und eine Verlaufsstudie Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

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1 Aus dem Institut für Biochemie der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen Nürnberg Lehrstuhl für Biochemie und Pathobiochemie: Prof. Dr. M. Wegner und Aus der Chirurgischen Klinik mit Poliklinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen Nürnberg Direktor: Prof. Dr. med. Dr. h.c. W. Hohenberger Thymosin! 4 in postoperativer Wundflüssigkeit eine Verlaufsstudie Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Sabine Bodendorf aus Freiburg i. Br.

2 Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler Referent: Prof. Dr. I. Schneider Korreferent: Prof. Dr. E. Hannappel Tag der mündlichen Prüfung:

3 Thymosin! 4 in postoperativer Wundflüssigkeit eine Verlaufsstudie Sabine Bodendorf Zusammenfassung Einleitung Wundheilung Formen der Wundheilung Primäre Wundheilung Sekundäre Wundheilung Phasen der Wundheilung Hämostase Zelluläre Hämostase Plasmatische Hämostase Exsudative Phase Proliferative Phase Reparative Phase Therapeutische Ansätze der Wundheilung Thymosine Historie der Thymosine !-Thymosine Thymosin! Funktion von Thymosin! Interaktion von Thymosin! 4 mit G-Aktin Einfluss von Thymosin! 4 auf die Wundheilung Problemstellung Stand der Forschung Zielsetzung der Arbeit Konzept der Studie Patientenauswahl Beobachtungsdauer Beobachtungsparameter Material und Methoden Verwendete Geräte Analytische bzw. präparative HPLC Sonstige Geräte Verwendete Substanzen Verwendete Puffer Methoden Probenvorbereitung Proteinbestimmung mittels der Biuret-Methode Fotometer... 28

4 Prinzip der Proteinbestimmung Durchführung !-Thymosin-Bestimmung mittels analytische Reverse-Phase HPLC Reverse-Phase HPLC Probenvorbereitung Durchführung Berechnung Ergebnisse der Probenanalysen Längsschnittauswertung Einzelpatienten Überblick Thoraxpatienten Lungenpatienten Ösophaguspatienten Abdomenpatienten Kolorektalpatienten Parenchymatöse Organe Leber Pankreas Querschnittsauswertung Patientenkollektiv Überblick Verlaufswerte Potenzielle Einflussfaktoren und Differenzierungsansätze Interpretationsansätze und Diskussion der Ergebnisse Allgemeine Merkmale Geschlecht Alter BMI Lebensgewohnheiten Nikotinkonsum Alkoholkonsum Operation und stationärer Aufenthalt Operationsdauer Blutigkeit des Sekrets Postoperative Komplikationen Organ Lokalisation Diagnose Zusammenfassung und Ausblick...76 Abbildungsverzeichnis...78 Tabellenverzeichnis...78 Abkürzungsverzeichnis...86 Anlagenverzeichnis...88 Danksagung Lebenslauf...123

5 1 Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Das Peptid Thymosin! 4 als wichtiger Einflussfaktor bei der Wundheilung ist in neuerer Zeit verstärkt ins Blickfeld gerückt. Bisherige Untersuchungen fanden weitgehend an Tieren statt. Die bekannteste Arbeit zu Thymosin! 4 in menschlicher Wundflüssigkeit wird sehr kontrovers diskutiert. Es wurden keine zellfreien Wundsekrete verwendet und somit verfälschte Thymosin! 4 Konzentrationen gemessen. Die vorliegende interdisziplinäre Arbeit (Chirurgie und Biochemie) dokumentiert einen neuen Ansatz der Thymosin! 4 Bestimmung. Die Arbeit konzentriert sich zum einen auf die Untersuchung von Thymosin! 4 ausschließlich in der Wundflüssigkeit. Zum anderen hat sie zum Ziel den Zeitverlauf der Thymosin! 4 Konzentration in postoperativ gewonnener Wundflüssigkeit systematisch und fundiert zu analysieren. Methoden Es wird ein Patientenkollektiv von 20 Personen mit operativen Eingriffen untersucht. Die quantitative Bestimmung von Thymosin! 4 und Protein erfolgt einheitlich ab dem Zeitpunkt der Operation über einen definierten Zeitraum von 72 Stunden. Das Sekret wird nach einem festgelegten verbindlichen Zeitschema entnommen und für weitere Untersuchungen aufbereitet. Die Messwerte aus ca Proben bilden die Datenbasis für Zeitverlaufanalysen und Differenzierungen nach Patienten- bzw. Fallmerkmalen. Das Wundsekret wird unmittelbar aus der Wund-Drainage gewonnen, Zellen und Gewebereste werden unverzüglich abzentrifugiert. Die Bestimmung des Thymosin! 4 Gehaltes erfolgt ohne zeitliche Verzögerung mittels Reverse-Phase High-Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC). Der Protein-Gehalt wird photometrisch ermittelt. Diese Methodik ermöglicht eine erstmalige systematische Verlaufsstudie auf der Basis zellfreier Wundflüssigkeiten. Ergebnisse und Beobachtungen Die Arbeit kann keine statistisch gesicherten, endgültigen Aussagen treffen, jedoch Auffälligkeiten aufzeigen und potenzielle Zusammenhänge aufdecken. So zeigt sich u. a. ein enger Zusammenhang zwischen dem Verlauf der Thymosin! 4 und Proteinkonzentrationen. Beide Konzentrationen weisen einen Anstieg in den ersten postoperativen Stunden auf und erreichen nach Abfall ein Plateauniveau. Bei der

6 2 Betrachtung weiterer Parameter, wie zum Beispiel Blutigkeit des Sekrets, postoperativ erhöhte Entzündungszeichen, betroffenes Organ und Art der Diagnose, scheint sich ein differenzierender Einfluss auf die Thymosin! 4 Konzentration zu ergeben. Die Blutigkeit korreliert mit der Höhe an Thymosin! 4. Postoperative Zeichen eines Infekts gingen mit einem Anstieg der Thymosin! 4 Konzentration einher. Bei Operationen an der Lunge, des Ösophagus und der Leber wurden mehr als doppelt so hohe Thymosin! 4 Konzentrationen gemessen wie bei Eingriffen an Pankreas und im kolorektalen Bereich. Darüber hinaus lagen die Maximalkonzentrationen an Thymosin! 4 bei Tumoroperationen durchschnittlich um ca. 30 % höher als bei Nicht-Tumor-Eingriffen. Praktische Schlussfolgerungen Die Untersuchungsergebnisse der vorliegenden Arbeit unterstützen die These eines Zusammenhangs zwischen Thymosin! 4 und der Wundheilung. Dies legt die Vermutung nahe, dass mit diesem Peptid der Wundheilungsprozess auch aktiv beeinflusst werden könnte. Bei näherer Analyse dieses Zusammenhangs zeigen sich Differenzierungspotenziale. Zum Beispiel finden sich bei Tumorwunden andere Thymosin! 4 Konzentrationen und Verläufe als bei sonstigen Wunden. Die Erforschung möglicher Ursachen eröffnet ein weites Feld für Folgeuntersuchungen.

7 3 Abstract Background and Objectives In the recent past the peptide thymosin!4 has received high attention as an influencing factor for wound healing. Previous research mainly focused on animals. The best known study concerning thymosin!4 in human wound fluid led to very controversial discussions. No cell-free wound fluid was used and therefore adulterated concentrations of thymosin!4 were measured. The presented interdisciplinary study (surgery and biochemistry) documents a new approach for thymosin!4 determination. Firstly, thymosin!4 is analysed exclusively in wound fluid. Secondly, the study aims to analyse the variation in time of thymosin!4 concentration in postoperatively gained wound fluid through a systematic and sound procedure. Method A community of 20 patients with surgical interventions is investigated. Thymosin!4 and protein concentrations are analysed systematically over a defined period of 72 hours after the operation. Wound fluids are collected following a predefined time schedule and prepared for further exploration. The measured values stemming from about 1200 samples form the data base for longitudinal and differential analysis considering patient or case characteristics. Wound fluids are gained directly from the wound drainage, cells and tissue are isolated by centrifugation instantaneously. The concentration of thymosin!4 is measured without delay using reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC). The amount of protein is determined by photometric analysis. Results The study cannot give statistically proven, final evidence, but depicts supposable interdependencies and peculiarities. For example it shows a positive correlation between the concentration of thymosin!4 and the protein concentration along the timeline. Both concentrations increase in the first postoperative hours and reach a plateau level after a clear decline. Regarding other parameters, as for example the sanguinariness of the wound fluid, postoperative increased inflammation marks, concerned organ and type of diagnosis, it seems that those parameters have a differentiating effect on the concentration of thymosin!4. The sanguinariness correlates with the amount of

8 4 thymosin!4. Postoperative signs of infection come along with an increasing concentration of thymosin!4. With operations concerning lung, oesophagus and liver, twice as much concentration of thymosin!4 are detected as with operations concerning pancreas and colorectal field. Beyond that, the maximum concentration of thymosin!4 in tumour operations are about 30 % higher as in non-tumour operations. Conclusions The research results of the presented study support the thesis of a close interrelation between thymosin!4 and wound healing. This fuels the supposition that the wound healing process can be actively influenced by this peptide. An in-depth analysis leads to differentiated aspects of interrelation. For example, thymosin!4 concentrations vary in quantity and devolution, looking at tumour wounds on the one hand and other wounds on the other hand. The investigation of possible causes opens a wide field for further research challenges.

9 5 1. Einleitung 1.1 Wundheilung Wundheilung ist von zentralem Interesse in der Chirurgie und Voraussetzung für die chirurgische Therapie. Das folgende Kapitel gibt einen Überblick über die komplexen Vorgänge der Wundheilung. Nach einer kurzen Einführung der Arten der Wundheilung (vgl. Berchtold, 2006) liegt der Schwerpunkt auf der Betrachtung der Wundheilungsphasen. Eine Wunde ist durch die Durchtrennung oder Schädigung der Haut definiert. Der Organismus ist bestrebt, eine Wunde so schnell wie möglich und unter minimalem Funktionsverlust zu verschließen. Ziel ist die Wiederherstellung der Integrität mit größtmöglicher mechanischer Stabilität. Leider gelingt eine vollständige Regeneration der Haut nur selten. Sie findet sich meist nur bei oberflächlichen Verletzungen, die lediglich bis in das Korium reichen. Der Defekt wird durch ortsständiges Gewebe ersetzt und es kommt zu einer narbenlosen Ausheilung. Da das ursprüngliche Gewebe morphologisch und funktionell vollständig wiederhergestellt ist, nennt man dies, restitutio ad integrum. Betrifft die Verletzung tiefere Schichten ist eine Regeneration nicht mehr möglich. Man spricht von Reparation. Bei der Reparation kommt es zur Narbenbildung. Das defekte Gewebe wird durch unspezifisches Bindegewebe ersetzt. Es kommt weder morphologisch noch funktionell zu einer vollständigen Wiederherstellung des ursprünglichen Gewebes. Man bezeichnet dies als Defektheilung. In der Regel erfolgt die Wundheilung durch Reparation Formen der Wundheilung Primäre Wundheilung Unter einer primären Wundheilung (per primam intentionem) versteht man den unkomplizierten Heilvorgang nicht infizierter, gut adaptierter Wunden. Durch die Adaptation der Wundränder verkleben diese und bilden eine minimale bindegewebige

10 6 Narbe. Der Heilungsvorgang ist innerhalb weniger Tage beendet. Ein Beispiel ist die primäre Hautnaht oder die Wundheilung nach Hautinzision bei aseptischen Eingriffen Sekundäre Wundheilung Von einer sekundären Wundheilung (per secundam intentionem) spricht man dagegen, wenn der Heilungsprozess gestört ist. Im Gegensatz zur primären Wundheilung wird bei der sekundären Wundheilung der Gewebsdefekt durch die Neubildung von Granulationsgewebe überbrückt. Die Wunde zieht sich erst sekundär zusammen. Es entsteht eine breite Narbe. Diese Art der Wundheilung dauert Wochen und kann sowohl lokale (Infekt, mangelnde Durchblutung etc.) wie auch systemische Ursachen (Diabetes mellitus, Immunsuppression etc.) haben. Ein Beispiel hierfür ist die Defektheilung Phasen der Wundheilung Die Wundheilung ist ein komplex dynamischer und interaktiver Prozess und wird durch eine Vielzahl von Mediatoren gesteuert. Es können vier Phasen, die zeitlich überlappend auftreten, unterschieden werden (Cohen et al., 1992; Clark, 1996; Lawrence, 1998; Arumugam et al., 1999; Singer and Clark, 1999): 1. Hämostase (erste Stunden) 2. Exsudative Phase ( Tag) 3. Proliferative Phase ( Tag) 4. Reparative Phase (24. Tag bis 1 Jahr) Hämostase Allgemein sind bei der Blutstillung Thrombozyten, das Gefäßendothel, das Gewebe außerhalb des Gefäßes sowie im Blutplasma enthaltene Gerinnungsfaktoren beteiligt. Man unterscheidet eine zelluläre und eine plasmatische Hämostase. Ziel ist die Bildung eines Thrombus.

11 Zelluläre Hämostase Ausgangspunkt jeder Wundheilung ist eine Störung des Blutflusses. Das Endothel der Gefäße wird verletzt und die Kollagenfasern des Subendothels werden freigelegt. Thrombozyten wandern ein und binden an den im Subendothel lokalisierten von Willebrand-Faktor (vwf). Hierzu dient der GIb- Rezeptor. Es handelt sich dabei um ein an der Thrombozyten-Membran gebundenes Glykoprotein. Nun treten mehrere adhärierte Thrombozyten zusammen und aggregieren (Wahl and Wahl, 1992). Dieses Thrombozyten-Aggregat bildet den ersten provisorischen Wundverschluss ( weißer Thrombus ). Hier endet die zelluläre Hämostase. Der weiße Thrombus ist nicht allzu stabil und kann weggeschwemmt werden. Einen festeren Verschluss bildet die Plasmatische Hämostase Plasmatische Hämostase Fast gleichzeitig zur Adhäsion und Aggregation der Thrombozyten wird die Blutgerinnung eingeleitet. An der Blutgerinnung sind 13 Gerinnungsfaktoren beteiligt. Sie liegen in einer Vorstufe als inaktive Proenzyme oder Zymogene vor und werden mit römischen Zahlen von I bis XIII bezeichnet. Nach der Zymogen Aktivierung bewirkt der jeweils aktivierte Faktor kaskadenförmig die Aktivierung des nächsten Faktors. Die Gerinnungskaskade kann über das endogene oder über das exogene System aktiviert werden (vgl. Abbildung 1). Die gemeinsame Endstufe stellt die Bildung des Faktor Xa- Komplexes dar. Dieser Komplex bewirkt die Umwandlung von Prothrombin (Faktor II) in seine aktive Form Thrombin (Faktor IIa). Durch die Faktoren IIa und XIIIa wird Fibrinogen in vernetztes Fibrin umgewandelt.

12 8 Abbildung 1: Gerinnungskaskade Die Bildung dieses Fibringerinnsels gilt als gemeinsame Endstufe der endogenen und exogenen Gerinnungskaskade. Der erste durch Thrombozyten-Aggregation gebildete Wundverschluss wird stabilisiert. Da in das Maschenwerk aus mechanisch stabilem Fibrin, neben Thrombozyten auch Erythrozyten eingefangen werden, spricht man von einem roten Thrombus. Er bildet die erste Matrix für das spätere Einwandern von Zellen (Body, 1996; Ruggeri, 1997) Exsudative Phase Die Bezeichnung stammt vom lateinischen Begriff exsudat - austretende Flüssigkeit. Reinigungs-, Inflammations- oder Entzündungsphase sind Synonyme für diese Phase der Wundheilung. Durch die Degranulation der aggregierenden Thrombozyten ("-Granula) werden eine Reihe von Mediatoren freigesetzt. Neben dem Fibronectin, Fibrinogen, Thrombospondin und dem von Willebrand-Faktor, welche der weiteren Adhäsion und Aggregation von Thrombozyten dienen, werden auch zahlreiche Wachstumsfaktoren freigesetzt. Ihre wichtigsten Vertreter sind PDGF (platelet derived growth factor), EGF (epidermal growth factor), IGF-I (insulin like growth factor I) und TGF-! (transforming growth factor!). Sie wirken chemotaktisch auf Fibroblasten und Entzündungszellen die

13 9 dann ins Wundgebiet migrieren. Dies stellt den eigentlichen Beginn der entzündlichen Reaktion dar (Singer and Clark, 1999; Lawrence 1998). Die Kapillaren werden weiter und durchlässiger. Die Flüssigkeitsverschiebung vom intra- in den extrazellulären Raum führt zu der makroskopisch sichtbaren Schwellung und Rötung, die diese Phase der Wundheilung charakteristisch ist. Fremdkörper und Keime werden durch das Wundsekret aus der Wunde herausgeschwemmt. Zusätzlich ermöglicht die erhöhte Permeabilität der Gefäßwände den Eintritt von Entzündungszellen in das Wundgebiet. Neutrophile Granulozyten dominieren das histologische Bild. Sie beseitigen Zelltrümmer, Fremdkörper und Bakterien. Sie sezernieren proinflammatorische Zytokine und weisen eine deutlich gesteigerte Phagozytose auf. Es kommt zur Invasion von Monozyten. Sie werden durch Wachstumsfaktoren aktiviert und wandeln sich in so genannte Makrophagen um. Die wundreinigende Wirkung der Makrophagen beruht auf der Ausschüttung von proteolytischen Enzymen wie Elastase, Kollagenase und Kathepsin B. Zusätzlich sind sie die Hauptproduzenten von inflammatorischen Zytokinen wie IL-1 und TNF-" und Wachstumsfaktoren wie EGF, PDGF und TGF-! und aktivieren T-Lymphozyten zur zellvermittelten Immunantwort (Singer and Clark, 1999; Lawrence 1998). Neben der spezifischen Immunabwehr findet auch eine unspezifische Immunantwort über Aktivierung des Komplementsystems statt. Das Komplementsystem besteht aus ungefähr 20 Proteinen. Der mengenmäßig überwiegende Komplementfaktor C3 setzt durch seine Spaltung die Komplementbindungsreaktion in Gang. Die aus der Spaltung resultierenden kleineren Proteine C5a und C3a wirken gefäßerweiternd und locken weitere Entzündungszellen ins Wundgebiet (Yancey et al., 1985). Die von den eingewanderten Entzündungszellen (Granulozyten und Makrophagen) freigesetzten Zytokine und Wachstumsfaktoren spielen bei der Neubildung von Bindegewebe und der Proliferation von Fibroblasten, Keratinozyten und Endothelzellen eine große Rolle. Es entsteht eine neue extrazelluläre Matrix, bestehend aus Fibronektin, Hyaluronsäure und Glucosaminoglykanen. Sie bildet ein Netz durch den Thrombus, an dem die Fibroblasten und Endothelzellen entlang wachsen (Postlethwaite et al., 1981). Bis zum dritten Tag nach Entstehung der Wunde nimmt die Gefäßproliferation stark zu. Es bilden sich die ersten Kapillarsprossen. Der vermehrte Aufbau leitet in die proliferative Phase der Wundheilung über.

14 Proliferative Phase Während der proliferativen Phase bildet sich das Granulationsgewebe. Es kommt zur Kollagenbildung, Epithelialisierung und anschließender Kontraktion der Wunde. Die meisten Zellen im Wundmilieu weisen eine hohe mitotische Aktivität auf. Die eingewanderten Fibroblasten sind hochaktiv und synthetisieren neben großen Mengen an Kollagen Typ I und III weitere Matrix-Moleküle und verschiedene Mediatoren (Clark, 1993). Zu Beginn der Kollagensynthese bilden die Fibroblasten aus Aminosäuren (Glycin, Prolin usw.) das Protokollagen. Dieses wird hydroxyliert und nach einem weiteren Schritt als Prokollagen aus der Zelle geschleust. Die extrazelluläre Synthese des Kollagens erfolgt wiederum über mehrere Stufen und ist entscheidend für die Stabilität des neu gebildeten Gewebes. Noch liegen die Kollagenfasern in einem ungeordneten Zustand vor. Ihre endgültige Anordnung erfolgt erst in der letzten Phase der Wundheilung, der reparativen Phase. Der Wunddefekt wird nun zunehmend mit Granulationsgewebe aufgefüllt. Die Epithelialisierung beginnt. Hand in Hand mit der zellreichen Auffüllung eines Wunddefektes geht der Abbau des Fibringerinnsels durch Umwandlung des Plasminogen zu Plasmin und damit einsetzender Fibrinolyse einher. Die Hauptbestandteile des Granulationsgewebes bilden Elastin und Hyaluronsäure. Das extrem hydrophobe Protein Elastin verleiht dem Granulationsgewebe elastische Eigenschaften. Das Polysaccharid Hyaluronsäure nimmt große Mengen an Wasser auf. Dies führt zu einer Quellung des Granulationsgewebes und begünstigt die Zellmigration. Das Granulationsgewebe kann sich nur zeitgemäß entwickeln, wenn keine allgemeine und örtliche Mangelernährung bzw. Mangeldurchblutung und keine Stoffwechselerkrankungen das Wachstum behindern. Durch Einsprossung zahlreicher Haarkapillaren in das Granulationsgewebe wird die Angiogenese eingeleitet. Die gebildeten Thromben dienen als provisorische extrazelluläre Matrix und als Leitschiene für eine Einwanderung von Fibroblasten, Makrophagen und Endothelzellen. Die Angiogenese gewährt dem neu gebildeten Granulationsgewebe eine ausreichende Versorgung mit Substraten. Für die Gefäßneubildung im Wundgebiet ist die Präsenz von Makrophagen notwendig. Sie dienen unter anderem als Hauptproduzenten der für die Angiogenese wichtigen Wachstumsfaktoren (TGF-ß, bfgf, EFG und GM-CSF), Zytokine und proteolytischen Enzyme (Hunt et al., 1984). Außerdem sind die Wechselwirkungen zwischen

15 11 Endothelzellen und Bestandteilen der extrazellulären Matrix, wie Fibrin, Fibronectin und Hyaluronsäure von Einfluss auf die Angiogenese (Iruela-Arispe and Dvorak, 1997). Für die Ausbildung von größeren Gefäßen werden die Endothelzellen der Mikrogefäße aktiviert. Die aktivierten Endothelzellen schütten proteolytische Enzyme aus, welche die Basalmembran abbauen und wandern in das Wundgebiet. Nach erfolgter Teilung bilden sie tubenförmige Gebilde aus, die sich dann zu Venolen oder Arteriolen differenzieren. Vorgänge der Wundkontraktion und Narbenbildung werden eingeleitet. An den Wundrändern kommt es zu einer Differenzierung von Fibroblasten zu Myofibroblasten. Dies erfolgt durch Bildung von kontraktilen Aktinfilamenten, welche die Ähnlichkeit der Myofibroblasten zu Zellen der glatten Muskulatur erklären (Gabbiani et al., 1971). Durch die Kontraktion der Aktinfilamente der Myofibroblasten wird das Gewebe zusammengezogen. Die Myofibroblasten treten mit den Kollagenfasern in Kontakt, die Kollagenfasern werden aufgerichtet und die Wundfläche verkleinert. Gleichzeitig beginnt sich die Wunde an der Oberfläche durch Epithelisation zu schließen. Die am Wundrand befindlichen Keratinozyten lösen ihre Desmosomen auf, die sie in ihrem Verband halten, und migrieren unter Einfluss von KGF (keratinocyte growth factor) und EGF in Richtung Wundgebiet. Die Migration erfolgt durch Bindung über Integrine an die am Wundgrund befindlichen Plasmaproteine Fibronectin und Vitronectin. Wachstumsfaktoren und Zytokine steuern die weitere Migration und Proliferation der Keratinozyten (Stenn and Malhotra, 1992; Woodley, 1996). Zusätzlich steuern sie die Neubildung der Basalmembran mit der sich die Keratinozyten über Hemidesmosomen verbinden. Mit Kollagenfibrillen des Typs VII wird eine Verbindung zu dem darunter liegenden Granulationsgewebe hergestellt (Uitto et al., 1996). Nun ist die Wiederherstellung aller Hautschichten nahezu abgeschlossen. Es folgt die reparative Phase Reparative Phase Die letzte und längste Phase der Wundheilung ist die reparative Phase. Sie kann ein Jahr dauern und beginnt definitionsgemäß nach der vollständigen Epithelialisierung. Im Verlauf nehmen Zell-, Kapillar- und Proteoglykangehalt der Wunde zugunsten des Kollagengehalts ab.

16 12 Die Umbildung der Architektur der extrazellulären Matrix findet durch Proteasen statt (Mignatti et al., 1996). Keratinozyten, Makrophagen und Fibroblasten regen die Produktion von Enzymen an. Der Abbau des Fibronectins und der Hyaluronsäure wird durch Hydrolasen eingeleitet. Zugleich findet eine Hinunterregulierung der Proliferation von Fibroblasten statt. In dieser Phase herrscht ein reger Auf- und Abbau von Kollagensträngen. Der Abbau wird durch spezielle Proteasen, die Matrixmetalloproteinasen (MMPs) gesteuert. Bis heute wurden mehr als 25 verschiedene MMPs identifiziert. Sie werden von Zellen, die am Reparaturprozess beteiligt sind (Fibroblasten, Makrophagen und Keratinozyten), sezerniert. Dabei ist die Menge und Art der MMPs zelltypisch. MMP-2 findet sich hauptsächlich in Fibroblasten, MMP-9 dagegen hauptsächlich in Keratinozyten und in Monozyten/Makrophagen (Philp et al., 2006). Kollagenstränge des Typs I, II, XIII und X werden von der interstitiellen Kollagenase (MMP-1) abgebaut. Die Gelatinase A (MMP-2) baut denaturierte Kollagenstränge und Kollagenstränge des Typs IV und V ab. Kollagene des Typs II, IV, V, VII, IX, Proteoglykane und Glykoproteine werden durch Stromelysin-1 (MMP-3) abgebaut. Die Aktivierung der verschiedenen Matrixmetalloproteasen ist in zeitlicher Reihenfolge konkret festgelegt und beeinflusst somit die Struktur des neu gebildeten Gewebes (Arumugam et al., 1999). Spezielle Inhibitoren, die tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs), regulieren zusätzlich die Aktivität der Matrixmetalloproteasen. Der Gehalt an MMPs und TIMPs unterliegt einem freien Gleichgewicht. Eine ungünstige Verschiebung des Gleichgewichts hat eine Störung im Wundheilungsverlauf zur Folge (Vaalamo et al., 1999). Mit dem Fortschreiten der reparativen Phase steigt die Reißfestigkeit der Wunde durch den zunehmenden Kollagengehalt. Das Kollagen reift zum Kollagen Typ I aus. Die anfänglich ungerichtete Faserstruktur beginnt sich zu ordnen und nimmt eine der mechanischen Beanspruchungen entsprechende Verlaufsrichtung an, so dass die Belastbarkeit der Wunde deutlich zunimmt. Durch zusätzliche Quervernetzung der primär parallel orientierten kollagenen Fasern und durch Verminderung der Zelldichte erlangt die Wunde zusätzlich mechanische Stabilität. Die Menge an Proteoglykanen in der extrazellulären Matrix nähert sich dem ursprünglichen Gehalt. Der Wassergehalt des Gewebes nimmt ab, die anfänglich das Hautniveau gering überstehende Narbe schrumpft regelhaft auf Hautniveau. Auch nimmt der Gefäßreichtum des Narbengewebes ab (Lawrence, 1998; Singer and Clark, 1999). Die ursprünglich frisch rote Narbe wird weiß. Da keine elastischen Fasern gebildet werden, verfügt das

17 13 Narbengewebe über keine Elastizität und ist unvermeidbar minderwertig, weswegen in der Therapieplanung eine minimale Narbe angestrebt wird Therapeutische Ansätze der Wundheilung Leider verläuft die Wundheilung in der Praxis nicht immer so reibungslos. Chronische Wunden und Wundheilungsstörungen sind klinischer Alltag. Die Ursachen sind vielfältig und reichen von Mikrozirkulationsstörungen über Wundinfektion bis zu einer gestörten Stoffwechsellage (z.b. bei Diabetes mellitus). In der Medizin gibt es kaum ein anderes Feld, auf dem so viele unterschiedliche und kontrovers diskutierte Therapieformen angeboten werden wie zur Behandlung chronischer Wunden. Für die Wundbehandlung ist das Verständnis der Wundheilung essentiell. Mit zunehmendem Verständnis über die einzelnen Zusammenhänge der Wundheilungsmechanismen entstanden neue viel versprechende Therapieansätze. Da eine chronische, nicht heilende Wunde ein Defizit oder Ungleichgewicht an fast allen Wachstumsfaktoren hat, ist ein mögliches Therapiekonzept die topische Applikation von Wachstumsfaktoren. Zurzeit in Untersuchung befinden sich der gentechnologisch hergestellte Wachstumsfaktor PDGF-BB (Smiell et al., 1999) und der epidermal growth factor EGF (Tsang et al., 2003). Beide zeigen positive Ergebnisse bei der Behandlung diabetischer Ulzera. Ein weiterer Therapieansatz stellt die Gewinnung eines Wachstumsfaktorengemisches aus den "-Granula dar (Knighton et al., 1990). Des Weiteren könnte eine Kombination unterschiedlicher Wachstumsfaktoren und anderer Wundheilung unterstützende Stoffe den Prozess noch stärker stimulieren. In diesem Zusammenhang wurde die besondere Wirkung von Thymosin! 4 auf die Wundheilung 1999 durch Malinda et al. untermauert. Ihre Untersuchungen zeigten, dass Thymosin!4 die Wundheilung bei Ratten, älteren Mäusen und Mäusen mit Diabetes mellitus unterstützt. Durch die topische oder intraperitoneale Gabe von Thymosin!4 trat eine um 61 % verbesserte Reepithelialisierung (gemessen an der Verkleinerung der Wundfläche) innerhalb von sieben Tagen nach einer Schnittverletzung ein. Außerdem konnte in der Wunde eine Stimulation der Migration von Endothelzellen und Keratinozyten, eine Steigerung der Proteaseaktivität und eine erhöhte Kollagendeposition und Angiogenese festgestellt werden. Im Jahr 2002 wird berichtet, dass durch Applikation von einigen Mikrogramm Thymosin!4 auf eine von Lauge verätzte Hornhaut von Mäusen sich deren Heilung verbesserte (Sosne, 2002).

18 14 Fundierte und systematische Thymosin!4 Untersuchungen am Menschen sind jedoch bislang kaum bekannt. Zumindest der Mangel an Veröffentlichungen deutet darauf hin. Dieses Peptid ist erst seit kürzerer Zeit ins Blickfeld gerückt und erste Untersuchungen fanden weitestgehend an Tieren statt. Es kann vermutet werden, dass dieses Peptid bei der Wundheilung des Menschen auch eine wichtige Rolle spielt. Die vorliegende Arbeit leistet einen Beitrag, tiefer gehende Kenntnisse über diese Rolle zu gewinnen. 1.2 Thymosine Historie der Thymosine Der Thymus (auch Thymusdrüse) ist ein primäres, von einer Kapsel umschlossenes zweilappiges Organ des lymphatischen Systems und dient der Primärentwicklung der T-Lymphozyten. Er befindet sich im Mediastinum oberhalb des Herzens. Die größte Ausdehnung erreicht der Thymus zwischen dem 9. und 12. Lebensjahr. Er ist von grundlegender Bedeutung für die zellvermittelte Immunität. Im Thymus werden Thymozyten, so genannte Prä-T-Lymphozyten, in T-Lymphozyten umgewandelt. Die T-Lymphozyten-Vorläufer wandern aus dem Knochenmark über die Blutbahn in die Läppchenrinde ein. Sie durchlaufen das Läppchen von außen nach innen und machen dabei eine Reifung durch. Nach der Ausbildung eines umfangreichen Reservoirs an immunkompetent gewordenen T-Lymphozyten ist der Thymus nicht mehr notwendig. Mit Einsetzen der Pubertät bildet sich der Thymus zurück (Involution). Er wird nach und nach durch funktionsloses Fettgewebe ersetzt, so dass beim Erwachsenen nur noch ein Thymusrestkörper bzw. retrosternaler Fettkörper übrig bleibt (Rohen und Lütjen- Drecoll, 2001). Die Erforschung der Thymusdrüse begann in den frühen 60er Jahren. Mäusen und Kaninchen wurde umgehend nach ihrer Geburt der Thymus entfernt. Die thymektomierten Tiere zeigten eine Wachstumsretardierung und eine Störung in der Reifung und Entwicklung des lymphatischen Systems mit daraus resultierender Immunschwäche (Good et al., 1962). In den darauf folgenden Jahren wurde vermehrt auf diesem Gebiet geforscht. Die Verabreichung von zellfreien Thymusextrakten an immungeschwächten Krebspatienten (Lipson et al., 1979) und immundefizienten

19 15 Mäusen (Dauphinee et al., 1974) führte zu einer teilweisen Regeneration des Immunsystems. Das Interesse richtete sich nun speziell auf die Faktoren der Thymusdrüse, die für die Kommunikation zwischen Thymus und Immunabwehr zuständig waren. Zur Identifizierung der verantwortlichen Faktoren wurde die Präparation aus Kälberthymus entwickelt und standardisiert (Goldstein et al., 1972). Die Präparation bestand ursprünglich aus fünf Schritten. Das Extrakt wurde mit dem Namen Thymosin Fraktion 5 (TF5) versehen. Sie beschreibt keine funktionelle oder sequenzverwandte Proteinfamilie, sondern eine durch eine Präparationsprozedur definierte Peptidgruppe. Thymosin Fraktion 5 umfasst 30 bis 40 Polypeptide mit einem Molekulargewicht zwischen 1 und 15 kda. Die Einteilung der Thymosine erfolgt in Abhängigkeit ihres isoelektrischen Punktes. Demnach werden Thymosine mit einem isolektrischen Punkt kleiner als ph 5 als "-Thymosine, zwischen ph 5 und ph 7 als!-thymosine und über ph 7 als #-Thymosine bezeichnet (Goldstein, 1977). Die weiter gehende Benennung der Thymosine erfolgte gemäß ihrer chronologischen Isolierung unabhängig von einer Funktion !-Thymosine Die!-Thymosine unterscheiden sich voneinander durch ihre Aminosäuresequenz (Abb. 2, Huff et al., 2001):

20 16 Abbildung 2: Aminosäuresequenz der!-thymosine Das erste aus dieser Familie isolierte Peptid war das Polypeptid! 1, das zunächst auch als Thymosin! 1 bezeichnet wurde. Untersuchungen ergaben, dass es sich bei dem aus 74 Aminosäuren bestehendem Polypeptid um ein Fragment von Ubiquitin handelt, an dessen C-Terminus zwei Glycin-Reste fehlen (Low and Goldstein, 1985). Die Sequenzen von Thymosin! 2 und! 3 sind nicht publiziert. Die Isolation von Thymosin! 4 erfolgte mittels gewöhnlicher Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltration (Low and Goldstein, 1982). Im weiteren Verlauf wurden weitere!-thymosine sowohl aus Wirbeltieren wie auch aus wirbellosen Tieren isoliert. Es zeigten sich hohe Übereinstimmungen in der Aminosäuresequenz mit Thymosin! 4 (vgl. Tabelle 1, Huff et al., 2001). Bisher wurden 15!-Thymosine identifiziert. Sie bilden eine Familie hochkonservierter, polarer, etwa 5 kda großer Peptide mit 40 bis 44 Aminosäuren (Huff et al., 2001). Alle!-Thymosine sind am N-Terminus acetyliert. Tabelle 1 zeigt, dass pro Spezies häufig zwei!-thymosine vorkommen. In humanen Zelllinien konnten zelltyp- und entwicklungsabhängig Thymosin! 4,! 10 und! 15 nachgewiesen werden. Hierbei stellt Thymosin! 4 das Hauptpeptid dar. Für die Existenz von Thymosin! 10 in

21 17 menschlichen Leukozyten gibt es noch keine sicheren Ergebnisse (Hannappel and van Kampen, 1987). Thymosin! 15 wurde in menschlichen Prostatakrebszellen als Marker für ein hohes Metastasierungsrisiko nachgewiesen (Chakravatri et al., 2000). Die Tatsache, dass die!-thymosine über einen langen Evolutionszeitraum unverändert geblieben sind, deutet auf eine zentrale biologische Rolle dieser Peptide. Tabelle 1: Thymosine bei verschiedenen Spezies Spezies Erstes Peptid Zweites Peptid Drittes Peptid Mensch! 4! 10! 15 Ratte! 4! 10! 15 Maus, Katze! 4! 10 Kalb! 4! 9 Hase! 4 Ala! 10 Schwein, Schaf! 4! 9 Met Pferd, Huhn, Gecko! 4 Krallenfrosch (Xenopus laevis) Regenbogenforelle! 11! 12! 4 Krallenfrosch Barsch! 12 Barsch Wal! 4! 13 Seeigel (Arbacia punctulata) Essbarer Seeigel (Echinus esculentus) Muschel Zebrafisch! Seeigel! 14! Muschel! Zebrafisch

22 Thymosin! 4 Wie schon erwähnt, stellt Thymosin! 4 den wichtigsten Vertreter der die!-thymosine für den Menschen dar und wurde 1981 ausgehend von der Thymus Fraktion 5 isoliert (Low and Goldstein, 1982). Man fand heraus, dass Thymosin! 4 die terminale Desoxynucleotidtransferase in Thymozyten von immunreprimierten Mäusen induziert (Low et al., 1981), die Migration von Makrophagen inhibiert (Thurman et al., 1984) und die Sekretion von LH-Releasing-Hormon (LH-RH) stimuliert (Rebar et al., 1981). Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde das Polypeptid anfänglich für ein Hormon gehalten. Des Weiteren befasste man sich mit der Verteilung von Thymosin! 4 in humanen Zelllinien (Hannappel and Leibold, 1985), Blutzellen (Hannappel and van Kampen, 1987) und in Geweben anderer Säugetieren wie Ratte und Maus (Hannappel et al., 1982). Die Untersuchungen zeigten, dass das Peptid fast ubiquitär, in allen untersuchten Geweben und Zelltypen, mit Ausnahme von Erythrozyten (Goodall et al., 1983; Hannappel et al., 1982; Hannappel and Leibold, 1985; Hannappel and van Kampen, 1987), vorkommt und somit eine hormonelle Funktion eher unwahrscheinlich ist. Tabelle 2 zeigt die Verteilung von Thymosin! 4 im Blut und seinen Blutzellen; Proben von 21- bis 35-jährigen Spendern (Hannappel and van Kampen, 1987): Tabelle 2: Verteilung von Thymosin! 4 im Blut und seinen Blutzellen Thymosin! 4 Konzentration in fg/zelle Thrombozyten 6,9 31,7 Mononukleäre Leukozyten (MNL) Polymorphonukleäre Leukozyten (PML) Thymosin! 4 Konzentration in mg/l Vollblut 12,0 19,5 Plasma 0,026 0,387 Erythrozyten Nicht nachweisbar 1981 wurde die Aminosäuresequenz von Low et al. aufgeklärt: Thymosin! 4 : ac-sdkp DMAEI EKFDK SKLKK TETQE KNPLP SKETI EQEKQ AGES

23 19 Demnach besteht Thymosin! 4 aus 43 Aminosäuren. Das N-terminale Serin ist acetyliert. Das Molekulargewicht beträgt 4965 Dalton. Da 12 hydrophoben Aminosäuren 21 hydrophile gegenüberstehen, besitzt Thymosin! 4 eine gute Wasserund Säurelöslichkeit. Die NMR-Spektroskopie zeigt, dass Peptid bei Raumtemperatur im wässrigen Milieu keine geordnete Struktur aufweist. Erst durch Zugabe von Trifluorethanol bilden sich zwischen der 5. und 16. Aminosäure (D5-K16) und zwischen der 31. und 37. Aminosäure (K31-E37) "-Helices aus (Czisch et al., 1993) Funktion von Thymosin! 4 Thymosin! 4 ist ein Vermittler der Zellproliferation, Migration und Differenzierung (Philp et al., 2003). Thymosin! 4 hat auch eine kardioprotektive Wirkung. Extrazelluläre Gabe von Thymosin! 4 induziert Kardiomyozyten- und Endothelzellmigration im Herzen und fördert das Überleben von Kardiomyozyten (Bock-Marquette et al., 2004). Im Zellkern könnte Thymosin! 4 die Rolle eines Transkriptionsfaktors übernehmen (Huff et al., 2004) Interaktion von Thymosin! 4 mit G-Aktin Monomeres G-Aktin ist der am besten beschriebene Interaktionspartner von Thymosin!4. Unter den hohen, intrazellulär vorliegenden Salzkonzentrationen müsste das gesamte monomere G-Aktin zu Filamenten, dem F-Aktin, polymerisieren. In Zellen liegen aber etwa 50 % des gesamten Aktins als G-Aktin vor. Klarheit brachten Safer et al., als sie 1990 einen Faktor Fx aus Thrombozyten isolierten, der mit G-Aktin einen 1:1-Komplex ausbildet und somit die Polymerisation zu F-Aktin verhindert (Hannappel and Wartenberg, 1993). Dieser Aktin-sequestrierende Faktor Fx ist mit Thymosin! 4 identisch (Safer et al., 1991). Für die Bindung des Aktins spielt die Sequenzfolge des Peptids die entscheidende Rolle. Sie findet man auch bei anderen aktinbindenden Proteinen (Vancompernolle et al., 1992). Die Bindung von Thymosin!4 im Komplex erfolgt an die Domänen 1 bis 3 des G-Aktins. Bei Dissoziation des Komplexes entsteht freies G-Aktin das sich bevorzugt an das (+)Ende des Filaments anlagert. Das Filament wächst in diese Richtung weiter (vgl. Abbildung 3). Zusätzlich befindet sich an Position 6 der Aminosäuresequenz ein Methionin, das leicht oxidiert werden kann. Dadurch wird der unpolare Rest (Dialkylthioether) durch eine

24 20 polare Gruppe (Dialkylsulfoxid) ersetzt (Huff and Hannappel, 1997). Die Oxidation des Methioninrests erhöht die Dissoziationskonstante des entsprechenden Komplexes mit G-Aktin auf das 20fache (Huff et al., 1995) und der Komplex verliert an Stabilität. Es ist bekannt, dass Zellen im Zuge des Zellstoffwechsels und der Signaltransduktion reaktive Sauerstoffspezies, zum Beispiel H 2 O 2, generieren. Um Thymosin!4 zum Sulfoxid zu oxidieren reichen H 2 O 2 Konzentrationen im millimolaren Bereich. Dadurch verringert sich die Affinität zu G-Aktin. Jedoch kann der Affinitätsverlust durch die Reduktion des Sulfoxids wieder rückgängig gemacht werden (Huff and Hannappel, 1997). Man kann sich also gut vorstellen, dass das intrazelluläre Gleichgewicht zwischen G- und F-Aktin über diese veränderliche Bindungsfähigkeit reguliert wird (Huff and Hannappel, 1997). Abbildung 3: Gleichgewicht zwischen F- und G-Aktin Bei der Unterdrückung von Entzündungsreaktionen wirkt Thymosin!4-Sulfoxid als antiinflammatorischer Mediator. Es wird von Monozyten in Anwesenheit von Glukokortikoiden gebildet. In vitro inhibiert Thymosin!4-Sulfoxid zusätzlich die Neutrophilenchemotaxis (Young et al., 1999).

25 21 Aktin wurde lange Zeit ausschließlich die Rolle als zytoplasmatisches Strukturprotein zugeordnet. Neuere Publikationen deuten jedoch zusätzlich auf eine wichtige Rolle des Aktins im Zellkern hin (Visa, 2005; Maraldi et al., 2004; Olave et al., 2002), wo es zusammen mit Thymosin!4 vorkommt (Huff et al., 2004) Einfluss von Thymosin! 4 auf die Wundheilung Neben seiner Hauptfunktion als Aktin bindendes Protein hat Thymosin!4 auch Einfluss auf die Wundheilung. Neuere Ergebnisse lassen auf eine Funktion bei der Angiogenese schließen. So zeigte sich Thymosin!4 als potenter chemotaktischer Faktor, der sowohl in vitro wie auch in vivo die Migrationsfähigkeit der Endothelzellen der menschlichen Vena umbilicalis erhöht (Malinda, 1997). Neben Einfluss auf die Migration von Endothelzellen scheint Thymosin!4 auch eine regulierende Aufgabe bei der Endothelzelldifferenzierung zu haben. Grant et al. beobachteten eine fünfmal höhere Thymosin!4-m-RNA-Synthese während der Differenzierung von Endothelzellen zu kapillarähnlichen Schläuchen (Grant et al, 1995; Grant et al, 1999). Außerdem finden sich erhöhte Thymosin!4-m-RNA-Konzentrationen in Bereichen des aktiven Nervenwachstums und der Blutgefäßen (Carpinterio et al., 1995), sowie in reifen Granulozyten und anderen für die Wundheilung notwendiger Zellen (Gondo et al., 1987). Sowohl die Überexpression von Thymosin!4 in BL16-F10 Zellen, als auch die extrazelluläre Applikation geringer Thymosin!4 Mengen zu B16-F10 Zellen bewirkt eine erhöhte Expression des vascular endothelian growth factor (VEGF) (Cha et al., 2003). Thymosin!4 spielt auch eine Rolle bei der Blutgerinnung, die der Grundstein für die Wundheilung ist. Es dient als ein spezielles Glutaminyl-Substrat der intra- wie extrazellulär lokalisierten Gewebetransglutaminase Faktor XIIIa (Huff et al., 1999). Transglutaminasen sind Enzyme, die Isopeptidbindungen in oder zwischen Molekülen herstellen, Sie spielen neben der Blutgerinnung auch eine wichtige Rolle bei der Apoptose. Nach der Aktivierung des Faktors XIIIa durch Thrombin bindet er aus aktivierten Thrombozyten freigesetztes Thymosin!4 kovalent an Fibrin (vgl. Abbildung 4 aus Goldstein et al., 2005). Dabei wird Thymosin!4 mit der "C-Domäne des Fibrins vernetzt (Huff et al., 2002), einer Domäne, an die bevorzugt auch weitere Plasmaproteine ("2-Antiplasmin, PAI-2, Fibronectin, Thrombospondin, vwf) binden

26 22 (Makogonenko et al., 2004). Im Laufe der Wundheilung wird weiteres Thymosin!4 von Polynukleär-Leukozyten, Makrophagen und andere Zellen der Wundfläche freigesetzt. Durch die chemotaktische Wirkung des Peptids wandern Endothelzellen und Keratinozyten in das Wundgebiet und der Heilungsprozess beginnt (Goldstein et al., 2005). Abbildung 4: Wundheilung der Haut In der letzten Phase der Wundheilung kommt es zur Gewebeumgestaltung durch Proteasen. Die für die Reinigung der Wunde und die Umgestaltung der Kollagenfasern verantwortliche Gruppe der Proteasen sind die Matrixmetalloproteinasen (MMPs). Thymosin!4 erhöht die MMP-Aktivität in Endothelzellen. Zudem zeigen mit Thymosin!4 behandelte Wunden eine Steigerung der MMP-mRNA sowie eine Erhöhung der Proteaseaktivität bei Monozyten, Keratinozyten, Endothelzellen und Fibroblasten (Philp et al., 2006). Thymosin!4 stimuliert die Expression von Laminin-5 #2 (Sosne et al., 2004; Goldstein et al., 2005), einem für Zellmatrixkontakte verantwortlichen Bestandteil der Basalmembran.

27 23 2 Problemstellung 2.1 Stand der Forschung Thymosin! 4 unterstützt die Wundheilung, ist beteiligt bei der Entzündungsreaktion und reguliert die Expression von Laminin-5 #2. Momentan befindet sich die Studie über seine positive Wirkung bei Patienten mit Hypertonie, venöser Stase Ulcera und Epidermolysis bullosa in Phase II. Wundflüssigkeiten wurden schon auf diverse Faktoren untersucht, die die Wundheilung beeinflussen (siehe Kapitel 1). Frohm et al. isolierten 1996 verschiedene Peptide und Proteine mit der Reverse-Phase High- Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC). Unter den in Wundflüssigkeiten erfassten Proteinen war auch Thymosin! 4. Jedoch geht aus der Studie nicht hervor, ob das identifizierte Thymosin! 4 aus der Wundflüssigkeit oder aus Blut- oder Entzündungszellen stammte, die in den gesammelten Wundflüssigkeiten vorhanden waren. Die Wundflüssigkeit wurde gefriergetrocknet und das trockene Material mit 60 % wässrigem Acetonitril (ACN) und 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) versetzt. Die Autoren stellten fest, dass The procedure gives both cellular and humoral components soluble in the solvent used. Die Konzentration des in der ursprünglichen Wundflüssigkeit befindlichen Thymosin! 4 wurde indirekt über Daten bestimmt, die man aus der Edman-Sequenzierung eines tryptischen Fragments von Thymosin! 4 gewann. Ausgehend von 50 % Peptidgewinnung aus der HPLC-Analyse, tryptischer Verdauung und Edman Sequenzierung würde 1 ml Wundflüssigkeit 2600 pmol Thymosin! 4 enthalten (Frohm et al., 1996). Dies entspricht 13 mg Thymosin! 4 pro ml Wundflüssigkeit. Alle menschlichen Blutzellen, mit Ausnahme der Erythrozyten, enthalten große Mengen an Thymosin! 4. Darüber hinaus ist Thymosin! 4 das wichtigste G-Aktin sequestrierende Peptid in menschlichen Thrombozyten (siehe Kapitel 1.2). Das führt zu dem Schluss, dass das von Frohm et al. in Wundflüssigkeit entdeckte Thymosin! 4 sehr wahrscheinlich aus Zellen stammen müsste, die sich in der Wundflüssigkeit befanden. Zusammenfassend basiert der aktuelle Stand der Forschung auf den Arbeiten von Frohm et al., deren Bestimmung von Thymosin! 4 von Wundflüssigkeits-Proben ausging, die Blut- und Entzündungszellen enthielten. Hierbei wurden auffallend hohe Thymosin! 4 Konzentrationen ermittelt. Dies ließe sich dadurch erklären, dass bei der Gefriertrocknung und anschließende Aufbereitung der Proben die darin enthaltenen

28 24 Zellen zerstört und das in den Zellen vorhandene Thymosin! 4 freigesetzt wurde. Es interessiert jedoch ausschließlich der Thymosin! 4 Gehalt des Wundsekrets. 2.2 Zielsetzung der Arbeit Die bisherige Forschung zu Thymosin! 4 ist von sehr verstreuten Einzelergebnissen geprägt. Das Peptid wurde in vielen unterschiedlichen Bereichen untersucht, wie zum Beispiel im Rahmen des Haarwachstums bei Mäusen, von kardioprotektive Wirkmechanismen oder von Hornhautverätzungen am Auge. Die am häufigsten zitierte Untersuchung im Zusammenhang mit Wundflüssigkeit (Frohm et al., 1996) präsentiert Thymosin! 4 Werte, deren Gewinnung aufgrund der eingesetzten Gefriertrocknung sehr kontrovers diskutiert wird. Vor diesem Hintergrund setzt sich die vorliegende Arbeit zum Ziel, zwei wesentlichen Forschungsdefiziten zu begegnen. Zum einen konzentriert sich die vorliegende Arbeit auf die Untersuchung von Thymosin! 4 ausschließlich in der Wundflüssigkeit. Dabei wird ein Patientenkollektiv mit operativen Eingriffen betrachtet. Die Thymosin! 4 Bestimmung erfolgt einheitlich ab dem Zeitpunkt der Operation über einen definierten Zeitraum von 72 Stunden. Das Sekret wird nach einem festgelegten verbindlichen Zeitschema entnommen. Eine derartige systematische Thymosin! 4 Untersuchung im zeitlichen Verlauf ist an anderer Stelle nicht bekannt geworden. Zum anderen vermeidet die vorliegende Arbeit die Verwendung von kritisierten Verfahren zur Gewinnung, Aufbereitung und Analyse der Sekretproben. Unter anderem werden die Proben nicht gelagert und nicht gefriergetrocknet. Vielmehr geht die im folgenden Kapitel 3 beschriebene Studie einen neuen Weg: - Das Wundsekret wird unmittelbar aus der Wund-Drainage gewonnen, - Zellen und Gewebereste werden unverzüglich abzentrifugiert und - der Thymosin! 4 Gehalt wird ohne zeitliche Verzögerung im zellfreien Wundsekret ermittelt. Es handelt sich somit um eine erstmalige systematische Verlaufsstudie auf der Basis zellfreier Probenanalysen.

29 25 3 Konzept der Studie 3.1 Patientenauswahl Für die Bestimmung von Thymosin! 4 im Wundsekret wurden Patienten mit großer Wundhöhle ausgewählt. Dabei fokussierte man sich auf Patienten mit größeren Organ- Eingriffen, bei denen postoperativ über einige Tage Wundsekret über eine intraoperativ eingebrachte Drainage gefördert wird. Naturgemäß handelte sich dabei um thorakale und abdominale Eingriffe. Die betroffenen Organe im Thoraxbereich waren Lunge und Ösophagus. Im Abdominalbereich dominierten die kolorektalen Operationsfälle gegenüber den Eingriffen an den parenchymatösen Organen Leber und Pankreas. Alle Patienten wurden über die Probenentnahme und deren Verwendung aufgeklärt. Sie erhielten darüber hinaus eine Einwilligungserklärung zur wissenschaftlichen Verwendung von Blut- bzw. Gewebeproben und personenbezogenen Daten mit ausführlichen Erläuterungen (vgl. Anlage 2). 3.2 Beobachtungsdauer Der Untersuchungszeitraum betrug durchschnittlich 72 Stunden. Innerhalb dieser Zeitspanne wurden nach einem vorgegebenen Raster 15 Proben frisches Wundsekret abgenommen. Es gab auch Patienten bei denen die Beobachtungsdauer etwas kürzer oder auch länger war. Die Erstabnahme erfolgte unmittelbar postoperativ noch im Aufwachraum. Die Proben innerhalb der ersten 12 Stunden nach der Operation wurden im Dreistundenrhythmus abgenommen, die Proben bis zur 72ten Stunde postoperativ alle sechs Stunden. 3.3 Beobachtungsparameter In der Wundflüssigkeit wurde zu der Gesamtproteingehalt in g/l und der Gehalt an Thymosin! 4 in mg/l bestimmt. Pro Patient wurden im Zeitverlauf nach einem vorgegebenen Raster jeweils bis zu 15 Thymosin! 4 - und Proteinwerte bestimmt.

30 26 4 Material und Methoden 4.1 Verwendete Geräte Analytische bzw. präparative HPLC Pumpen: Derivatisierungspumpe: 655A-13 Reaction Pump Merck Hitachi Lösungsmittelpumpe: 655A-12 Liquid Chromatograph Merck Hitachi HPLC-Controller: L-6200 LC Controller Merck Hitachi Interface: Interface D-7000 Merck Hitachi Trennsäule: ODS Ultrasphere RP-18 Beckman Coulter (5µm, 4,6mm x 25cm) (München) Fluorometer: FL-Detektor L-7480 Merck Hitachi Sonstige Geräte Photometer: Novaspec II Visible Spectrometer Pharmacia Biotech Zentrifuge: Omnifuge 2,0 RS Heraeus Sepatech (Osterode) Ultrazentrifuge: Centrifuge 5417 R Eppendorf (Hamburg) Mixer: Vortexer REAX 2000 Heidolph Pipetten: Mikropipette $l Mikropipette $l Corning Lambda Corning Lambda

31 27 Pipettenspitzen: Pipettenspitze (gelb) 200$l Pipettenspitze (blau) 1000$l Sarstedt, Nümbrecht Sarstedt, Nümbrecht Reagiergefäß 1,5ml SAFETY CAP Sarstedt, Nümbrecht 4.2 Verwendete Substanzen Die für die HPLC verwendeten Lösungsmittel entsprechen gradient grade. Perchlorsäure (PCA) Trifluoressigsäure zur Synthese (TFA) Acetonitril (ACN) Borsäure Fluorescamin Aceton Gly-Phe 0,1 g/l (GF) Biuret-Reagenz: 12 mmol/l Kupfersulfat 32 mmol/l Kaliumnatriumtartrat 30 mmol/l Kaliumiodid in 0,2 mol NaOH/l E. Merck (Darmstadt) E. Merck (Hohenbrunn) Carl Roth GmbH&Co (Karlsruhe) Carl Roth GmbH&Co (Karlsruhe) Serva (Heidelberg) Carl Roth GmbH&Co (Karlsruhe) Serva (Heidelberg) E. Merck (Darmstadt) 4.3 Verwendete Puffer Analytische bzw. präparative HPLC: Puffer A Puffer B 0,1 % TFA in Wasser 0,1 % TFA in 50 % Acetonitril Boratpuffer H 3 BO 3 (0,4 M) mit Lithiumhydroxid (gesättigt) auf ph 9,3 Fluramlösung Fluorescamin in Aceton (200 mg/l)