Von der Hochschule Drmstdt, Fchbereich Chemie- und Biotechnologie im Studiengng Biotechnologie genehmigte Diplomrbeit von Ktj Hirt Der Fermenttionseinfluss uf die Überlebensfähigkeit, ntgonistische Wirksmkeit und die Lgerfähigkeit gefriergetrockneter Bkterien (Pseudomons fluorescens) Referent: Prof. Dr. rer. nt. Hns-Jürgen Koepp-Bnk Korreferentin: Prof. Dr. rer. nt. Regin Heinzel-Wielnd Diese Diplomrbeit wurde in der Zeit vom 01.04.2006 bis 29.09.2006 in der Biologischen Bundesnstlt für Lnd- und Forstwirtschft, Institut für biologischen Pflnzenschutz, in Drmstdt ngefertigt.
INHALTSVERZEICHNIS 1 Einleitung 1 2 Mteril und Methoden 3 2.1 Chemiklien, Lösungen, Geräte, Mterilien und Softwre 3 2.2 Mikroorgnismen und ihre Stmmhltung 6 2.3 Anzucht 7 2.3.1 Strterkulturen 7 2.3.2 Fermenttion in Kolben 7 2.3.3 Fermenttion im 3l-Fermenter 8 2.4 Zellernte und Biomssequntifizierung 9 2.4.1 Zellernte 9 2.4.2 Trübungsmessung 10 2.4.3 Koloniebildende Einheiten (KBE Methode) 11 2.4.4 Most probble number (MPN Methode) 12 2.5 Probenufbereitung und Gefriertrocknung 13 2.6 Untersuchungen zum Einfluss der Fermenttionsbedingungen uf die Überlebensrte nch der Gefriertrocknung 15 2.6.1 Nährmedienzusmmensetzung 15 2.6.2 Tempertureinfluss 17 2.6.3 ph-wert Veränderung 17 2.7 Untersuchungen zum Einfluss der Fermenttionsbedingungen uf die ntgonistische Wirksmkeit nch der Gefriertrocknung 18 2.7.1 Nährmedienzusmmensetzung 18 2.7.2 Biotests 18 2.7.3 Tempertureinfluss 20 2.8 Untersuchungen zum Einfluss der Fermenttionsbedingungen uf die Lgerfähigkeit nch der Gefriertrocknung 21 2.8.1 Nährmedienzusmmensetzung 21 2.8.2 Tempertureinfluss 21 i
3 Ergebnisse 22 3.1 Photometrische Bestimmung des Wchstums 22 3.2 Methodenvergleich zur Biomssequntifizierung 25 3.2.1 KBE Methode 25 3.2.2 MPN Methode 27 3.3 Temperturvergleiche während des Gefriertrocknungsvorgnges 28 3.4 Einfluss der Fermenttionsbedingungen uf die Überlebensrte nch der Gefriertrocknung 30 3.4.1 Nährmedienzusmmensetzung 30 3.4.2 Tempertureinfluss 36 3.4.3 ph-wert Veränderung 38 3.5 Einfluss der Fermenttionsbedingungen uf die ntgonistische Wirksmkeit nch der Gefriertrocknung 40 3.5.1 Nährmedienzusmmensetzung 40 3.5.2 Tempertureinfluss 42 3.6 Einfluss der Fermenttionsbedingungen uf die Lgerfähigkeit nch der Gefriertrocknung 43 3.6.1 Nährmedienzusmmensetzung 43 3.6.2 Tempertureinfluss 47 4 Diskussion 48 5 Zusmmenfssung 53 6 Literturverzeichnis 54 ii
ABBILDUNGSVERZEICHNIS Abbildung 1: Horizontlschüttler (INFORS) mit Huptkulturen 7 Abbildung 2: 3l-Fermenter (INFORS) 8 Abbildung 3: Zentrifuge (Beckmn) 9 Abbildung 4: Zweistrhl- Spektrlfotometer (UVIKON) 10 Abbildung 5: Spirlpltter (Spirl Systems) 11 Abbildung 6: MPN Methode 12 Abbildung 7: Lyophilistor (Virtis) 14 Abbildung 8: Durchführung eines Biotests 19 Abbildung 9: Botrytis cinere Befll n Bohnenblättern bei den Befllsklssen 0, 10, 25, 50 und 100 20 Abbildung 10: Korreltion zwischen optischer Dichte und Lebendzellzhl der vier Isolte 22 Abbildung 11: Wchstum von Pf153 in neun verschiedenen Flüssignährmedien 23 Abbildung 12: Wchstum von CHA0 in neun verschiedenen Flüssignährmedien 24 Abbildung 13: KBE Methode: Isolt Pf153 nicht gefriergetrocknet und gefriergetrocknet 25 Abbildung 14: MPN Methode: Isolt Pf153 nicht gefriergetrocknet und gefriergetrocknet 27 Abbildung 15: Temperturverluf während der Gefriertrocknung 28 Abbildung 16: Einfluss des Fermenttionsmediums uf die Lebensfähigkeit [KBE/ml] des Isolts Pf153 nch der Gefriertrocknung (mit Lktose) 30 Abbildung 17: Einfluss des Fermenttionsmediums uf die Lebensfähigkeit [KBE/ml] des Isolts CHA0 nch der Gefriertrocknung (mit Lktose) 32 Abbildung 18: Einfluss des Fermenttionsmediums uf die Lebensfähigkeit [MPN/ml] des Isolts Pf153 nch der Gefriertrocknung (mit und ohne Lktose) 34 iii
Abbildung19: Abbildung20: Abbildung 21: Abbildung 22: Abbildung 23: Abbildung 24: Abbildung 25: Einfluss einer Tempertureinwirkung m Ende der Fermenttion uf die Lebensfähigkeit [MPN/ml] des Isolts Pf153 nch der Gefriertrocknung 36 Einfluss einer ph-wert Veränderung m Ende der Fermenttion uf die Lebensfähigkeit [MPN/ml] des Isolts Pf153 nch der Gefriertrocknung 38 Einfluss des Fermenttionsmediums uf die ntgonistische Wirksmkeit des Isolts Pf153 nch der Gefriertrocknung 40 Einfluss einer Tempertureinwirkung m Ende der Fermenttion uf die ntgonistische Wirksmkeit des Isolts Pf153 nch der Gefriertrocknung 42 Einfluss des Fermenttionsmediums uf die Lgerfähigkeit bei 20 C des Isolts Pf153 nch der Gefriertrockn ung 44 Einfluss des Fermenttionsmediums uf die Lgerfähigkeit bei 30 C des Isolts Pf153 nch der Gefriertrockn ung 45 Einfluss einer Tempertureinwirkung m Ende der Fermenttion uf die Lgerfähigkeit des Isolts Pf153 nch der Gefriertrocknung 47 iv
TABELLENVERZEICHNIS Tbelle 1: Chemiklien 3 Tbelle 2: Geräte 4 Tbelle 3: Mterilien 5 Tbelle 4: Softwreprogrmme 5 Tbelle 5: Isolte 6 Tbelle 6: Prmetereinstellungen des Lyophilistors 13 Tbelle 7: Nährmedienzusmmensetzung 16 Tbelle 8: ph-wert Erniedrigung und Zeit der Probenhme 17 Tbelle 9: Befllsklssen zur Auswertung eines Biotests 19 Tbelle 10: Einfluss des Fermenttionsmediums uf die Überlebensrte des Isolts Pf153 nch der Gefriertrocknung (mit Lktose) 31 Tbelle 11: Einfluss des Fermenttionsmediums uf die Überlebensrte des Isolts CHA0 nch der Gefriertrocknung (mit Lktose) 33 Tbelle 12: Einfluss des Fermenttionsmediums uf die Überlebensrte des Isolts Pf153 nch der Gefriertrocknung (mit und ohne Lktose) 35 Tbelle 13: Einfluss einer Tempertureinwirkung m Ende der Fermenttion uf die Überlebensrte des Isolts Pf153 nch der Gefriertrocknung 37 v
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS % Prozent C Grd Celsius µl Mikroliter Abb. Abbildung BBA Biologische Bundesnstlt für Lnd- und Forstwirtschft cm Zentimeter DF Dworkin und Forster Nährmedium g Erdbeschleunigung Gew.-% Gewichtsprozent h Stunden Kp. Kpitel KB King s B-Medium KBE Koloniebildende Einheiten l Liter mbr Millibr Min. Minuten ml Milliliter MPN Most probble number nm Nnometer Nr. Nummer OD optische Dichte p Irrtumswhrscheinlichkeit ph -lg [H + ] ppm prts per million Tb. Tbelle TSA Tryptische-Soj-Agr TSB Tryptische-Soj-Nährboullion Upm Umdrehungen pro Minute Vol.-% Volumenprozent VE voll entslzt vi
1 Einleitung Im Vergleich zum Pflnzenschutz mit chemischen synthetischen Mitteln gewinnt die biologische Bekämpfung von Pflnzenkrnkheiten und Schädlingen immer mehr n Bedeutung. Ein Grund dfür ist die wchsende Akzeptnz dieser Verfhren durch den Anwender (Bode, 2000). Frnz und Krieg (1982) definieren unter biologischem Pflnzenschutz die Verwendung von Lebewesen, um mit ihnen (mit menschlichem Eingriff) die Popultionen bestimmter Tiere oder Pflnzen zu begrenzen. Weiter definieren sie ls mikrobiologische Schädlingsbekämpfung, die Mnipultion von Mikroben - wie Viren, Nemtoden, Protozoen, Ricketsien, Bkterien und Pilzen - mit dem Ziel, Popultionen von Schderregern zu regulieren, zu reduzieren oder uch zu eliminieren. Der biologische Pflnzenschutz umfsst nchhltige, umweltverträgliche und zukunftsfähige Strtegien zur Krnkheitsbekämpfung (Duffy & Defgo, 1999). Vor zwei Jhren wurde ein Forschungszentrum in Trentino gegründet, ds sich innovtiver Forschung im Bereich Pflnzenschutz unter Anwendung nchhltiger, umweltfreundlicher Methoden widmet. Ein Ziel ist es, den Einstz chemischer Pflnzenschutzmittel in der Lndwirtschft zu reduzieren, uch um Lndwirtschft und Tourismus besser vereinbren zu können. Im Rhmen der Forschungsktivitäten sollen in Zusmmenrbeit mit der Biologischen Bundesnstlt für Lnd- und Forstwirtschft, Institut für biologischen Pflnzenschutz, geeignete Produktions- und Formulierungsverfhren für Bkterien der Gttung Pseudomons entwickelt werden. Bkterien wie die Pseudomons fluorescens Spezies sind effektive Antgonisten zur Bekämpfung einiger Pflnzenkrnkheiten (z.b. Botrytis cinere). Diese Grm-negtiven Bkterien sind llerdings sehr schwer zu konservieren. Um ein lgerfähiges Produkt zu erhlten, müssen dher schonende Konservierungsmethoden genutzt werden. Dbei zeigten vorngegngene Untersuchungen und Ausrbeitungen, dss die Gefriertrocknung ein effektiver Weg ist, um Bkterien zu konservieren und nch dem Einfrierprozess eine hohe Überlebensrte zu erhlten (Mtos d Silv 2005). 1
Die Gefriertrocknung wurde bereits 1890 von dem Leipziger Antomen Altmnn beschrieben. Etw b dem Jhre 1950 folgten Arbeiten, die sich gezielt mit der Gefriertrocknung von Mikroorgnismen beschäftigten (Stnczk & Szulc, 1990 und Berny & Hennebert, 1991). Der Gefriertrocknungsprozess besteht us zwei Phsen: Erstens us dem Einfrieren der Proben und zweitens us der Trocknung, d. h. der Sublimtion der gebildeten Eiskristlle. Dbei können folgende Prmeter die Gefriertrocknung beeinflussen: Zum einen die Art des Mikroorgnismus, die Fermenttionsbedingungen, der physiologische Zustnd der Zellen und die Aufrbeitungsbedingungen. Zum nderen die Art und Konzentrtion des Gefrierschutzmittels, die Einfrierrte und die Einfrierendtempertur. Des Weiteren die Schichtdicke des Produktes, der Temperturverluf und der Kmmerdruck während der Trocknung. Die Lgerung knn mit ihrer Lgertempertur und Lgertmosphäre (z. B. im Vkuum) ebenflls von der Gefriertrocknung beeinflusst werden. Dbei spielen uch Rektivierungsverfhren nch der Gefriertrocknung eine Rolle (Gehrke, 1991). Ausgegngen wurde in der vorliegenden Arbeit von einem stndrdisierten Gefriertrocknungsprozess nch dem Verfhren von Mtos d Silv (2005). Mikroorgnismen sind für ein optimles Arbeiten n ihre normle, physiologische Umgebung dptiert. Extreme Veränderungen in den Umgebungsbedingungen, bweichend von dem Optimum, verurschen einen Stress uf den Orgnismus (Beles, 2003). Die Diplomrbeit htte ds Ziel, den Einfluss der Fermenttion uf die Überlebensfähigkeit, ntgonistische Wirksmkeit und Lgerfähigkeit uf P. fluorescens Bkterien nch der Gefriertrocknung zu untersuchen. Dem Einfluss der Fermenttionsbedingungen uf die Überlebensfähigkeit nch der Gefriertrocknung wurde eine besondere Bedeutung beigemessen. Folgende Fermenttionsbedingungen wurden in Versuchen vriiert: Die Nährmedienzusmmensetzung, die Erhöhung der Tempertur und die Erniedrigung des ph-wertes gegen Ende der exponentiellen und Beginn der sttionären Wchstumsphse. 2
2 Mteril und Methoden 2.1 Chemiklien, Lösungen, Geräte, Mterilien und Softwre Tbelle 1: Chemiklien Chemiklie Hersteller Agr-Agr 700-800 Gel; Insul Ammoniumsulft Merck (1.01217.1000) Borsäure Roth (6943.1) Czpek-Dox-Medium Difco (233810) Di-Ntriumhydrogenphospht- Dihydrt Eisen (II) -sulfthepthydrt Eupren MW6 Merck (1.06580.0500) Merck (3965) Byer Glycerin Merck (8.18709.1000) Kliumdihydrogenphospht Roth (3904.2) Lktose Edelweiss (1298935) Mgnesiumsulft Hepthydrt Merck (05886.1000) Ntriumchlorid Roth (3957.2) Pepton us Csein, pnkretisch verdut Pepton us Sojbohnenmehl ppinisch verdut Proteose-Pepton Nr. 3 Tryptische Sojnährbouillon (TSB) Merck (1.07216) Merck (1.07212.0500) Difco Lbortories (211693) Difco Lbortories (211822) 3
Lösungen: Phosphtpuffer: 0,17 (Gew.-% / Vol.-%) Kliumdihydrogenphospht wsserfrei 0,22 (Gew.-% / Vol.-%) Di-Ntriumhydrogenphospht-Dihydrt in entionisiertem Wsser gelöst und für 20 Min. bei 121 C utoklviert. Lktoselösung: 20 (Gew.-% / Vol.-%) Lktose in entionisiertem Wsser gelöst. Mlzextrktlösung: 0,1 (Gew.-% / Vol.-%) Mlzextrkt in entionisiertem Wsser gelöst. Tbelle 2: Geräte Gerätebezeichnung Hersteller Horizontlschüttler Novotron 3l-Fermenter ISF100 Zentrifuge J-26XP Vibrtionsschüttler Rex 1 Spektrlphotometer 922 Spirlpltter Model C Brutschrnk Lborwge Lyophilistor Advntge Reziprokschüttler ELISA Reder Tecn.Spectr INFORS, Schweiz INFORS, Schweiz Beckmnn Coulter Heidolph UVIKON Spirl Systems, INC. Memmert AND (HF12006) Virtis, USA Köttermnn TECAN Deutschlnd GmbH 4
Tbelle 3: Mterilien Mteril Hersteller Einmlküvette Plstibrnd 10 mm Rotilbo-Mikrotest Pltten und Deckel Serum Phiolen 10 ml mit Verschluss Roth Roth Ismtec Tbelle 4: Softwreprogrmme Softwreprogrmm Hersteller Most Probble Number Clcultor Ver sion 4.04 (c) Albert J. Klee-Risk Reduction Ingineering Lbortory, United Sttes Enviromentl Protection Agency, Cincinnti, Ohio, USA SAS for Windows v 9.1 SAS Institute Inc., Cry, NC, USA Anlysis 3.0 Fermentersoftwre IRIS Lyophilistor Control Wizrd Soft Imging System GmbH, Hmburg, Deutschlnd INFORS, Schweiz Virtis, USA 5
2.2 Mikroorgnismen und ihre Stmmhltung Tbelle 5: Isolte Isolt Nr. Spezies Herkunft Nährmedium Fest Flüssig CHA0 Pseudomons fluorescens ETH, Zürich, Schweiz TSA KB Pf153 Pseudomons fluorescens ETH, Zürich, Schweiz TSA KB WCS365 Pseudomons brsiccerum Universität Leiden, Niederlnde TSA KB 3.1T8 Lysobcter enzymogenes J. Postm, Wgeningen, Niederlnde 1/10 TSA 1/10 TSB Die Lgerung der Mikroorgnismen erfolgte durch Kryokonservierung bei 80 C. Zur Stmmhltung wurden die Orgnismen uf TSA-Schräggrröhrchen kultiviert, bei 5 C gelgert und routinemäßig lle 6-8 Wochen erneuert. Nch Bedrf wurden die Orgnismen uf TSA Pltten überimpft und bei 25 C kultiviert. 6
2.3 Anzucht 2.3.1 Strterkulturen Für die Strterkulturen wurden 30 ml Flüssignährmedium (s. Kp. 2.6.1.1) in 100 oder 50 ml Erlenmeyerkolben gefüllt und 20 Minuten bei 121 C utoklviert. Anschließend wurden die Kolben mit einer vollen Ösenspitze von einer bewchsenen TSA Pltte (s. Kp. 2.2) inokuliert und für 24 h bei 150 Upm und 28 C uf einem Horizontlschüttler inkubiert. Der TSA besteht us 0,3 Gew.-% TSB und 1,5 Gew.-% Agr. 2.3.2 Fermenttion in Kolben Für die Huptkulturen wurden 30 ml Flüssignährmedium (gleich dem der Strterkultur) in 100 ml Erlenmeyerkolben gefüllt und mit 300 µl der Strterkultur (1/100 der Huptkultur) unter sterilen Bedingungen inokuliert. Die Fermenttionszeit betrug je nch Versuchsnstz 15 oder 16 h bei 150 Upm und 28 C uf einem Horizontlschüttler, wie in Abb. 1 drgestellt. Abbildung 1: Horizontlschüttler (INFORS) mit Huptkulturen. 7
2.3.3 Fermenttion in einem 3l-Fermenter Bei den Fermenttionsversuchen wurde usschließlich ds KB-Medium (s. Kp. 2.6.1.1) verwendet. Der über einen Computer, mit der Softwre IRIS steuerbre Fermenter (s. Abb. 2) wurde mit einer ph Elektrode, einer Suerstoffelektrode, einer Antischumelektrode, einem Säure- und Lugeneingng sowie einer Tempertursonde bestückt und komplett utoklviert. Inokuliert wurden 30 ml Strterkultur (1/100 des Fermentiervolumens). Die Fermenttion wurde nch 17 h beendet. Abbildung 2: 3I-Fermenter (INFORS). 8
2.4 Zellernte und Biomssequntifizierung 2.4.1 Zellernte Die Huptkulturen wurden nch Ende der exponentiellen Phse geerntet (s. Kp. 3.1). Anschließend wurden die Orgnismen mithilfe einer Zentrifuge (s. Abb. 3) von ihrer Kulturbrühe getrennt. Somit wurde sichergestellt, dss keine Nährstoffe bzw. Stoffwechselprodukte den folgenden Prozess beeinflussen. Zentrifugiert wurde bei 8000g, für 5 Min. und bei 14 C. Die Kulturbrühe wurde verworfen und die Zellen wurden mit Phosphtpuffer (s. Kp. 2.1) resuspendiert. Dies wurde dreifch wiederholt. Die Proben wurden während der Aufreinigung bei 5 C zwischengelgert. Abbildung 3: Zentrifuge (Beckmn) 9
2.4.2 Trübungsmessung Nch dem Wschvorgng wurden lle Proben durch Zugbe von Phosphtpuffer uf eine optische Dichte von 0,95 ± 0,02 eingestellt. Zuvor wurde eine Klibrierkurve erstellt (s. Kp. 3.1). Die Trübungsmessung erfolgte mit einem Zweistrhl- Spektrlphotometer (UVIKON) (s. Abb. 4). Dbei wurde eine Wellenlänge von 595 nm gewählt, d der ELISA Reder bei der gleichen Wellenlänge misst und vergleichbre Werte produzierte. Als Nullbgleich diente eine mit Phosphtpuffer gefüllte Einmlküvette. Abbildung 4: Zweistrhl-Spektrlfotometer (UVIKON) 10
2.4.3 Koloniebildende Einheiten (KBE Methode) Die KBE Methode erfsst nur die vermehrungsfähigen Zellen. Mithilfe eines Spirlpltters (Spirl Systems) wurde 37 µl einer Zellsuspension der Isolte Pf153, CHA0 und WCS365 uf einer TSA Pltte verteilt (s. Abb. 5). Die Pltten wurden 48 h bei 25 C inkubiert. Ausgew ertet wurde mithilfe der Computersoftwre Anlysis 3.0 (s. Tb. 5). Die KBE Methode wurde sowohl vor ls uch nch der Gefriertrocknung ngewndt. Abbildung 5: Spirlpltter (Spirl Systems) (A); Drehtisch mit einer TSA-Nährgrpltte, links oben im Bild der Schluch, us dem 37 µl usplttiert wurden (B); mit dem Isolt Pf153 bewchsene TSA Pltte (C). 11
2.4.4 Most probble number (MPN Methode) 120 µl TSB Medium (s. Kp. 2.6.2.1) wurden je Kvität in 96 well Mirotiterpltten (s. Kp. 2.1) pipettiert. Dem Versuch entsprechend wurden entweder 4, 6 oder 12 Kvitäten mit 30 µl Probe gefüllt. Die Anzhl der 1:5-Verdünnungsschritte betrug 16. Dnch wurden die beimpften Mikrotiterpltten für mindestens 48h und höchstens 96 h bei 25 C inkubiert. Jede bewchsene Kvität (s. Abb. 6) wurde gezählt und mithilfe der Computersoftwre Most Probble Number Clcultor Version 4.04 (s. Tb. 4) wurde die whrscheinlichste Keimzhl errechnet. Die MPN Methode wurde sowohl vor ls uch nch der Gefriertrocknung ngewndt. Sie liefert uf sttistischem Wege einen groben Schätzwert der Konzentrtion der Keime in der Probe, die in der Lge sind, in einem vorgegebenen, flüssigen Nährmedium zu wchsen. Dbei wird vorusgesetzt, dss die Mikroorgnismen zufällig in der Probe verteilt sind; selbst ds Inokulum von nur einer oder wenigen Zellen der jeweiligen Verdünnungsstufe immer zu einer Wchstumsrektion führt. Unter diesen Bedingungen entspricht die Verteilung der Keimzhlen pro Verdünnungsstufe gewöhnlich einer Poissonverteilung. Den genuesten MPN Wert erhält mn uf einer Verdünnungsstufe, uf der 20 % ller Kvitäten negtiv sind (Bst, 2001). Abbildung 6: MPN Methode: mit dem Isolt Pf153 Vollbewchsene Mikrotiterpltte (A); eine bis zur 13ten Verdünnungsstufe mit dem Isolt Pf153 bewchsene Mikrotiterpltte (B) Die sttistische Auswertung erfolgte mit der Softwre SAS for Windows v 9.1 (s. Tb. 4). Dbei wurde ein Blockmodell benutzt. Ein Block entsprch einer Wiederholung. Die Vrinzhomogenität wurde mithilfe des Levene-Tests (p>0,1) durchgeführt. Der Multiple-Mittelwertsvergleich erfolgte mit dem Student-Newmn-Keuls- Test (p 0,05). 12
2.5 Probenufbereitung und Gefriertrocknung Nch dem Einstellen der optischen Dichte wurde je nch Versuchsnstz 3 ml der Probe unverdünnt, 1,5 ml 1:1 mit einer Lktoselösung (s. Kp. 2.1) oder 1:1 mit VE-Wsser gemischt und unter sterilen Bedingungen in Phiolen gefüllt. Zuvor wurden die utoklvierten Phiolen etikettiert und uf einer Lborwge usgewogen. Für die Biotests (s. Kp. 2.7.2) wurden je Probe 20 Phiolen, für die Lgerungsversuche (s. Kp. 2.8) je Probe cht Phiolen mit 3 ml einer Lktose-Bkteriensuspension befüllt und gefriergetrocknet. Für die Bestimmung der Lebendzellzhl nch der Gefriertrocknung wurden je nch Versuchsnstz, je Probe drei Phiolen mit einer Wsser-Bkteriensuspension und/oder 3 Phiolen mit einer Lktose-Bkteriensuspension gefriergetrocknet. Aus Kpzitätsgründen wurde bei der Gefriertrocknung huptsächlich ds Isolt Pf153 verwendet. Lktose diente während der Gefriertrocknung ls Trägerstoff. Tbelle 6: Prmetereinstellungen des Lyophilistors für die verwendeten Isolte Isolt Prmeter Nr. Tempertur Zeit Vkuum [ C] [min] [mbr] CHA0 5 10 - -70 50 - -20 1080 0,15 Phse Abkühlung Trocknung x x x Pf153 5 20 - -20 315 - -40 685 - -20 1080 0,15 WCS365 5 10 - -70 50 - -20 1080 0,15 x x x x x x x Bei jedem Gefriertrocknungsprozess wurden mindestens 2 und höchstens 6 Referenzen mit gefriergetrocknet. Die Referenzen wurden mit Temperturfühlern versehen und dienten zur Temperturkontrolle der Proben. Die Gefriertrocknung lief über 2 Tge. Am Ende jedes Gefriertrocknungsprozesses wurden die Proben mithilfe einer im Gerät integrierten Pltte unter Vkuum dicht verschlossen. 13
Abbildung 7: Lyophilistor (Virtis) (A); Gefriertrocknungskmmer mit Stellfläche, Kondenstor, Windmühle und Temperturfühler, der ls Referenz in die Probe eingebrcht wurde (B); Verschließvorrichtung im Gefriertrockner (C) Nch der Gefriertrocknung wurden die Proben entweder sofort mit utoklviertem VE-Wsser uf ihr vorheriges Gewicht resuspendiert oder bis zu ihrer Weiterverrbeitung bei -20 C gelgert. Die Resuspendieru ng erfolgte uf einem Reziprokschüttler, bis der Trägerstoff vollständig in Lösung ging. Anschließend wurde die Lebendzellzhl mit Hilfe der KBE- oder MPN-Methode bestimmt. 14
2.6 Untersuchungen zum Einfluss der Fermenttionsbedingungen uf die Überlebensrte nch der Gefriertrocknung Im Rhmen der Untersuchungen zum Einfluss der Fermenttionsbedingungen uf die Überlebensrte der Bkterien nch der Gefriertrocknung wurden die Nährstoff-, Tempertur- und ph-wert Bedingungen vriiert. 2.6.1 Nährmedienzusmmensetzung Im ersten Versuch wurden drei verschiedene Nährmedien (KB2, TSB2, DF2) mit jeweils noch zwei unterschiedlichen Konzentrtionen einer Nährstoffquelle (KB1, KB3, TSB1, TSB3, DF1, DF3) verwendet (s. Tb. 7). Aufgrund der Ergebnisse us dem ersten Versuch (s. Kp. 3.4.1) wurde ein zweiter Versuch mit zusätzlich veränderten Versuchsbedingungen ngesetzt. Aus Pltzmngel wurden nur noch drei Medien (KB1, TSB1 und DF2) verwendet. Beide Versuche wurden dreifch wiederholt. 15
Tbelle 7: Nährmedienzusmmensetzung Nährstoff Nährmedienbezeichnung und Mengenngbe [Gew.-%] KB KB1 KB2 KB3 TSB1 TSB2 TSB3 DF1 DF2 DF3 Sickstoffquelle Pepton us Csein, pnkretisch verdut Pepton us Sojbohnenmehl, ppinisch verdut 0,85 1,7 3,4 0,15 0,3 0,6 Proteose- Pepton Nr. 3 2 2 1 4 Tryptische Soj-Nährbouillon Kohlenstoffquelle Citronensäure - Monohydrt D(+)- Glucose - Monohydrt Glycerin 1 0,1 0,15 0,15 0,15 Slze Ammoniumsulft 0,13 0,25 0,5 0,15 0,3 0,6 0,15 0,3 0,6 0,2 0,2 0,2 Borsäure² 0,01 0,01 0,01 Di-Ntriumhydrogenphospht-Dihydrt Eisen (II)- sulft-hepthydrt 2 Kliumdihydrogenphospht Mgnesiumsulft-Hepthydrt 0,75 0,75 0,75 1 1 1 0,15 0,15 0,15 0,15 0,25 0,25 0,25 0,4 0,4 0,4 0,15 0,15 0,15 0,15 0,02 0,02 0,02 Ntriumchlorid 0,5 0,5 0,5 1 [Vol.-%] 2 [ppm] 16
2.6.2 Tempertureinfluss Zur Untersuchung des Tempertureinflusses wurden die Zellen, wie in Kp. 2.3 beschrieben, nch einer Fermenttionsduer von 15 h, nschließend eine Stunde lng bei 28 C, 35 C ± 1,5 C, 40 C ± 1 C und 45 C ± 0,5 C weiter fermentiert. Hierbei wurde usschließlich ds KB1 Medium verwendet. Auch diese Versuche wurden dreifch wiederholt. 2.6.3 ph-wert Veränderung Dieser Versuch zur Untersuchung des Einflusses einer ph-wert Veränderung uf die Zellen wurde mit KB Medium in einem 3l-Fermenter (s. Kp. 2.3.3) durchgeführt. Die Zeit der Probenhme und die ph-erniedrigung sind der Tb. 8 zu entnehmen. Tbelle 8: ph-wert Erniedrigung und Zeit der Probenhme Zeit der Probenhme [h] ph-wert 15 7 15,5 6 16 5 16,5 4 Die Zellen wren jeweils eine hlbe Stunde der ph-wert Erniedrigung usgesetzt. Zuvor wurden sie 15 h bei ph 7 fermentiert. Dieser Versuch wurde dreifch wiederholt. 17
2.7 Untersuchungen zum Einfluss der Fermenttionsbedingungen uf die ntgonistische Wirksmkeit nch der Gefriertrocknung Zu der Qulität eines ntgonistischen Bkteriums gehört dessen Wirksmkeit gegen phytopthogene Mikroorgnismen. Dzu wurden Biotests nur mit dem Isolt Pf153 (us Kpzitätsgründen), Bohnenblättern und dem Schimmelpilz Botrytis cinere durchgeführt. 2.7.1 Nährmedienzusmmensetzung Für diesen Versuch wurde ds KB1, TSB1 und DF2 Medium verwendet Die Anzucht erfolgte nch Kp. 2.3 und 2.4 und ds Isolt wurde frisch fermentiert. Anschließend wurde ds Isolt 1:1 mit einer 20 % Lktoselösung gemischt, gefriergetrocknet und resuspendiert (s. Kp. 2.5). Die Prmeter der Gefriertrocknungsversuche wurden konstnt gehlten (s. Tb. 6). Nch der Gefriertrocknung wurden die Bkterien mithilfe einer Zentrifuge ufkonzentriert, sodss die Lebendzellzhl dem Wert vor der Gefriertrocknung entsprch. Biotests wurden sowohl vor ls uch nch der Gefriertrocknung durchgeführt. 2.7.2 Biotests Der Schimmelpilz Botrytis cinere wurde 2-3 Wochen uf einem utoklvierten, modifizierten Czpek-Dox-Medium bei 20 C kultivier t. Unter nderem wurde dem Medium nsttt Scchrose Mgermilchpulver zugegeben. Anschließend wurde der Schimmelpilz mit einer 0,1 % Mlzextrktlösung bgeschwemmt. Die filtrierte Lösung wurde mit der Thom-Kmmer uf eine Zellzhl von 5 x 10 8 Kolonien/ml eingestellt. Des Weiteren wurden für den Biotest vierblättrige Bohnenblätter der Sorte Con Amore (drei Stück) in eine mit 50 ml destilliertes Wsser befüllte Gerdschle (20 x 20 x 5 cm) uf ein Drhtgitternetz gelegt (s. Abb. 6) und verschlossen. Ds Wsser diente dzu, die Kmmer feucht zu hlten. Mithilfe einer Grphospritze (Druck: 1 br) (s. Abb. 6) wurde je 1 ml der Proben zuerst uf die Blttunterseite, dnn uf die Blttoberseite gesprüht. Je Probe wurden 4 Boxen verwendet. Als chemischer Stndrd diente Eupren (Wirkstoff: Tolyflunid), ls unbehndelte Kontrolle wurde VE-Wsser ppliziert. Anschließend erfolgte die Appliktion der Blttoberseite mit der Botrytis cinere Suspension (1 ml). 18
Die Inkubtion erfolgte bei 20 C in einem Klimbru tschrnk mit einer Fotoperiode von 16/8 h für fünf Tge. Abbildung 8: Durchführung des Biotests: Gerdschle (20 x 20 x 5 cm) mit Bohnenblättern (A); Sprühppliktion (B) Die Versuchsuswertung erfolgte m fünften Tg. Die Blätter wurden nch einer Befllsklsse von 0 bis 100 usgewertet (s. Tb. 9 und Abb. 9). Tbelle 9: Befllsklssen zur Auswertung eines Biotests % Befll Klssen 0 0 <1 1 1 bis <5 5 5 bis <10 10 10 bis <25 25 25 bis <50 50 50 bis 100 100 19
Abbildung 9: Botrytis cinere-befll n Bohnenblättern bei den Befllsklssen 0, 10, 25, 50 und 100. Die sttistische Auswertung erfolgte mit der Softwre SAS for Windows v9.1(s. Tb. 4). Dbei wurde ein Blockmodell benutzt. Ein Block entsprch einer Wiederholung. Die Vrinzhomogenität wurde mithilfe des Levene-Tests (p>0,1) durchgeführt. Der Multiple-Mittelwertsvergleich erfolgte mit dem Student-Newmn-Keuls-Test (p 0,05). 2.7.3 Tempertureinfluss Zur Untersuchung des Tempertureinflusses uf die Wirksmkeit des Antgonisten Pf153 nch der Gefriertrocknung wurde, wie in Kp. 2.3 beschrieben, nch einer Fermenttionsduer von 15 h eine Stunde lng bei einer Temperturerhöhung weiter fermentiert (s. Kp. 2.6.2) und nschließend unter konstnten Bedingungen (s. Tb. 6) gefriergetrocknet. Die Biotests wurden us Kpzitätsgründen nur nch der Gefriertrocknung erfsst. Die Lebendzellzhl nch der Gefriertrocknung wurde uf 5 x 10 8 Zellen/ml eingestellt. Auch diese Versuche wurden dreifch wiederholt. 20
2.8 Untersuchungen zum Einfluss der Fermenttionsbedingungen uf die Lgerfähigkeit nch der Gefriertrocknung Im Rhmen der Untersuchungen zum Einfluss der Fermenttionsbedingungen uf die Lgerfähigkeit des Isolts Pf153 nch der Gefriertrocknung wurden die Nährstoff- und Temperturbedingungen vriiert. Die Lgerfähigkeit, ds heißt die Stbilität gefriergetrockneter Mikroorgnismen über einen längeren Zeitrum bei bestimmten Bedingungen, die Lebensfähigkeit beizubehlten, ist eine weitere Qulitätsnforderung n den Orgnismus. 2.8.1 Nährmedienzusmmensetzung Für diesen Versuch wurde ds KB1, TSB1 und DF2 Medium verwendet. Ds Isolt frisch fermentiert. Die Anzucht erfolgte nch Kp. 2.3 und 2.4. Ds Isolt wurde 1:1 mit einer 20 % Lktoselösung gemischt, gefriergetrocknet und resuspendiert (s. Kp. 2.5). Die Prmeter der Gefriertrocknungsversuche wurden konstnt gehlten (s. Tb. 6). Nch der Gefriertrocknung wurden die Proben über zwei Wochen bei 30 C und über drei Wochen bei 20 C unter Vkuum verschlossen gelgert. Einml pro Woche wurde von jeder Probe die Lebendzellzhl mit der MPN Methode bestimmt. Dieser Versuch wurde dreifch durchgeführt. 2.8.2 Tempertureinfluss Zur Untersuchung des Tempertureinflusses uf die Lgerfähigkeit des Antgonisten Pf153 nch der Gefriertrocknung wurde er wie in Kp. 2.3 beschrieben nch einer Fermenttionsduer von 15 h nschließend eine Stunde lng bei einer Temperturerhöhung weiter fermentiert (s. Kp. 2.6.2) und dnch unter konstnten Bedingungen (s. Tb. 6) gefriergetrocknet. Nch der Gefriertrocknung wurden die Proben über fünf Wochen bei 20 C unter Vkuum verschlossen gelgert. Einml pro Woche wurde von jeder Probe die Lebendzellzhl mit der MPN Methode bestimmt. Auch diese Versuche wurden dreifch wiederholt. 21
3 Ergebnisse 3.1 Photometrische Bestimmung des Wchstums Zunächst wurde die Korreltion zwischen optischer Dichte und Lebendzellzhl nch der Methode von Drews (1976) und Steinbüchel & Oppermnn-Snio (2003) drgestellt. Ds Ziel dieses Versuches wr es, den lineren Bereich zur photometrischen Einstellung der Zelldichte für die vier Isolte (s. Kp. 2.2) zu erfssen (s. Abb. 10). Der Versuch diente ls Vorversuch für die Biomssequntifizierung. Vor der Gefriertrocknung wurde die Trübungsmessung durchgeführt. Hierbei wurden die Zellsuspensionen uf eine optische Dichte (OD) von 0,95 ± 0,02 eingestellt. 10 12 10 11 Isolt Pf153 Isolt CHA0 Isolt WCS365 Isolt 3.1T8 Lebendzellzhl [MPN/ml] 10 10 10 9 10 8 10 7 10 6 0.1 1 OD bei 595 [nm] Abbildung 10: Korreltion zwischen optischer Dichte und Lebendzellzhl von Pseudomons fluorescens Pf153 und CHA0, Pseudomons brsiccerum WCS365 und Lysobcter enzymogenes 3.1T8 Die Isolte wurden für 24 h in KB Medium fermentiert und nschließend ufgereinigt. 22
Um den Übergng von der exponentiellen Phse in die sttionäre Phse zu bestimmen, wurden die Isolte Pf153 und CHA0 in neun verschiedenen Nährmedien kultiviert. Dbei wurde die Zunhme der Biomsse über die OD erfsst (s. Abb. 11+12). TSB1 TSB2 TSB3 DF1 DF2 DF3 KB1 KB2 KB3 OD bei 595 [nm] 1.0 0.1 0 4 8 12 16 20 24 28 Zeit [h] Abbildung 11: Wchstum von Pf153 in neun verschiedenen Flüssignährmedien Die Punkte zeigen den Mittelwert us je zwei Messungen n. 23
TSB1 TSB2 TSB3 DF1 DF2 DF 3 KB1 KB2 KB3 OD bei 595 [nm] 1 0.1 0 4 8 12 16 20 24 28 Zeit [h] Abbildung 12: Wchstum von CHA0 in neun verschiedenen Flüssignährmedien Die Punkte zeigen den Mittelwert us je zwei Messungen n. Bei hoher Glucose- und Zitronensäurekonzentrtion im Nährmedium (DF3) konnte bei beiden Isolten kein Wchstum beobchtet werden. Bei niedriger Glucose- und Zitronensäurekonzentrtion im Nährmedium (DF1) zeigte sich bei beiden Isolten nch 16 h kein Zellwchstum mehr. Möglicherweise wr hier ds Substrt verbrucht. Für den weiteren Versuchsvorgng wurde die Zellsuspension nch 16 h geerntet und uf eine optische Dichte von 0,95 ± 0,02 eingestellt. 24
3.2 Methodenvergleich zur Biomssequntifizierung Für die Folgeversuche wurde eine geeignete Methode zur Bestimmung der Lebendzellzhl gesucht. Hierbei wurde die KBE Methode (Koloniebildende Einheiten) mit der MPN Methode (most probble number) verglichen. Die Auswhlkriterien n die Methoden wren Zeitbedrf, Genuigkeit und Mterilufwnd. 3.2.1 KBE Methode Die Lebendzellzhlen des Isolts Pf153 wurde vor und nch der Gefriertrocknung mithilfe der KBE Methode erfsst (s. Abb. 13). Verdünnung10 6 Verdünnung 10 4 10 10 nicht gefriergetrocknet, Inkubtionsduer 24h gefriergetrocknet, Inkubtionsduer 24h 10 10 nicht gefriergetrocknet, Inkubtionsduer 28h nicht gefriergetrocknet, Inkubtionsduer 52h gefriergetrocknet, Inkubtionsduer 42h Lebendzellzhl [KBE/ml] 10 9 10 8 10 7 Lebendzellzhl [KBE/ml] 10 9 10 8 10 7 10 6 TSB1 DF2 KB1 10 6 TSB1 DF2 KB1 Nährmedien Nährmedien Abbildung 13: KBE Methode: Isolt Pf153 nicht gefriergetrocknet und gefriergetrocknet, bei einer Verdünnung von 10 6 und 10 4 und einer Inkubtionsduer von 24, 28, 42 und 52 h 25
Die nicht gefriergetrockneten 10 6 verdünnten Proben zeigten leicht höhere KBE Werte gegenüber den nicht gefriergetrockneten 10 4 verdünnten Proben. Beim Vergleich der 10 6 verdünnten Proben nch der Gefriertrocknung gegenüber dem Zustnd vor der Gefriertrocknung wren niedrigere KBE Werte zu verzeichnen. Dss die Inkubtionszeit und somit uch die Schnelligkeit der Methode eine Rolle spielt, wird us der Abbildung 13 ebenflls deutlich. Zu kurz wr die Inkubtionszeit (28 h) bei den nicht gefriergetrockneten 10 4 verdünnten Proben. Dies verdeutlichen die 10 4 verdünnten Proben, die 52 h inkubiert wurden. Bei den 10 6 verdünnten Proben wr kein Unterschied bezogen uf die Inkubtionszeit zu erkennen (nicht grphisch drgestellt). Ds TSB1 Medium bei den 10 4 verdünnten Proben zeigte die höchste Überlebensrte. 26
3.2.2 MPN Methode Ds Isolt Pf153 wurde in drei verschiedenen Flüssignährmedien nch den gleichen Gefriertrocknungsbedingungen gefriergetrocknet wie bei dem Versuch mit der KBE Methode (s. Kp. 3.2.1). Der Unterschied wr, dss hier die Lebendzellzhl mithilfe der most probble number (MPN Methode) bestimmt wurde (s. Abb. 14). 10 9 nicht gefriergetrocknet gefriergetrocknet Lebendzellzhl/ml 10 8 10 7 10 6 TSB1 DF2 KB1 Medium Abbildung 14: MPN Methode: Isolt Pf153 nicht gefriergetrocknet und gefriergetrocknet, die Inkubtionszeit betrug 72h Die MPN Methode ist ungenuer ls die KBE Methode. Dies wurde bei dem TSB1 Medium in Abb. 14 deutlich. Hier lg die Zellzhl nch der Gefriertrocknung höher ls vor der Gefriertrocknung. Verglichen mit dem vorherigen Vorversuch, unter Verwendung der KBE Methode wren die Zellzhlen llgemein etws niedriger und die Inkubtionszeit wr länger (72 h). Bei beiden Vorversuchen wr die höchste Überlebensrte bei dem TSB1 Medium zu erkennen. 27
3.3 Temperturvergleiche während des Gefriertrocknungsvorgnges Hierbei wurde der Temperturverluf während der Gefriertrocknung untersucht (s. Abb.15). Die Tempertur wurde lle zwei Minuten ufgezeichnet. Ziel dieses Vorversuchs wr es, den Einfluss von Lktose ls Schutzstoff uf den Temperturverluf während der Gefriertrocknung zu erfssen. Dbei wurde der Orgnismus Pf153 verwendet. Dieser wurde 1:1 mit einer Lktoselösung und 1:1 mit VE- Wsser gefriergetrocknet. 30 20 Temperturfühler Nr.1: mit Lktose Temperturfühler Nr.2: ohne Lktose 10 Tempertur [ C] 0-10 -20 eutektischer Punkt Eissublimtion -30-40 0 500 1000 1500 2000 Zeit [min] Trocknung Abbildung 15: Temperturverluf während der Gefriertrocknung, Temperturfühler Nr.1: Zellen 1:1 mit einer Lktoselösung gemischt; Temperturfühler Nr.2: Zellen 1:1 mit VE-Wsser gemischt 28
Der Vorversuch wurde deshlb durchgeführt, weil bei einigen Folgeversuchen nicht nur Proben mit Lktoselösung, sondern uch Proben ohne Lktoselösung verwendet wurden. Aus Abbildung 15 lässt sich erkennen, dss es keinen großen Unterschied beim Temperturverluf während der Gefriertrocknung im Vergleich zwischen den Proben mit Lktose und denen ohne Lktose gibt. Die Zellen befnden sich zu Beginn der Gefriertrocknung in der Abkühlungsphse. Hier wird bei beiden Proben etw bei -7 C e in eutektisches Verhlten sichtbr. Es wurde weiterhin lngsm bis -35 C bg ekühlt, dnch folgte die Eissublimtion und die Trocknung setzte mit 0,15 mbr Vkuum ein. Dieser Bereich erstreckt sich ungefähr von 10 bis -35 C. Nch 18 h ist ds gesmte Eis sublimiert und die Trocknung konnte zum Abschluss gebrcht werden. 29
3.4 Einfluss der Fermenttionsbedingungen uf die Überlebensrte nch der Gefriertrocknung Ds Ziel dieser Versuche wr es, den Einfluss der Fermenttionsbedingungen (Nährmedienzusmmensetzung oder Tempertureinfluss) uf die Überlebensrte der Isolte Pf153 und CHA0 nch der Gefriertrocknung zu untersuchen. Dbei blieben die Bedingungen des Lyophilistors konstnt. Lktose diente ls Schutzstoff während des Gefrierens. 3.4.1 Nährmedienzusmmensetzung Der Einfluss verschiedener Nährstoffquellen uf die Lebendzellzhl gefriergetrockneter P. fluorescens wurde nhnd dieser Versuche gezeigt. Zur Bestimmung der Lebendzellzhl sowohl vor ls uch nch der Gefriertrocknung wurde die KBE Methode gewählt. 1 0 1 0 n ic h t g e frie rg e tro c k n e t g e frie rg e tro c k n e t Überlebensrte [KBE/ml] 1 0 9 1 0 8,b -c c, d c, d, b b -d, b c,d,b d d,b e 1 0 7 1 0 6 T S B 1 T S B 2 T S B 3 D F 1 D F 2 K B 1 K B 2 K B 3 N ä h rm e d ie n Abbildung 16: Einfluss des Fermenttionsmediums uf die Lebensfähigkeit [KBE/ml] des Isolts Pf153 nch der Gefriertrocknung Die Fehlerblken geben die Stndrdbweichung der Werte von drei Versuchen mit jeweils vier Wiederholungen n. Bei verschiedenen Buchstben (-e) unterscheiden sich die log 10 trnsformierten KBE Werte in llen Medien nch Anlyse mit dem Student-Newmn-Keuls-Test (p 0,05) signifiknt. 30
Die Lebendzellzhl unterschied sich bei llen verwendeten Nährmedien vor dem Gefriertrocknungsprozess nicht signifiknt. Bei den Nährmedien TSB1 und DF1 wr kein signifiknter Unterschied in der Lebendzellzhl vor und nch dem Gefriertrocknen zu erkennen. Bei llen nderen Nährmedien wr ein signifiknter Unterschied vor und nch dem Gefriertrocknen vorhnden. Die Lebendzellzhlen nch der Gefriertrocknung wren bei dem TSB1, TSB2, TSB3, DF1 und DF2 Medium nicht signifiknt verschieden. Ds gleiche glt für die KB1, KB2, DF1, DF2, TSB2 und TSB3 Medien. Auffiel, dss die Lebendzellzhl von dem KB3 Medium nch der Gefriertrocknung im Vergleich zu llen nderen Nährmedien signifiknt niedriger wr. Tbelle 10: Einfluss des Fermenttionsmediums uf die Überlebensrte des Isolts Pf153 nch der Gefriertrocknung (mit Lktose) Nährmedien Überlebensrte [%] Stndrdbweichung [%] Signifiknz** TSB1 75,5* 34,0 A TSB2 45,3 35,4 A B TSB3 44,0 22,0 A B DF1 62,4 42,1 A B DF2 96,3 52,7 A B KB1 34,2 12,1 A B KB2 35,8 20,0 A B KB3 30,2 27,7 B * Mittelwert us drei Wiederholungen ** Bei verschiedenen Buchstben unterschieden sich die rcsinus trnsformierten Überlebensrten in llen Nährmedien nch Anlyse mit dem Student- Newmn-Keuls-Test (p 0,05) signifiknt. Die Überlebensrten schwnkten zwischen 30 und 96 %. Ds DF2 Medium wies die höchste Überlebensrte und ds KB3 Medium die niedrigste Überlebensrte uf. Die große Stndrdbweichung kommt dher, dss sich die Wiederholungen selbst signifiknt voneinnder unterschieden. Die erste Wiederholung unterschied sich signifiknt von der zweiten und dritten. Die zweite und dritte Wiederholung unterschieden sich nicht signifiknt voneinnder. Ds DF2 Medium wies bei der ersten Wiederholung eine Überlebensrte von 36 %, bei der zweiten und dritten Wiederholung eine Überlebensrte über 100 % uf. 31
Die TSB1- und KB3-Medien unterschieden sich in ihren Überlebensrten signifiknt voneinnder. 10 10 nicht gefriergetrocknet gefriergetrocknet Lebendzellzhl [KBE/ml] 10 9 10 8, b c, b, b, b c c c c c, b b c d 10 7 10 6 TSB1 TSB2 TSB3 DF1 DF2 KB1 KB2 KB3 Nährmedien Abbildung 17: Einfluss des Fermenttionsmediums uf die Lebensfähigkeit [KBE/ml] des Isolts CHA0 nch der Gefriertrocknung Die Fehlerblken geben die Stndrdbweichung der Werte von drei Versuchen mit jeweils vier Wiederholungen n. Bei verschiedenen Buchstben (-d) unterscheiden sich die log 10 trnsformierten KBE Werte in llen Medien nch Anlyse mit dem Student-Newmn-Keuls-Test (p 0,05) signifiknt. Bei diesem Versuch unterschieden sich lle Nährmedien nch der Gefriertrocknung signifiknt von denen vor der Gefriertrocknung. Aber uch die nicht gefriergetrockneten Zellsuspensionen unterschieden sich signifiknt. Dies könnte uf die Einstellung der optischen Dichte zurückzuführen sein. Obwohl die optische Dichte bei llen Zellsuspensionen uf 0,95 ± 0,02 eingestellt wurde, bedeutet dies nicht, dss sie die gleiche Anzhl n Lebendzellzhlen htten. So lg die Lebendzellzhl im KB3 Medium mit 5 x 10 8 KBE/ml signifiknt niedriger 32
ls beispielsweise die Lebendzellzhl in dem DF1 Medium mit 1,5 x 10 9 KBE/ml. Eine Gemeinsmkeit mit dem Isolt Pf153 wr, dss uch hier die Lebendzellzhl des KB3 Mediums nch der Gehfriertrocknung im Vergleich zu llen nderen Nährmedien signifiknt niedriger wr. Tbelle 11: Einfluss des Fermenttionsmediums uf die Überlebensrte des Isolts CHA0 nch der Gefriertrocknung (mit Lktose) Nährmedien Überlebensrte [%] Stndrdbweichung [%] Signifiknz** TSB1 39,9* 16,9 A TSB2 32,6 9,5 A TSB3 37,9 24,1 A DF1 17,8 9,1 A DF2 22,3 6,6 A KB1 39,8 25,3 A KB2 29,7 15,5 A KB3 21,6 4,3 A * Mittelwert us drei Wiederholungen ** Bei verschiedenen Buchstben unterschieden sich die rcsinus trnsformierten Überlebensrten in llen Nährmedien nch Anlyse mit dem Student-Newmn-Keuls-Test (p 0,05) signifiknt. Die Überlebensrten schwnkten zwischen 18 und 40 %. Ds TSB1 Medium wies die höchste und ds DF1 Medium die niedrigste Überlebensrte uf. Verglichen mit den Überlebensrten des Isolts Pf153 htte ds Isolt CHA0 je Medium niedrigere Überlebensrten. Ds DF2 Medium zeigte bei dem Isolt Pf153 die höchste Überlebensrte (96,3) und bei dem CHA0 eine deutlich geringere Überlebensrte (22,3). Ds KB3 Medium zeigte bei beiden Isolten eine geringe Überlebensrte. Bei dem CHA0 Isolt unterschied sich die erste Wiederholung uch signifiknt von der zweiten und dritten Wiederholung, ws die hohe Stndrdbweichung erklärte. Ein weiterer Versuch wurde durchgeführt, hierbei wurden uch Zellsuspensionen ohne Lktoselösung mit gefriergetrocknet. Alle nderen Versuchsbedingungen blieben unverändert. 33
mit Lktose ohne Lktose 10 10 nicht gefriergetrocknet gefriergetrocknet 10 10 nicht gefriergetrocknet gefriergetrocknet Lebendzellzhl [MPN/ml] 10 9 10 8 10 7 Lebendzellzhl [MPN/ml] 10 9 10 8 10 7 b b b b b 10 6 TSB1 DF2 KB1 10 6 TSB1 DF2 KB1 Nährmedien Nährmedien Abbildung 18: Einfluss des Fermenttionsmediums uf die Lebensfähigkeit [MPN/ml] des Isolts Pf153 nch der Gefriertrocknung (mit und ohne Lktose) Die Fehlerblken geben die Stndrdbweichung der Werte von vier Versuchen mit jeweils zwei Wiederholungen n. Bei verschiedenen Buchstben (,b) unterscheiden sich die log 10 trnsformierten MPN Werte (linke Abb.) und die originlen MPN Werte (rechte Abb.) in llen drei Medien nch Anlyse mit dem Student-Newmn-Keuls-Test (p 0,05) signifiknt. Die nicht gefriergetrockneten und gefriergetrockneten Nährmedien mit Lktose unterschieden sich nicht signifiknt. Verglichen mit dem ersten Versuch stimmte dies nur mit dem TSB1 Medium überein. Bei den TSB1 und KB1 Medien ohne Lktose wurden keine signifiknten Unterschiede zwischen den nicht gefriergetrockneten und gefriergetrockneten Proben festgestellt. Ds DF2 Medium ohne Lktose, welches nicht gefriergetrocknet wr, zeigte im Vergleich zu llen nderen Nährmedien eine signifiknt höhere Lebendzellzhl. 34
Tbelle 12: Einfluss des Fermenttionsmediums uf die Überlebensrte des Isolts Pf153 nch der Gefriertrocknung (mit und ohne Lktose) Nährmedien Überlebensrte [%] Signifiknz** TSB1 mit Lktose 53,9* A DF2 mit Lktose 56,2 A KB1 mit Lktose 65,2 A TSB1 ohne Lktose 4,6 B DF2 ohne Lktose 9,2 B KB1 ohne Lktose 7,9 B * Mittelwert us vier Wiederholungen ** Bei verschiedenen Buchstben unterschieden sich die rcsinus trnsformierten Überlebensrten in llen Nährmedien (mit und ohne Lktose) nch Anlyse mit dem Student-Newmn-Keuls-Test (p,05) signifiknt. Die Überlebensrten der Nährmedien ohne Lktose unterschieden sich nicht signifiknt. Die Überlebensrten der Nährmedien mit Lktose unterschieden sich ebenflls nicht signifiknt, ws sich mit dem ersten Versuch deckte. Ds KB1 Medium mit Lktose zeigte die höchste Überlebensrte und ds TSB1 Medium ohne Lktose die Niedrigste. 35
3.4.2 Tempertureinfluss In diesem Versuch wurde geprüft, inwieweit eine Erhöhung der Fermenttionstempertur m Ende des exponentiellen Wchstums die Lebensfähigkeit nch der Gefriertrocknung beeinflusst (s. Abb. 19). Hierbei wurden usschließlich ds KB1 Medium und ds Isolt Pf153 verwendet. Um einen Einfluss des Trägerstoffes uszuschließen, wurde der Versuch uch mit Zellsuspensionen ohne Lktose durchgeführt. mit Lktose ohne Lktose Lebendzellzhl [MPN/ml] 10 10 nicht gefriergetrocknet gefriergetrocknet 10 9 10 8 10 7 Lebendzellzhl [MPN/ml] 10 10 nicht gefriergetrocknet gefriergetrocknet 10 9 10 8,b,b 10 7,b b 10 6 10 5 10 4 10 6 28 35 40 45 10 3 28 35 40 45 Tempertur [ C] Tempertur [ C] Abbildung 19: Einfluss einer Tempertureinwirkung m Ende der Fermenttion uf die Lebensfähigkeit [MPN/ml] des Isoltes Pf153 Die Fehlerblken geben die Stndrdbweichung ller Werte (mit Lktose) und der Mittelwerte (ohne Lktose) von drei Versuchen n. Bei verschiedenen Buchstben (,b) unterscheiden sich die log 10 trnsformierten MPN Werte in llen Medien nch Anlyse mit dem Student-Newmn-Keuls-Test (p 0,05) signifiknt. Bei dem Isolt Pf153 mit Lktose wr kein signifiknter Unterschied in der Lebendzellzhl vor und nch der Gefriertrocknung in Abb. 19 (linkes Bild) zu erkennen. Ds heißt, der Tempertureinfluss htte keine signifiknten Auswirkungen uf ds gefriergetrocknete Isolt. Bei einem Tempertureinfluss von 40 C zeigte ds I solt ohne Lktose signifiknte Unterschiede in der Lebendzellzhl vor und nch der Gefriertrocknung. Alle 36
nderen Tempertureinflüsse htten keinen signifiknten Einfluss uf ds Isolt Pf153 ohne Lktose im Bezug uf vor und nch der Gefriertrocknung. Die Tbelle 13 zeigt einen Überblick der reltiven Überlebensrten des Isolts Pf153 nch dem Tempertureinfluss. Tbelle 13: Einfluss einer Temperturveränderung m Ende der Fermenttion uf die Überlebensrte des Isolts Pf153 nch der Gefriertrocknung (mit und ohne Lktose) Tempertur [ C] Überlebensrte [%] Signifiknz ** Überlebensrte [%] Signifiknz** mit Lktose ohne Lktose 28 42* A 2.3* B 35 70 A 3.3 B 40 55 A 0.8 B 45 60 A 4.5 B * Mittelwert us drei Wiederholungen ** Bei verschiedenen Buchstben unterschieden sich die rcsinus trnsformierten Überlebensrten bei jedem Tempertureinfluss nch Anlyse mit dem Student-Newmn-Keuls-Test (p 0,05) signifiknt. Der 35 C Tempertureinfluss wies bei dem Isolt mi t Lktose die höchste Überlebensrte (70 %) uf (s. Abb. 13). Bei gleicher Tempertur mit der Probe ohne Lktose betrug die Überlebensrte nur 3 %. Im Gegenstz hierzu wies der 40 C Tempertureinfluss bei dem Isolt ohne Lktose die niedrigste Überlebensrte uf (0,8 %). Deutlich zu erkennen wren die extrem niedrigeren Überlebensrten bei llen Tempertureinflüssen uf ds Isolt ohne Lktose ls Schutzstoff nch der Gefriertrocknung. Diese unterschieden sich uch signifiknt von den Überlebensrten des Isolts mit Lktose. Innerhlb der Tempertureinflüsse uf ds Isolt mit oder ohne Lktose gb es keine signifiknten Unterschiede. 37
3.4.3 ph-wert Veränderung Im Rhmen dieses Versuchs sollte herusgefunden werden, inwieweit eine Erniedrigung des ph-wertes m Ende des exponentiellen Wchstums die Lebensfähigkeit nch der Gefriertrocknung beeinflusst (s. Abb. 20). Dieser Versuch wurde mit dem KB Medium in einem 3l-Fermenter (s. Kp. 2.3.3) und mit Lktose ls Trägerstoff während der Gefriertrocknung durchgeführt. Die Zellen wurden bei einem ph-wert von 7 fermentiert. Erst zum Ende der Fermenttion wurden die Zellen jeweils eine hlbe Stunde lng der ph-wert Veränderung usgesetzt. 10 10 nicht gefriergetrocknet gefriergetrocknet 10 9 10 8 Lebendzellzhl [MPN/ml] 10 7 10 6 10 5 b c 10 4 10 3 4 5 6 7 ph- W ert Abbildung 20: Einfluss einer ph-wert Veränderung m Ende der Fermenttion uf die Lebensfähigkeit [MPN/ml] von dem Isolt Pf 153 nch der Gefriertrocknung. Die Fehlerblken geben die Stndrdbweichung der Mittelwerte von je drei Versuchen mit jeweils zwei Wiederholungen n. Bei verschiedenen Buchstben (,b) unterscheiden sich die log 10 trnsformierten MPN Werte in llen Medien nch Anlyse mit dem Student-Newmn-Keuls-Test (p 0,05) signifiknt. 38
Bei einer ph-wert-veränderung von vier fiel die Lebendzellzhl strk b. Deutlich zu sehen wr in Abb. 20 uch, dss bei der ph 4 Probe ds nicht gefriergetrocknete Isolt Pf153 signifiknt verschieden zu dem gefriergetrockneten wr. Ds nicht gefriergetrocknete Isolt bei einem ph-wert von sieben, sechs und fünf unterschied sich nicht signifiknt zu dem jeweiligen gefriergetrockneten Isolt. Der reltive Bezug der Lebendzellzhlen nch der ph-wert Veränderung vor und nch der Gefriertrocknung wurde ebenflls untersucht. Die Überlebensrten des Isolts Pf153 bei den einzelnen ph-wert- Veränderungen 7, 6, 5 und 4 unterschieden sich voneinnder; sie fielen mit der ph Wert Erniedrigung b. Eine 15 h Fermenttion bei einem ph-wert von 7 zeigte eine 88 %-ige Überlebensrte. Die ph-wert Veränderung nch 15 h Fermenttion von ph 7 uf 6 für nur eine hlbe h zeigte eine Überlebensrte von 71 %. Eine weitere ph-wert-erniedrigung nch 15,5 h Fermenttion von ph 6 uf ph 5 zeigte eine Überlebensrte von 61 %. Und die niedrigste Überlebensrte (13 %) zeigte die ph-wert-erniedrigung nch einer Fermenttionsduer von 16 h uf einen ph-wert von 4. Bei keiner ph-wert- Veränderung trt bei dem Isolt Pf153 die höchste Überlebensrte uf. 39
3.5 Einfluss der Fermenttionsbedingungen uf die ntgonistische Wirksmkeit nch der Gefriertrocknung Die Wirksmkeit des Isolts Pf153 wurde gegen Botrytis cinere n Bohnenblättern getestet. Ziel dieses Versuches wr es, den Einfluss der Fermenttionsbedingungen (Nährmedienzusmmensetzung oder Temperturveränderung) uf die ntgonistische Wirksmkeit nch der Gefriertrocknung hin zu untersuchen. 3.5.1 Nährmedienzusmmensetzung Zunächst wurde der Einfluss der Fermenttionsnährmedien uf die Wirksmkeit vor und nch der Gefriertrocknung getestet (s. Abb. 21). 100 90 80 70 nicht gefriergetrocknet gefriergetrocknet 60 50 b b b b b b 40 Befll [%] 30 c c 20 10 positiv Kontrolle KB 1 TSB 1 DF 2 Eupren Fermenttionsmedium Abbildung 21: Einfluss des Fermenttionsmediums uf die ntgonistische Wirksmkeit des Isolts Pf153 nch der Gefriertrocknung Die Fehlerblken geben die Stndrdbweichung ller Werte us vier Versuchen mit jeweils vier Wiederholungen n. Bei verschiedenen Buchstben (-c) unterscheiden sich die rcsinus trnsformierten Werte nch Anlyse mit dem Student-Newmn-Keuls-Test (p 0,05) signifiknt. 40
Die untersuchten Nährmedien unterschieden sich untereinnder bezogen uf ihre ntgonistische Wirksmkeit nicht signifiknt. Im Vergleich zu den positiv und negtiv Kontrollen wr ein signifiknter Unterschied bei llen drei Nährmedien zu beobchten. Aus Abb. 21 ließ sich schließen, dss die entscheidenden Metbolite trotz der verschiedenen Nährmedien mit ihren jeweils unterschiedlichen Nährstoffquellen nch der Gefriertrocknung gebildet wurden und gegen Botritys cinere wirkten. 41
3.5.2 Tempertureinfluss Bei diesem Versuch wurde der Tempertureinfluss m Ende der Fermenttion uf die ntgonistische Wirksmkeit nch der Gefriertrocknung getestet (s. Abb. 22). Ds Isolt Pf153 ist ein Antgonist gegen Botrytis cinere. 100 90 80 70 60 50 40 b b b b Befll [%] 30 20 c 10 positiv Kontrolle 28 C 35 C 40 C 45 C Eupren Tempertureinwirkung Abbildung 22: Einfluss der Tempertureinwirkung m Ende der Fermenttion uf die ntgonistische Wirksmkeit des Isolts Pf153 nch der Gefriertrocknung Die Fehlerblken geben die Stndrdbweichung von den Originlwerten us drei Versuchen mit jeweils vier Wiederholungen n. Bei verschiedenen Buchstben unterscheiden sich die rcsinus trnsformierten Werte nch Anlyse mit dem Student-Newmn-Keuls-Test (p 0,05) signifiknt. Die unterschiedlichen Tempertureinwirkungen htten verglichen mit der 28 C Probe keinen signifiknten Einfluss ufeinnder (s. Abb. 22). Die Temperturproben unterschieden sich ber gemeinsm signifiknt von der positiven und negtiven Kontrolle. 42
3.6 Einfluss der Fermenttionsbedingungen uf die Lgerfähigkeit nch der Gefriertrocknung Ds Isolt Pf153 wurde uf seine Lgerfähigkeit nch der Gefriertrocknung getestet. Ziel dieser Versuche wr es, heruszufinden, ob es einen Einfluss der Fermenttionsbedingungen (Nährmedienzusmmensetzung und Tempertureinfluss) uf die Lgerfähigkeit von gefriergetrockneten Zellen während der Gefriertrocknung gb. Die Lgerfähigkeit wurde über einen Zeitrum von bis zu fünf Wochen geprüft. 3.6.1 Nährmedienzusmmensetzung Ziel dieser Versuche wr es, festzustellen, ob die Nährmedienzusmmensetzung während der Fermenttion eine Auswirkung uf die Lgerfähigkeit des Isolts Pf153 nch der Gefriertrocknung ufweist. Dbei wurde ds KB1-, TSB1- und DF2-Medium verwendet. Die Lgertempertur betrug 20 C und 30 C. Die 20 C Proben wurden bis zu drei Wochen (s. Abb. 23), die 30 C Proben bis zu zwei Wochen (s. Abb. 24) gelgert. Die Auswirkung der unterschiedlichen Lgertemperturen und der Unterschied zwischen gelgerten und nicht gelgerten Proben wurde miteinnder verglichen. 43