Einführung in die Biophysik - Übungsblatt 6- mit Lösungen July 1, 2015 Allgemeine Informationen: Die Übung ndet immer montags in Raum H030, Schellingstr. 4, direkt im Anschluss an die Vorlesung statt. Falls Sie Fragen haben, schreiben Sie bitte eine Email an: patrick.moessmer@physik.uni-muenchen.de 1 Single Molecule Real Time Sequencing (SMRT) Recherchieren Sie mit Hilfe von Google Scholar das folgende Paper: "Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules", Eid et al., DOI: 10.1126/science.1162986 Beantworten Sie dann die folgenden Fragen: 1.1 Beschreiben Sie den unten abgebildeten Aufbau! Gehen Sie dabei darauf ein, was eine "Evaneszente Welle" und ein "Zero-Mode-Waveguide" (ZMW) sind, und weshalb sie eine so groÿe Rolle für das korrekte Arbeiten der abgebildeten Vorrichtung spielen! Figure 1
Eine Evaneszente Welle ist ein quantenmechanisches Phänomen. Es handelt sich dabei um eine exponentiell abklingende Welle in einem klassisch nicht erlaubtem Bereich direkt hinter einer Grenzäche. Sie hat ihre höchste Intensität innerhalb eines Drittels der Wellenlänge entfernt von der Grenzäche. Der Wellenvektor wird hier komplexwertig. Anwendung nden evaneszente Wellen zum Beispiel in der Mikroskopie, um extrem kleine Objekte zu beleuchten. (mehr Nachlesen!) Betrachten wir den Fall einer endlich hohen Potentialstufe. Die von links einlaufende Welle beschreiben wir mit e ikx, die von der Stufe reecktierte zurücklaufende Welle mit e ikx. Für die Transmission durch die Stufe spielt nur die einlaufendee Welle eine Rolle. Setzt man nun einen komplexwertigen Wellenvektor im Transmissionsbereich hinter der Stufe für k ein, also k T = il, ergibt sich: e ik T x = e i(il)x = e lx, also eine exponentiell abklingende Welle. Die folgende Graphik veranschaulicht, wie eine evanezente Welle an einem Prisma auftritt. Mit einem zweiten Prisma sehr nah am ersten Prisma kann man die Welle "vor dem vollständigen Abklingen retten" und weiterlaufen lassen. Figure 2 Ein Zero-Mode-Wave-Guide ist ein Wellenleiter, der Licht in ein Volumen leitet, das kleiner ist als die Wellenlänge in allen drei Dimensionen. Zur Erinnerung: Für einen optischen Wellenleiter braucht man in der Mitte Material mit höherem Brechungsindex als das umgebende Material, um Totalreexion zu erhalten. guide.png Figure 3
Man braucht in dem oben genannten Paper ein derart kleines Beobachtungsvolumen, weil man wirklich immer nur ein uoreszenzmarkiertes Nukleotid beobachten möchte. Das Problem ist, dass die Polymerase eine sehr hohe Dichte an Nukleotiden benötigt (zwischen 0,1 und 10 micromolar), um arbeiten zu können. Das heiÿt, es benden sich sehr viele Nukleotide in der Lösunge und somit sehr viele störende Signale auÿenherum. Um diese auszugrenzen, muss man es schaen, ein extrem kleines, nach auÿen hin abgeschottetes Volumen zu beleuchten und zu betrachten. 1.2 Was sind die Vorteile der SMRT verglichen mit der Sanger-Sequenzierung? Man kann deutlich längere Sequenzen ermitteln, und das ganze verläuft auch schneller (so schnell wie DNA-Polymerase, Real-Time). 1.3 Gehen Sie nun genauer auf die einzelnen Schritte der Sequenzierung ein, indem Sie untenstehende Abbildung erläutern! Figure 4 Die DNA-Polymerase macht den zu sequenzierenden Einzelstrang zu einem Doppelstrang. Dabei baut sie mit Fluoreszenzmarkern markierte Nukleotide ein. Das einzubauende Nukleotid verweilt verhältnismäÿig lange in dem Zylinder, so dass es ein starkes Fluoreszenzsignal gibt. Andere, wahllos diundierende Nukleotide verlalssen den Zylinder so schnell wieder, dass ihre Signale nur zu einem verrauschten Background beitragen. Der Fluoreszenzmarker wird nach dem Einbauen des Nukleotids abgespalten. Die Abfolge der Fluoreszenz-Signale gibt dann die Sequenz des Erbguts an, da jeder Base jeweils mit einem bestimmten Farbsto markiert wurde.
1.3 In der Abbildung ist schematisch ein Fluoreszenz-Signal mit klar denierten Pulsen gezeigt. Das Rauschen ist dabei sehr gering. Man könnte meinen, dass zufällig in den ZMW diundierte Desoxiribonukleotid-Triphosphate (dntps) das Signal stören oder falsche Pulse erzeugen. Erklären Sie, warum dies nicht der Fall ist! Wie lautet die Formel, mit der Diusionszeiten abgeschätzt werden können? D = x2 (1) 4 t Nach t auösen, fertig. Diese Formel ist so einfach, dass man sie sich ruhig mal merken kann für die Klausur. Herleitung: http://engineering.dartmouth.edu/ d30345d/courses/engs43/chapter2.pdf 2 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs) 2.1 Warum sind CRISPR-Sequenzen häug palindromisch (oder zumindest beinahe palindromisch)? Ernden Sie ein Beispiel einer palindromischen Sequenz von 20 Basen. (Anmerkung: Gemeint sind hier nicht die gewöhnlichen Palindrome wie "Otto" oder "Rentner", sondern eine Sequenz, deren komplementäre Sequenz mit ihr selbst identisch ist, wenn man jeweils am 5'-Ende zu lesen beginnt). Testen Sie, welche Sekundärstrukturen die von Ihnen erfundene Sequenz bildet, indem Sie diese auf der NUPACK-Website analysieren lassen (Link: http://www.nupack.org/partition/new). Wenn Sie alles richtig gemacht haben, sollten sie eine Sekundärstruktur der folgenden Form erhalten: Figure 5 Sie sind palindromisch, damit die entsprechende RNA "Hairpins" bildet. Die Hairpins wiederrum sind wichtig, damit bestimmte Schneide-Enzyme, zum Beispiel Csy4, die richtigen Stellen angreifen können, um die CRISPR in die gewünschten Stüce zu zerteilen. Erst die zerteilte RNA stellt dann eine Immunabwehr der Bakterien gegen Viren dar. 2.2 Welche Aufgabe übernehmen CRISPRs im Erbgut vieler Bakterien und Archaeen? Erläutern Sie einige mögliche Anwendungen von CRISPRs in der Gentechnologie! So etwas wie ein bakterielles Immunsystem. Sie dienen einem Mechanismus, der Resistenz gegen das Eindringen von fremdem Erbgut durch Viren oder Plasmide verschat, und sind hierdurch ein Teil des Immunsystem-Äquivalents von vielen Prokaryoten. CRISPR haben eine Länge, die zwischen 23 und 47 bp variiert. Die Einzelsequenzen des sich wiederholenden Grundmotives wechseln sich ab mit Spacern, die eine Länge von 21 bis 72 bp haben. Während innerhalb einer CRISPR- Struktur die sich wiederholende Sequenz erhalten bleibt, variiert die Sequenz der CRISPR in
verschiedenen Mikroorganismen stark.die Sequenz von CRISPR repeats ist in der Regel palindromisch, was eine stabile Sekundärstruktur der zugehörigen RNA zur Folge hat. Die Sequenzen der Spacer-Abschnitte variieren stark, sowohl innerhalb einer CRISPR-Struktur als auch in verschiedenen Prokaryoten. 2005 wurde entdeckt, dass die Spacer-Sequenzen mit Fremd- DNA aus Bakteriophagen und Plasmiden identisch sind.[5][6][7] Dies führte zur Hypothese, dass die Funktion von CRISPR darin besteht, den Organismus gegen Fremd-DNA zu verteidigen. 2007 wurde von Barrangou et al. gezeigt, dass Bakterien, die mit Phagen inziert werden, Teile der Fremd-DNA als Spacer in die CRISPR-Bereiche ihres Genoms integrieren und hierdurch Immunität gegen die Phagen entwickeln können. Zudem zeigten sie, dass Spacer-Sequenzen, die künstlich in die CRISPR-Bereiche von Bakterien eingefügt werden, diese gegen die zugehörigen Phagen resistent machen. Werden die Spacer-Sequenzen wieder herausgeschnitten, ist auch die Resistenz aufgehoben. Es wurde auÿerdem gezeigt, dass die cas-gene eine essentielle Rolle bei der Phagenabwehr spielen: Das Inaktivieren einiger cas-gene (cas1) verhindert trotz vorhandener Spacer die Abwehr von Phagen. Die Aktivität anderer cas-gene (cas7) ist notwendig zur Integration neuer Spacer in die CRISPR-Sequenz. Das Ganze wird zum Beispiel verwendet, um industriell wichtige Keime wie Bierhefe, insulinproduzierende Bakterien, etc. immun gegen häuge Feinde zu machen.