Oktober zeigt rund ein Drittel patente Infektionen. Stichprobenartige Untersuchungen anderer Schneckenarten und in anderen Gewässern der Umgebung deuten darauf hin, dass dies keine Besonderheit des untersuchten Weihers ist. Allgemein zeichnen sich Süßwassermollusken nach BOURNS (1963) und FERNANDEZ & ESCH (1991) durch eine hohe Durchseuchung mit Trematoden aus. NIEWIADOMSKA et al. (1997) und VÄYRYNEN et al. (2000) konnten in L. stagnalis finnischer Seen Infektionsraten von rund 86

32 40 % per Sektion ermitteln. LOY & HAAS (2001) stellten für L. stagnalis eine durchschnittliche Infektionsrate von 45 % mit Trematoden fest (s. auch Kap ), wobei die Bestimmung wie in der vorliegenden Arbeit durch den Cercarienschluptest vorgenommen wurde, was für eine Sektion deutlich höhere Werte annehmen lässt (vgl. Kap. 5.2). KURIS & LAFFERTY (1994) kombinierten Daten 62 verschiedener mariner und limnischer Studien und fanden eine durchschnittliche Prävalenz von Trematoden in Mollusken von 23%. Schnecken der Gattung Lymnaea zeigten mit 35,2 % deutlich höhere Infektionsraten. Beide Werte korrelieren gut mit den in dieser Arbeit festgestellten Infektionsraten. Deutlich höhere Infektionsraten werden i.d.r. erzielt, wenn statt der Patenz (in dieser Zeit werden Cercarien abgegeben) die Prävalenz der Parasiten untersucht wird (vgl. Kap 5.2) Infektionsraten einzelner Digenea in L. stagnalis Die Spitzschlammschnecke L. stagnalis wird in Weiher J1 von den verschiedenen Trematodenarten unterschiedlich häufig parasitiert. Dabei konnten Schwankungen der Befallsrate innerhalb eines Jahres genauso festgestellt werden, wie Änderung in der Zusammensetzung der Trematodenfauna zwischen einzelnen Jahren. Der in L. stagnalis im Weiher J1 häufigste Trematode ist O. ranae. Dieser zu den Plagiorchiidae zählende Trematode zeigte gegen Ende der aktiven Phase von L. stagnalis Infektionsraten von um die 16 %. In allen drei Jahren war er die dominante Art. Die Erklärung für die hohe Prävalenz des Trematoden liegt in seinem Entwicklungszyklus begründet. Endwirt von O. ranae sind Froscharten von denen Rana esculenta im untersuchten Gewässer häufig ist. O. ranae benötigt zur Vervollständigung seines Lebenszyklus einen zweiten Zwischenwirt, der, wie Infektionsversuche im Labor zeigten, in Form von Erpobdella octoculata L. und den Larvalformen von Bufo bufo L. in Weiher J1 ebenfalls zahlreich vorhanden ist (s. Abb und 5.20). Eine interessante Variante des Lebenszyklus von O. ranae beschreiben DOBROVOLSKY (1965) und GRABDA-KAZUBSKA (1969). Sie beobachteten, dass Cercarien von O. ranae auch in die Haut des Endwirtes eindringen und dort zur Metacercarie enzystieren, anstatt einen 2. Zwischenwirt aufzusuchen. Da Froschlurche häufig nach einer Häutung ihre abgestoßene Haut verspeisen, gelangt der Parasit auf diese Art und Weise in seinen Endwirt. Durch die räumliche Nähe von Endwirt und Zwischenwirten sind die Übertragungswege durch Miracidien bzw. Cercarien bei O. ranae sehr kurz, was zu einer hohen Erfolgsquote der Infektionen führt. 87

33 Abb. 5.19: Infektion des 2. Zwischenwirtes Erpobdella octoculata L. durch Cercarien von O. ranae. Schwarze Pfeile: Bereits eingedrungene und zur Metacercarie encystierte O. ranae. Weiße Pfeile: Invasion des Wirtes durch Cercarien. Abb. 5.20: Infektion des 2. Zwischenwirtes Bufo bufo L. (Larvalstadium) durch Cercarien von O. ranae. Weiße Pfeile: Im Bereich des Schwanzsaumes zur Metacercarie encystierte O. ranae. Regelmäßig vorkommende Trematoden, die jedoch deutlich niedrigere Infektionsraten als O. ranae aufweisen, sind P. echinatum und T. ocellata. Die Infektionsraten von P. echinatum liegen dabei meist um 2 % und waren nur Ende 2001 höher (s. Abb ). T. ocellata ist ebenfalls in allen Jahren nachweisbar und weist Infektionsraten zwischen 1 % und 5,8 % je nach Monat auf. Die Endwirte beider Trematoden sind (so weit bekannt) die Stockente (A. platyrhynchos) und andere Wasservögel. Die Trematoden Diplostomum sp., E. revolutum und H. conoidum sind nur vereinzelt und mit niedrigen Infektionsraten von 0,4 % 2,8 % im Gewässer nachgewiesen worden. Mögliche Endwirte sind in allen Fällen Wasservögel und für Diplostomum sp. auch Reihervögel und andere Fisch fressende Vögel. Einen Sonderfall stellt Plagiorchis sp. dar. Dieser Trematode trat in den Jahren 2001 und 2002 in Weiher J1 nicht auf, stellte aber dann ab Juli 2003 die nach O. ranae häufigste Art, wobei die Infektionsrate im Juli sogar leicht höher als bei O. ranae war. Es ist ausgesprochen interessant, das dieser Parasit zunächst nicht anzutreffen war, nachdem im Winter 2002 / 2003 ein Großteil der Schneckenpopulation nicht überlebte, aber in der neuen Schneckengeneration mit 7,2 % 10 % durchaus hohe Infektionsraten erreichte. Zum besseren Verständnis der nachfolgenden Ausführungen sei an dieser Stelle auf das Kap. 5.8 verwiesen, in dem allgemeine Voraussetzungen für das erfolgreiche Zustandekommen trematodischer Infektionen in den Zwischenwirten erläutert werden. Beim Aufstellen einer Hypothese, die das plötzliche Auftreten von Plagiorchis sp. im Jahr 2003 erklärt, ist von entscheidender Bedeutung, dass durch den strengen Winter 2002 / 88