Abteilung für Allgemein-, Viszeral- und Transplantationschirurgie Prof. Dr. D. Henne-Bruns

Abteilung für Allgemein-, Viszeral- und Transplantationschirurgie Prof. Dr. D. Henne-Bruns Der Periphere Benzodiazepin Rezeptor Ist Überexpremiert Im Humanen Pankreas Karzinom Und Sein Ligand Induziert Den Zelltod In Vitro Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm Anton Gregić Geburtsort Ulm 2005 1

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Amtierender Dekan: Prof. Dr. Klaus-Michael Debatin 1. Berichterstatter: PD Dr. Susanne Gansauge 2. Berichterstatter: PD Dr. Mathias Schmid Tag der Promotion: 14.12.2006 3

Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis... 4 1. Einleitung... 6 2. Material & Methoden... 11 2.1 Materialien:... 11 2.3 Zelllinien... 13 2.5 Zellkultur... 15 2.6 Zellzyklusanalyse... 16 2.7 Bisbenzimid Färbung... 17 2.8 Durchflußzytometrie zum Nachweis des pbr... 18 2.9 Cytochorm C Messung... 18 2.10 Immunhistochemische Färbung... 19 2.11 Quantifikation der Immunhistochemischen Färbung... 22 2.12 Western Blot Analyse... 23 2.13 Statistische Analyse... 26 3.Ergebnisse... 27 3.1.Zellzyklus Analyse... 27 3.2. Expression des pbr in Pankreaskarzinomlinien... 35 3.3. Cytochrom C... 36 3.4. Bisbenzimidfärbung... 39 3.5. Immunhistochemische Färbung... 40 3.6. Western Blot Analysen zur Expression des pbr im Pankreaskarzinom.. 42 4.Diskussion... 44 5.Zusammenfassung... 48 6.Literaturverzeichnis... 49 7. Danksagung... 55 8. Lebenslauf... Fehler! Textmarke nicht definiert. 4

Abkürungsverzeichnis 8D7 ABC AsPC1 ATP APS BSA CD CEA CyC DAB DMEM DMSO DPBS ECL-Kit EDTA FACScan FCS FITC GABA Kd ma pbr: PBS PT (PTPC) Tris SDS monoklonaler Antikörper Avidin Biotin Complex Pankreaskarzinomzelllinie Adenintriphosphat Ammonium Persulfate Electrophoresis Agent Bovine Serum Albumin Cluster of Differentation Carcino Embryonic Antigen Cytochrom C Diaminobenzidin-tetrahydrocholid Dulbecco s modified Eagle Medium Dimethylsulfoxid Dulbecco s Phosphate Buffered Saline Enhanced Chemiluminescence Kit Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Fluoreszenz-aktivierter Flow Cytometer Fetal Calf Serum Fluoreszeinisothiocyanat Gamma Amino Buttersäure Kilodalton Milli Ampere peripherer Benzodiazepinrezeptor Phosphate Buffered Saline permeability transition Hydroxymethyl Aminomethan Sodium Dodecyl Sulfat 5

1. Einleitung Den dauerhaften Gebrauch von Diazepam, einem Benzodiazepin, assoziierte man in den Achtziger Jahren des letzten Jahrhunderts, mit einem Benefit in der Therapie bei an Brustkrebs erkrankten Patienten (27). Benzodiazepine gehören durch ihr breites Spektrum zu der am häufigsten verordneten Arzneimittelgruppe. Das Einsatzgebiet dieser Medikamentengruppe lässt sich beruhend auf ihrer anxiolytischen, antikonvulsiven, zentral muskelrelaxierenden, sedativ-hypnotischen und amnestischen Wirkung, herleiten. Die Benzodiazepine interagieren mit verschiedenen, spezifischen Rezeptoren. Hier zu erwähnen sind zentrale sowie peripher zu lokalisierende Benzodiazepinrezetporen, welche sowohl in der Ligandenaffinität als auch in der Gewebeverteilung und der intrazellulären Lokalisation variieren. Die zentralen Rezeptoren sind auf das Zentrale Nervensystem beschränkt und die peripheren befinden sich ubiquitär an den Mitochondrienmembranen (2). Durch Bindung an den zentralen Benzodiazepinrezetporen wird die Affinität der Gamma-Aminobuttersäure-(GABA A )-Rezeptoren für GABA verstärkt und damit deren hemmende Wirkung. GABA bindet an postsynaptischen GABA-Rezeptoren und öffnet so die pentameren Chlorid-Kanäle. Die Liganden modulieren den Effekt des Neurotransmitters GABA auf den Chloridinonenfluss durch den GABA- Rezeptor-Ionenkanal. Über eine verlängerte Öffnung des Chlorid-Kanals wird damit die Wirkung des dämpfenden Transmitters GABA verstärkt. GABA senkt also die neuronale Erregbarkeit, dämpft Erregungs- und Angstzustände und triggert die Muskelrelaxation. An den Benzodiazepinrezeptor können Agonisten (Benzodiazepine), kompetitive Antagonisten (Flumazenil) und inverse Agonisten (so genannte Panikmacher) binden. So ist der Rezeptor durch seinen Liganden in der Wirkung modellierbar. Der zweite ubiquitär vorkommende so genannte periphere Benzodiazepin Rezeptor (pbr) ist wie o. g. in der mitochondrialen Membran (2) des gesamten Körpers lokalisiert und befindet sich in peripheren Geweben und Zellen. Er nimmt aktiv an der mitochondrialen Physiologie teil, beispielsweise an der Regulation der Steroidbiosynthese oder Zellproliferation (2), (39), (55). 6

Der pbr ist durch seine Affinität zum Benzodiazepinliganden Ro5-4864 sowie zu dem Isoquinolinderivat PK 11195 charakterisiert. In den Mitochondrien ist der pbr mit Porin, einem spannungsabhängigen Anionenkanal, assoziiert und hierüber an dem so genannten permeability transition (PT)-Kanal-Komplex beteiligt (5), (42). Der PT-Kanal ist ein Multiproteinkomplex, welcher an der Kontaktstelle zwischen der äußeren und inneren Mitochondrienmembran sitzt. Der PT-Kanal ist mit dem Onkogen Bcl-2 vergesellschaftet (14) und scheint als Komplex eine zentrale Rolle in der Apoptoseregulation innezuhaben. Es bestehen Hinweise, dass das Öffnen der PT-Poren über Proteine gesteuert wird. Diese Proteine Bcl-2, Bcl-x, Bak und Bax kontrollieren die Apoptose (30), (40), (49). Durch die Öffnung der PT-Poren kann das Transmembranpotetnial der inneren Mitochondrienmembran aufgehoben werden, was zur Freisetzung von Intermembranproteinen wie z. B. Cytochorm C führen kann (59). Sowohl die Aufhebung des mitochondrialen Membranpotentials als auch die Freisetzung von Cytochrom C sind frühe Zeichen für den Vorgang des programmierten Zelltodes. Es ist vorstellbar, dass verschiedene Komponenten dieses Multiproteinkomplexes Ziele für die Apoptosemodulation darstellen. Neben der DNA-Reparatur stellt die Apoptose eine Möglichkeit der Schadensminimierung im Organ oder im Organismus dar (12). Durch den Nachweis von Apoptose wird also die spezifische Wirkung der Medikamente, bei der Tumorbekämpfung bewiesen. Idealerweise wird das Restorgan durch spezifischen Tumorzelltod geschützt. Zellen können durch Nekrose oder Apoptose sterben. Bei der Nekrose gehen Zellen durch äußere Einflüsse zugrunde. In größeren Gewebebereichen führt dies zur Kondensation der Kernsubstanz und Schwellung der Organellen, der Zellen. Ein Schaden an der Plasmamembran führt zum Platzen der Zellen wodurch spezifische Stoffe aus dem Zytoplasma freigesetzt werden, die wiederum eine Entzündungsreaktion hervorrufen. Apoptose, entdeckt 1842 von Vogt, wird von einer Kaskade von Enzymen schrittweise initiiert. Die wichtigsten dieser Enzyme sind die Caspasen. Das sind Proteasen, die in ihrem aktiven Zentrum die Aminosäure Cystein enthalten und Proteine nach der Aminosäure Aspartat hydrolytisch spalten (Cysteinyl- Aspartasen). Aktivierte Caspasen triggern zur Apoptose führende Signalkaskaden. 7

Bei einem Weg der Apoptoseaktivierung werden Membranporen in der äußeren Mitochondrienmembran geöffnet. Cytochrom C gelangt ins Zytoplasma und bildet dort mit anderen Proteinen einen Komplex (Apoptosom), der zusammen mit ATP die Caspase-9 aktiviert und Apoptose auslöst. Es konnte gezeigt werden, dass der pbr-ligand PK 11195 in verschiedenen Zellsystemen die Induktion von Apoptose durch ein Aufheben der anitapoptotischen Funktion von bcl-2 erleichtert (24). In Thymozyten und in hämatologischen Zelllinien (CEM-C7; WEH 1231B) konnte gezeigt werden, dass PK 11195 bis zu einer Dosis von 50 bis 100 µmol keine toxischen Effekte bewirkt. Wurde PK 11195 jedoch zusammen mit zellpermeablem C8 Ceramid appliziert, welches seinerseits bei der entsprechenden Dosis ebenfalls keine Apoptose der Zellen induzierte, dann traten die Zellen in den Vorgang des programmierten Zelltodes ein (24). Andere Effekte von pbr-liganden beeinflussen z. B. die adrenerge Steroidgenese (44), (48) sowie das Wachstum und die Differenzierung von murinen als auch humanen Zelllinien (46), (55). Der genaue Mechanismus welcher diese Effekte meditiert, ist jedoch noch nicht bekannt. Die am besten untersuchten pbr-liganden sind das Isoquinolinderivat PK 11195 und das Benzodiazepinderivat 4 -Chlorodiazepam (Ro5-4864), wobei PK 11195 eine höhere Affinität zu dem pbr aufweist als RO 5-4864. Die Bindung von PK 11195 ist in vielen humanen Krankheiten hochreguliert und dies führte z.b. dazu, dass markiertes PK 11195 in der Positronen-Emmisions- Tomography Verwendung fand, um krankhafte Veränderungen im ZNS darzustellen (47). So konnten Läsionen bei der Multiplen Sklerose, in Gliomas, bei der Huntington s Disease als auch bei der Alzheimer Erkrankung aufgedeckt werden (15). Auch in verschiedenen Tiermodellen, wie z. B. der autoimmunen Enzephalitis (15) oder in der Ischämie (45), ist eine verstärkte PK 11195-Bindung nachweisbar. Auf Zellen des Immunsystems und zwar Peritonealmakrophagen und peripheren mononukleären Blutzellen, konnten ebenfalls pbr nachgewiesen werden. Durch die Inkubation von humanen THP-1 Zellen und Rattenperitonealmakrophagen mit PK 11195 konnten folgende inhibitorische Effekte dieses Liganden demonstriert 8

werden: Hemmung des respiratorischen Burst von Makrophagen, Verminderung der Glutamatsekretion und Inhibition der Il-1β-Sezernierung (26). Neben diesem abschwächenden Einfluss von pbr-liganden auf inflammatorische Zustände wurde in den letzten Jahren auch gehäuft die verstärkte Expression von pbr in Malignomen beschrieben(4), (43). In Astrozyten hemmen die pbr-liganden die bfgf-induzierte DNA-Synthese (46), wohingegen in V79-Zellen (Lungenzellen des chinesischen Hamsters) der antiproliferative Effekt der pbr-liganden über einen Mitosearrest in der G2/M- Phase mediiert wird (7), ohne dass ein zytotoxischer Effekt auf diese Zelle zu sehen ist. In B16 Melanomzellen konnten ebenfalls proliferationsinhibitorische Wirkungen von pbr-liganden gezeigt werden, da nach Inkubation weniger Zellen in der Synthesephase nachzuweisen waren, wohingegen sich mehr in der in der G2/M- Phase befanden(32). Kürzlich wurden die antitumoralen Einflüsse des Benzodiazepins BBL22 veröffentlicht (55). Auch dieser Ligand übt seine antitumorale Aktivität über einen induzierten Arrest in der G2/M-Phase des Zellzyklus aus, was in humanen epithelialen Zellen hämatopoetischen Ursprungs gezeigt werden konnte. Aufgrund der schlechten Prognose des duktalen Pankreaskarzinoms mit einer 5 Jahres Überlebensrate von unter 5% ist eine Verbesserung der bisherigen Therapiemöglichkeiten dringend erforderlich. Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung ist bei über zwei Dritteln der Patienten der Tumor nicht mehr resektabel (27), (55), so dass bei der überwiegenden Anzahl der Patienten mit Pankreaskarzinomen lediglich palliative Chemo- bzw. Radiochemotherapie möglich sind. Da die Prognose des Pankreaskarzinoms trotz multimodaler Therapiestrategien dürftig bleibt, sind neue therapeutische Methoden notwendig (20), (21), (35). Die Modulation des programmierten Zelltodes in Krebs Zellen über den pbr könnte ein viel versprechendes Werkzeug in der Therapie von Malignomen bedeuten. Wegen einer verstärkten Expression des pbr in humanen Tumoren und der Verfügbarkeit von Liganden, die einen offensichtlichen inhibitorischen Einfluss auf zumindest einige Tumorzelllinien zeigen, könnte der pbr ein gutes Target für eine Tumortherapie darstellen. 9

In Astrozytomas und Gliomas konnte z. B. ein pbr-aufkommen demonstriert werden, welches mehr als das 12-fache der Expression in gesundem Gehirngewebe überschritt (10). Betrachtet man dieses gehäufte Auftreten von pbr in Tumoren und die in der Literatur beschriebene Korrelation der pbr- Expression mit der Aggressivität von Gehirn- als auch von Brusttumoren (10), (23), (43), so legt dies eine Rolle der pbr in der Tumorgenese nahe und macht sie zu einem möglichen Angriffspunkt in der Tumortherapie (55). Im Bezug auf das Pankreaskarzinom existieren bisher keine Daten über den Einfluss der spezifischen Liganden auf die Zellproliferation und das Expressions- Muster des pbr im Pankreas Krebs Gewebe. Um den möglichen Einsatz von Liganden des pbr in der Therapie des Pankreaskarzinoms zu evaluieren, wurde in-vitro die Wirkung der Liganden PK11195 und Ro5-4864 auf die Pankreaszelllinien AsPC-1, BxPC3, Capan-1, Mia-PaCa-2 und Panc1 untersucht. Des Weiteren sollten die immunhistochemischen Untersuchungen von humanem Pankreaskarzinomgewebe Aufschluss darüber erbringen, ob der pbr in Tumorzellen im Vergleich zu gesundem Gewebe überexprimiert ist. Auch sollte untersucht werden, ob spezifische Expressionmusters des pbr im humanen Pankreas Karzinomgewebe zu erkennen sind und ob es eine Korrelation der Befunde zwischen den klinischen Parametern und der Überlebensrate der Patienten gibt. Der Einsatz von pbr Liganden könnte eine Ergänzung bzw. einen neuen Ansatzpunkt in der therapeutischen Anwendungen im Kampf gegen das Pankreaskarzinom erbringen, bei dem die Überlebenschancen der Patienten durch operative und chemotherapeutische Ansatzpunkte bisher zu keinem befriedigendem Ergebnis geführt haben. 10

2. Material & Methoden 2.1 Materialien: Blotting-System (Phase, Lübeck,) Cell Quest Computer Software (Beckton Dickinson, Dickinson GmbH / Heidelberg) Cytochrom C Kit BMS263 ELISA (Bender Med Systemes, Austria) ECL-Kit (ECL Western blotting analysis system, Amersham Freiburg) Elektrophoresekammer (Biochrom Heidelberg) FACScan Flow Cytometer (Beckton Dickinson, Dickinson GmbH / Heidelberg) Falcon Zellkulturflasche, 275ml (Becton Dickinson, Meylan Cedex, Frankreich) Filterpapier (Schleicher und Schüll, Dassel) IR Autoflow CO 2 Water-Jacketed Incubator (Nu Aire, USA) Röntgenfilm Film: Kodak X-OMAT XAR-5-Film (Kodak, Rochester, NY, USA) Lichtmikroskop (Zeiss, Jena) Microtom: Schneidegerät für Paraffinschnitte (Leica / Leica, Bensheim) Neubauer Zählkammer mit 0,1 µl Kammer Neubauer improved, hell-linig (Marienfeld GmbH,Deutschland) Nitrocellulosefolie, Hybond ECL, (Amersham Freiburg) Nucleon Zell- und Gewebekulturschale (Nalge Nunc international, Roskilde, Dänemark) Objektträger & Deckgläser (Menzel, Braunschweig) Pasteurpipetten (Brand, Ludwigshafen) Zentrifuge (Eppendorf centrifuge / Eppendorf, Köln) 11

2.2 Reagenzien: AB- Komplex (Dako, Hamburg) Acrylamid (Roth, Karlsruhe) Anti PBR Antikörper (Trevigen, Gaithersburg, MD USA) Anti Rabbit Antikörper, Schwein anti Kaninchen, biotinkonjugiert (Dako, Hamburg) Anti PBR monoklonal Antikörper 8D7 (Sanofi, Frankreich) Anti-mouse, biotinkonjugierter Rabbit Antiköper( F(ab)2 (Beckmann Coulter Krefeld, Germany) APS (Sigma, Steinheim) Aprotinin (Sigma, Steinheim) Bisbenzimid (Sigma, Steinheim) BSA Albumin bovine Fraction V, ph 7,0 (Serva, Heidelberg) Ciprobay (Bayer, Leverkusen) Cycle Test PLUS Protokoll (161100) (Becton Dickinson GmbH / Heidelberg) Cytochrom C Elisa Kit BMS263 (Bender MedSystems, Wien, Österreich) DAB - Stammlösung3,3 -Diaminobenzidin-tetrahydrocholid(DAB) (Sigma, Deisenhofen) DEMEM: Dulbecco s modified Eagle Medium mit 4,5g/l Glucose; ohne L- Glutamin (Bio Whittaker, Verviers, Belgien) DPBS: Dulbecco s Phosphate Buffered Saline Medium ohne Calcium und Magnesium (Bio Whittaker, Verviers, Belgien) ECL-Kit (ECL Western blotting analysis system, Code-Nummer: RPN2108, Hersteller Amersham pharmacia biotech, Buckinghamshire, England) EDTA (Merck, Darmstadt) Entellan : Polymer-Lösung in Xylol (Merck, Darmstadt) FCS: Fetal Calf Serum (Biochrom, Berlin) Formalin 3,7 %-ig Glycerol/PBS (Merck, Darmstadt) Glycin (Roth, Karlsruhe) 12

Hämalaun-Lösung (Merck, Darmstadt) Laemmlipuffer (Sigma, Steinheim) Leupeptin (Sigma, Steinheim L-Glutamin (Biochrom, Berlin) Lysispuffer (Sigma, Steinheim) Methanol (Hersteller J.T. Baker, Deventer, Holland) N-ethylmaleimid (Sigma, Steinheim) Penicillin / Streptomycin (Biochrom, Berlin) Pepstatin (Sigma, Steinheim) Peroxidase labelled Anti-mouse antibody (Amersham, Freiburg) Rainbowmarker (Amersham, Freiburg) Serum: Schwein (Dako, Hamburg) Serum: Rabbit mab Mouse (Dako, Hamburg) SDS- Sodium Dodecylsulfat (AppliChem, Darmstadt) Temed (Sigma, Steinheim) Tris (Sigma, Steinheim) Triton X-100 (AppliChem, Darmstadt) Trypsin-EDTA (Life Technologies, Paisley, Schottland) Trypsininhibitor (Sigma, Steinheim) Tween (AppliChem, Darmstadt) Wasserstoffperoxid (Merck, Darmstadt) 2.3 Zelllinien Zelllinien sind eukaryotische, adhärent wachsende Zellen, die einem Organismus entnommen und modifiziert wurden und so nahezu unbegrenzt in der Kultur wachsen können. Folgende Pankreas Karzinom Zelllinien wurden bei unseren In-vitro-Zellversuchen verwendet: AsPC-1 BxPC-3 Capan-1 Mia-PaCa-2 Panc-1 13

2.3.1 AsPC-1 Die permanent adhärente, epithelial wachsende Zelllinie AsPC-1 wurde 1981 aus dem Aszites einer 62 jährigen kaukasischen Frau gewonnen, die an einem Adenokarzinom des Pankreas erkrankt war. Die Zellen produzieren CEA (Carcino Embryonic Antigen- humanes Pankreas assoziiertes Antigen) sowie spezifisches humanes Pankreas Antigen und Muzin (9), (51). 2.3.2 BxPC-3 Diese permanent adhärente, epithelial wachsende Zelllinie wurden 1982, einer 61 jährigen kaukasischen Frau, die an einem Adenokarzinom des Pankreas erkrankt war, entnommen (31), (37). 2.3.3 Capan-1 Aus den Lebermetastasen eines 40 jährigen kaukasischen Mannes, der an einem Adenokarzinom des Pankreas erkrankt war, wurde 1974 die permanent, adhärente und epithelial und semi-konfluent, wachsende Zelllinie extrahiert (17), (18). 2.3.4 Mia-PaCa-2 Die permanent adhärente, epithelial wachsende Zelllinie stammt einem 65 jährigem kaukasischen Mann, der 1975 an einem Adenokarzinom des Pankreas erkrankt war (19), (56). 2.3.5 Panc-1 Die permanent adhärente, epithelial wachsende Zelllinie wurde einem 56 jährigem kaukasischen Mann, der an einem Adenokarzinom des duktalen Pankreas erkrankt war, entnommen (34), (56). 14

2.4 Gewebeproben Die Gewebeproben entstammen von 28 Patienten, die an einem Pankreas-Kopf- Karzinom erkrankten und die eine Pylorus-erhaltende-Whipple-Operation, erhielten. Die Proben wurden in der chirurgischen Abteilung I der Universität Ulm im Zeitraum zwischen Januar 2000 und September 2001 entnommen. Ein Teil des Gewebes wurde sofort nach der chirurgischen Entnahme in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 C aufbewahrt. Das restliche Gewebe wurde einen Tag in 4% Formalin fixiert und nach dem Auswaschen des Formalins in Parafin eingebettet. Die Patienten stimmten einer Entnahme der Gewebeproben preoperativ zu. Alle Untersuchungen an humanem Material wurden entsprechend den Richtlinien der Ethikkommission der Universität durchgeführt. 2.5 Zellkultur 2.5.1 Prinzip Die Zellen wurden in Dulbecco s modified Eagle Medium (DMEM) kultiviert, welches mit 10% fötalem, bei 56 C hitzeaktivierten Kälberserum (FCS) und 2 ml L- Glutamin supplementiert war. Zusätzlich wurde das Medium mit 5ml Penicillin/Streptomycin und 2 ml Ciprobay versetzt. Die Inkubation erfolgte bei 37 C und 100% Luftfeuchtigkeit in 5%-iger CO 2 -Atmosphäre. Unter diesen Bedingungen waren die Zellen zu einem Monolayer gewachsen. Um Interaktionen zwischen Serumkomponenten und den benutzten Agentien zu vermeiden und zur Gleichschaltung der Zellen in ihrem Zellzyklus wurden diese 24 Stunden vor Stimulation in serum-freiem Medium kultiviert. Die Zellen wurden aus den Kulturflaschen mittels Trypsin-EDTA gelöst und durch Zählen in einer Neubauer- Zählkammer quantifiziert. 2.5.2 Zellinkubation 15

Die gestarvten Zellen wurden in zwei Gruppen aufgeteilt und einmal mit Ro 5-4864 in unterschiedlichen Konzentrationen mit 30 µmol, 50 µmol oder 75 µmol inkubiert. Mit PK 11195 wurde die andere Hälfte der Zellen, ebenso mit unterschiedlichen Konzentrationen, 50 µmol, 75 µmol, 100 µmol inkubiert. Als Kontrollgruppen für jede Zelllinie dienten Zellen die nicht mit Ro5-4864 bzw. PK 11195 versetzt wurden. Diese so genannten Negativ Kontrollen wurden weder mit PK 11195 noch Ro5-4864 versetzt. 2.6 Zellzyklusanalyse 2.6.1 Arbeitslösungen Cell Cycle Kit (Boehringer) Solution A, Trypsin in Spermintetrahydrochlorid Waschpuffer Solution B, Trypsininhibitor und Ribonuklease A in citratsatbilisierendem Puffer mit Spermintetrahydrochlorid Solution C, Propidiumjodid in Spermintetrahydrochlorid in citratstabilisierenden Puffer Buffer Solution, DMSO in Sacharose-Citrat-Puffer 2.6.2 Methoden Durch die Größe der Zellkerne bzw. der Menge an DNA lassen sich in der durchflußzytometrischen Zellzyklusanalyse die Zellen einer bestimmten Population in die entsprechenden Zellzyklusphasen aufteilen. So ist es möglich, prozentuale Angaben bezüglich des Anteils der Zellen pro Zyklusphase zu machen und ebenso den Anteil apoptotischer Zellen zu ermitteln (54). Vor der Analyse werden die Zellen mit Waschpulver behandelt, dadurch werden membrangebundene Lipide gelöst und die Zellmembran aufgespalten. Durch die Zugabe von Trypsin wird das Zytoskelett eliminiert und miterfasste zelluläre RNA wird durch RNAsen beseitigt. 16

Das nukleäre Chromatin wird während der ganzen Prozedur mittels Spermin stabilisiert. Die zurückbleibende Zellkernsuspension wird mit nukleinsäurebindendem Propidium Iodid angefärbt und im FACS-Gerät auf die Menge an DNA untersucht (Protokoll 161100 des CELL Cycle Test Plus - Becton Dickinson GmbH) (54). An Hand der Nukleusgröße, die mittels des Cell Quest Programms (Beckton and Dickinson) bestimmt wird, können Aussagen zur Zellzyklusphase bzw. Apoptose gemacht werden. Mit einem monochromatischen Argonlaser können die isolierten Zellkerne beim Transportieren mittels Spülflüssigkeit durch das FACS Gerät Durchflußzytometer, erkannt werden. Die erfassten Zellkerne emittiern den Lichtstrom in einer für die Größe spezifischen Wellenlänge, die durch Detektoren gemessen wird. In einem Histogramm werden die Zellzyklusphasen dargestellt, welche durch Summation der Ereignisse pro Wellenlänge, der untersuchten Zellpopulation ermittelt werden. Die Zellzyklusanalysen wurden in drei voneinander unabhängigen Experimenten durchgeführt. 2.7 Bisbenzimid Färbung 2.7.1 Prinzip Bei der Bisbenzimid Färbung wird zur Charakterisierung des Zelltodes eine Färbung der Zellkulturen durchgeführt und die gefärbten Schnitte im Lichtmikroskop begutachtet. Zuerst werden, wie oben beschrieben, die Zellkulturen ausgesät, gestarvt und stimuliert und anschließen gefärbt. Je Ziellinie wurden 1,2 x 10 6 Zellen verwendet. 2.7.2 Praktische Durchführung Die Zellen wurden aus den Kulturschalen geschabt und jeder Ansatz in jeweils ein Probenröhrchen gefüllt. Die Aliquots wurden bei 1200 U/min in der Zentrifuge, 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das verbleibende Pellet mit 5ml PBS gespült. Nach der Spülung wurde, bei 1200 U/min, 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde abermals verworfen. 17

Es wurde 1 ml 3,7%-iges Formalin (37% Formalin 1:10 mit PBS verdünnt) hergestellt, auf die Zellen gegeben und für 15-20 Minuten inkubiert. Um die Zellen dann vom Formalin zu trennen, wurden diese erneut zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, die Zellen mit PBS gespült, erneut zentrifugiert und wiederum wurde der Überstand verworfen. Für die Färbung wurde 1 Körnchen Bisbenzimid 15 µg/ml in 25 ml PBS gelöst, was etwa 15 µg/ml entspricht. Von dieser Bisbenzimidlösung wurden dann etwa 200 µl auf die Pellets getropft. Durch Resuspendieren mit der Pipette wurde das Zellmaterial mit dem Farbstoff durchsetzt. Die Inkubation erfolgte für 15 Minuten bei absoluter Dunkelheit. Anschließend wurden die Zellen zweimal zentrifugiert und mit PBS gewaschen. Auf vorbereitete Objektträger wurden dann die behandelten Zellen aufgetropft und nachdem sie angetrocknet waren mit Deckgläsern bedeckt. Das Eindeckeln erfolgte mit Glycerol/PBS im Verhältnis 1:1. 2.8 Durchflußzytometrie zum Nachweis des pbr AsPC-1- und BxPC-3 Zellen wurden mit einem Antikörper gegen den pbr (Trevigen) 15 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Ein FITC gekoppelter anti- Mausantikörper (Dako) wurde nach dem Waschen mit PBS zugegeben und unter Lichtausschluss wiederum 15 min. inkubiert. Nach einem erneuten Waschschritt mit PBS wurden die Zellen im Facscan analysiert. 2.9 Cytochorm C Messung 2.9.1 Prinzip Die Apoptose ist ein aktiver, gerichteter und ernergieverbrauchender Vorgang der Zelle, der im kontrollierten Absterben der Zelle resultiert. Cytochrom C wurde bei diesem Prozess als eine Komponente identifiziert, die für die Caspase-3- Aktivierung und die DNS Fragmentation gebraucht wird. (36) Während des Vorgangs der Apoptose verteilt sich Cytochrom C aus den Mitochondrien ins Zytosol (28), (29). Diesen Cytochromverlust aus den Mitochondrien kann man 18

mittels einer selektiven Lyse der Zellmembran messen und hiermit einen der Initialschnitte der Apoptose in den Zellen bestimmen. Zur Charakterisierung des vorliegenden Zelltodes mittels Cytochrom C-Bestimmung verwendeten wir das Elisa-System Cytochrom C BMS 263 von Bender Med Systems. 2.9.2 Durchführung Zur Zelllyse wurden die Zellen für 15 Min. bei 400g zentrifugiert und das Zellpellet anschließend in kaltem PBS gewaschen. Danach wurden Zellen bei einer Konzentration von 1,5 x 10 6 Zellen /ml in dem Lysispuffer aus dem Kit resuspendiert und unter leichtem Schütteln für 1h bei Raumtemperatur inkubiert. Der verbleibende Zelldetritus wurde dann 15 min. bei 1000g abzentrifugiert und der Überstand mit Assay-Puffer 50-fach verdünnt. Diese Proben wurden dann in vorgebereiteten Wells einer Mikrotiterplatte gegeben, die mit einem murinem Antikörper gegen humanes Cytochrom C beschichtet war. Das in der Probe vorhandene Cytochrom C wurde durch die, an der Platte haftenden Antikörper gebunden und mit einem biotingebundenen Zweitantikörper, nach Anweisung des Kit-Protokolls mittels Streptavidin-Meerretichperoxidasperoxidase detektiert. Nach Inkubation des Substrates für 15 min bei Raumtemperatur wurde die Reaktion durch Zuführen von Säure terminiert. Es bildet sich ein farbliches Produkt was der Menge des vorhandenen Cytochrom C entspricht. Der Nachweis erfolgte durch die Absorption des Lichtes im Spektralphotometer, welche bei einer Wellenlänge von 450 nm Wellenlänge gemessen werden kann. 2.10 Immunhistochemische Färbung 2.10.1 Arbeitslösungen 3% H 2 O 2 /Methanol: 3ml 30%-ige Wasserstoffperoxid Lösung in 250 ml Aqua dest. ABComplex: 5 ml PBS + ein Tropfen Lösung A + ein Tropfen Lösung B DAB - Stammlösung: 250 mg 3,3 -Diaminobenzidin-tetrahydrocholid(DAB) ad. 40ml PBS (In Einzelportionen zu 2ml bei -20 C eingefroren). 19

DAB - Gebrauchslösung: 2ml der DAB- Stammlösung ad. 1000ml PBS + 14 µl 30% H 2 O 2 2.10.2 Prinzip Bei dem Prinzip der verwendeten Färbemethode handelt es sich um eine Doppelmarkierung. Der gegen das Antigen (hier: pbr) gerichtete Antikörper stammt vom Kaninchen. Der Sekundärantikörper (Anti-Rabbit-Antikörper vom Schwein) ist mit Biotin konjugiert und markiert den Primärantikörper. Das Protein Avidin besitzt zu Biotin eine sehr hohe Affinitätskonstante. Aus diesem Grund wird Avidin als Bindungsmolekül zwischen dem Biotin konjugierten Sekundärantikörper und der Avidin konjugierten Peroxidase eingesetzt. Durch Übertragung von Wasserstoffionen aus dem Substrat 3-3 -Diaminobenzidin (DAB) auf Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ) entsteht ein unlösliches farbiges Produkt unter Bildung von Wasser. 2.10.2.1 Immunhistochemische Färbung mit dem polyklonalen anti-pbr Antikörper ( Trevigen) Nachdem das Pankreaskarzinomgewebe entnommen war, erfolgte die Einbettung in Paraffin. Mit einem Mikrotom fertigte man 5 µm starke Schnitte des Gewebes an und brachte zwei der Schnitte anschließend auf silanisierten Objektträgern auf. Zur Deparaffinierung der Schnitte erfolgte ein dreimaliges Waschen in reinstem Xylol, zu je 5 Minuten. Anschließend reinigte man das Gewebe durch Waschen in100%-igem Isopropanol für 5 min. Zur Blockierung der endogenen Peroxidaseaktivität der Gewebeschnitte erfolgte ein dreißigminütiges Waschen in 3%-iger Wasserstoffperoxid-Methanol-Lösung. Ein weiteres Waschen von jeweils fünf Minuten, in 80%-igem und anschließend in 70%-igem und schließlich 50%-igem Isopropanol ging einem zehnminütigem Waschen in destilliertem Wasser voraus. Die Schnitte wurden dann dreimal in PBS Puffer mit einem ph von 7,45 für 10 Minuten gewaschen. Mit einem Fettstift wurden die Proben umgrenzt. Auf die Gewebeschnitte wurden 200 µl BSA1%-ig aufpipettiert und für 30 Minuten in eine feuchte Kammer gegeben und dann mit PBS für 10 Minuten gespült. Schließlich erfolgte auf dem linken der beiden 20

Gewebeschnitte die Inkubation für 20 Minuten, mit dem Normalserum (Dako Swine). Mit PBS wurde dann erneut für 10 Minuten gespült und schließlich, zur Detektion der pbr mit monoklonalem Primärantikörper Anti-pBR(1:250; 4 µl in 1000 µl) bei 4 C für eine Nacht in eine feuchte Kammer gestellt. Am nächsten Tag wurden die Schnitte drei Mal jeweils10 Minuten mit PBS gewaschen. Der Sekundärantikörper Anti-rabbit Biotin konjugiert (1:200 Dako Swine anti Rabbit Biotin) wurde für 40 Minuten auf die linke der beiden Proben aufgetragen. Ein dreimaliges Waschen für je 10 Minuten folgte anschließend und danach wurde mit dem ABC-Komplex (Streptavidin biotinkonjugierte Meerettichperoxidase Komplex) für 40 min (5ml PBS + 1 Tropfen Lösung A + 1 Tropfen Lösung B Dako) inkubiert. Vor der Visualisation durch DAB erfolgte erneut ein dreimaliges Waschen zu 10 Minuten mit PBS. Für die Färbung mit 3,3 - Diaminobenzidin (DAB) benötigte man 15 Minuten. Nach zehnminütigem Waschen mit destilliertem Wasser wurden die Schnitte mit einer 30%-igen Hämalaun-Lösung (10 Sekunden) gegengefärbt und gebläut. Nach jeweils fünfminütigem Waschen in 50%-igem, 80%-igem, zweimal in 100%-igem Isopropanol und nach dreimaligem Waschen in reinstem Xylol erfolgte das Eindecken der Objektträger mit Entellan (E. Merck, Darmstadt, Deutschland). Die gefärbten Schnitte wurden im Lichtmikroskop beurteilt und in Kategorien eingeteilt. 2.10.2.2 Immunhistochemische Färbung mit dem monoklonalen Antikörper 8D7 (Sanofi) Das Prinzip der Färbung mit monoklonalen Antikörpern unterscheidet sich von polyklonalen Antikörpern lediglich durch unterschiedliche Seren bzw. Antikörper. Alle anderen Schritte sind identisch. Als Normalserum wurde ein Rabbit Anti-Mouse Serum (Dako) verwendet. Zur Detektion des pbr benutzten wir den monoklonalen Antikörper 8D7 der Firma Sanofi (Paris, Frankreich), der 1:250 verdünnt wurde. Dieser Antikörper wurde mit einem sekundären Antikörper (Swine Anti Rabbit Biotin; Dako), an den Biotin konjugiert war, mittels Meerrettichperoxidase als Enzym und DAB als Substrat, nachgewiesen. 21

2.11 Quantifikation der Immunhistochemischen Färbung Zur Bewertung aller gefärbten Gewebeschnitte wurde ein Bewertungsbogen erstellt und die Schnitte unter dem Lichtmikroskop ausgewertet. Die Schnitte wurden nach Intensität und Ausmaß der Färbung bewertet. Für die Intensität wurden zwischen 0 und 3 Punkte vergeben: 0 Punkte für keine Färbung 1 Punkt für schwache Färbung 2 Punkte für moderate Färbung 3 Punkte für intensive Färbung Für das Ausmaß der Färbung wurden nur die Tumorverbände gezählt und ebenfalls zwischen 0 und 3 Punkte vergeben. Punkte wenn 0% der malignen Zellen gefärbt waren. 1 Punkt wenn bis zu 20% der malignen Zellen, gefärbt waren. 2 Punkte wenn zwischen 20% und 50% der malignen Zellen gefärbt waren. 3 Punkte wenn mehr als 50% der malignen Zellen gefärbt waren. Des Weiteren wurde beurteilt, wie sich das umgebende Pankreatitisgewebe, anfärben ließ. Beurteilt wurden das degenerative Pankreatitisgewebe und die eventuell vorhandenen hyperplastischen Dukten. 0 Punkte: nicht angefärbt 1 Punkt: schwach gefärbt 2 Punkte: moderat gefärbt 3 Punkte: stark gefärbt. Die gleiche Beurteilung erfolgte für Insel- und Bindegewebe sowie für die Lymphozyten und Monozyten. Alle Schnitte wurden von 3 unabhängigen Personen mikroskopisch unter oben genannten Kriterien begutachtet und ausgewertet. 22

2.12 Western Blot Analyse 2.12.1 Arbeitslösungen APS (10%-ig): 1g APS ad 10 ml Aqua dest.( Jedes Mal frisch ansetzen) Elektrophoresepuffer: Glycin 14,42 g; SDS 1,00 g; Tris 3,00 g; ph 8,3 auf einen Liter auffüllen Lysispuffer: 0,242 g Tris; 1 ml Triton X-100; 0,0372 g EDTA ad 100 ml Aqua dest. Inhibitoren: 1 µl Trypsininhibitor/ml; 2 µl Aprotinin/ml; 2 µl Leupeptin/ml; 2 µl Pepstatin/ml; 1,25 µl N-ethylmaleimid/ml Sammelgelpuffer (4fach): 6 g Tris ad 100 ml Aqua dest. - ph 6,8 Sammelgel 3%-ig: Sammelgelpuffer 1,25 ml; SDS (10%ig) 0,05 ml Acrylamid(30%); 0,5 ml; Aqua dest. 3,200 ml; Temed 0,01 ml; APS 0,1 ml Skinmilk 5%-ig: 5 g auf 100ml PBS plus 0,4 ml Tween 20 Trenngelpuffer (4fach): 18g Tris ad 100 ml Aqua dest.-ph 8,8 Trenngel 15%-ig: Trenngelpuffer 2,5 ml; SDS 0,1 ml; Acrylamid 5,0 ml; Aqua dest. 2,4 ml; Temed 0,005 ml ; APS 0,05 ml auf ph 8.3 Acrylamid Stocklösung: 30% Acrylamid; 30% Bisacrylamid SDS: 10 g SDS in 100 ml Aqua dest. Laemmli Probenpuffer (Sigma München) 2.12.2 Testprinzip Der Western-Blot beschreibt den Transfer von Proteinen aus einem Gel auf eine Membran (feste Phase) und besteht aus drei Schritten. Zuerst werden Proteingemische mittels eines Gels mit bestimmter Porengröße durch Anlegung einer Spannung aufgetrennt. Die Proteine werden vor dem Auftragen durch SDS (Sodium Dodecyl Sulfat) linearisiert. Je kleiner das Protein, desto schneller wandert es durch das Gel. Ist die, mit einem Farbstoff markierte Front des Proteingemisches durch das Gel gewandert, wird diese in einem zweiten Schritt wiederum mittels Anlegen einer elektrischen Spannung auf eine Nitrocellulosefolie geblottet. Dies wird oft im Semi-dry-Verfahren durchgeführt. Hierbei wandern die, mittels Sodium-Dodecyl-Sulfat negativ geladenen Proteine in Richtung Kathode 23

und befinden sich zu einem bestimmten Zeitpunkt auf der Nitrozellulosemembran. Die auf der Folie fixierten Proteine werden anschließend in einem dritten Schritt mit den Antikörpern der Wahl detektiert und direkt oder indirekt mittels Peroxidase und einem Substrat gefärbt. Erfolgt die Immundetektion indirekt, so bindet (in einem ersten Inkubationsschritt) der für ein spezielles Protein spezifische Antikörper, welcher wiederum (in dem zweiten Inkubationsschritt) von einem Anti- Antikörper gegen die Subklasse des ersten Antikörpers nachgewiesen wird. An den Fc-Teil des Zweitantikörpers ist Peroxidase gekoppelt, welches in dem, von uns angewendeten System die Oxidation von Luminol katalysiert. Mittels der Oxidation wird Luminol in einen energiereichen Zustand versetzt. Durch die Emittierung von Licht strebt dieses Molekül wieder seinen stabileren Grundzustand an. Wird die Blotfolie anschließend auf einen Autoradiographiefilm aufgebracht, so kann anhand der Schwärzung die Lage der detektierten Proteine im Gel und somit ihr Molekulargewicht beurteilt werden. Der Westernblot ist also eine Methode zum quantitativen als auch zum qualitativen Nachweis von bestimmten Proteinen im Zellmaterial. 2.12.3 Durchführung Die Zellen wurden mittels des Lysispuffers lysiert und die Proteine wurden denaturiert. Nach einer kurzen Strecke im Sammelgel (3% Acrylamid) wurden die Proteine über ein Trenngel (15%), welches einen deutlich höheren Acrylamidgehalt besaß, aufgetrennt. 2.12.4 Zelllyse Die Zellen wurden im Lysispuffer 1h lysiert, bei 1300 G für 10 min zentrifugiert und der Überstand gewonnen. Der Proteingehalt wurde gemessen und die Konzentrationen eingestellt, so dass sich in jeder Probe der vergleichbare Proteingehalt befand. Nach Zugabe eines Volumenäquivalents Laemmlipuffers wurden die Proben für 3 min. bei 95 C gekocht und sofort auf Eis gestellt. Nun waren die Proben fertig zum Auftragen. 24

2.12.5 Elektrophorese und Westernblotting Die zur Auftrennung benötigten Gele wurden als Lösung in die beiden Kammern, des Elektrophoregerätes eingefüllt und polymerisiert. Zunächst wurde das Trenngel hergestellt. Das Molekulargewicht des pbr-proteines liegt zwischen 15-30 Kd. Für dieses Molekulargewicht verwendeten wir ein 15%-iges Gel. Nach Einfüllen des Trenngels wurde dieses mit Butanol überschichtet. Nach der Butanol Überschichtung polymerisierte das Gel etwa 30-40 min. Das 3%-ige Sammelgel wurde nach Abpipettieren des Butanols auf das Trenngel gegossen. Zur Herstellung der Taschen wurde je ein Kamm pro Kammer eingesetzt. Der Kamm wurde nach 30 min. Polymerisation entfernt und die Geltaschen mit Aqua dest. gespült. Die Kammern wurden in den Elektrophoreseapparat eingesetzt. 25 µl eines Zelllysates der unbehandelten Zelllinien (AsPC-1, BxPc-3, MiaPaCa-2, Panc-1) wurden jeweils in eine Tasche pipettiert. Pro Gel wurde jeweils eine Tasche mit einem Proteingemisch gefüllt, welches aus Proteinen bekannter Molekulargewichte bestand (Rainbowmarker, Amersham). Danach wurde das Elektrophoresegerät mit Elektrophoresepuffer aufgefüllt und das Elektrophorese- System geschlossen. Die Laufzeit betrug 2 h 40 min. bei 100 V. Nach der Proteintrennung wurde das Sammelgel vom Trenngel gelöst. Es wurde in je eine Schale Kathodenpuffer, Anodenpuffer 1 und 2 gefüllt. In diese wurden die Filterpapiere und die Nitrocellulosefolie (Hybond ECL, Hersteller: Amershampharmacia biotech, Buckinghamshire, England) eingelegt. Es wurden sechs Filterpapiere pro Pufferschale (für zwei Gele) eingelegt. In den Anodenpuffer 1 wurden zusätzlich die beiden Nitrocellulosefolien gegeben. Die Kammerglasplatten wurden dann entnommen und vorsichtig voneinander gelöst. Das Sammelgel wurde mit einem Skalpell entfernt. Nun wurde der eigentliche Blot zusammengesetzt. Dazu wurden zuerst je drei Filterpapiere aus der Kathodenpufferschale auf einen Stapel auf das Blotting-System (Hersteller: Phase, Lübeck, Deutschland) gelegt. Danach wurden die Gele, die vorsichtig vom Glas entfernt, der Nitoruzellulosefolie, drei Filterpapieren aus der Anodenpuffer-1- Schale und zum Schluss die Filterpapiere, die mit Anodenpuffer 2 getränkt waren. Dabei musste darauf geachtet werden, dass die einzelnen Schichten genau aufeinander passen und keine Blasen entstehen, denn sonst kommt es zu 25

Ausgleichströmchen und die Banden verlieren ihre Aussagekraft, da sie nicht mehr ihre ursprüngliche geometrische Anordnung haben. Dann wurde der Deckel aufgelegt und mit einer Spannung von 64 ma für 60 Minuten die Proteine aus dem Gel auf die Folie geblottet. Mit einer Schere wurde der Rainbowmarker abgeschnitten und unter selbstklebender Folie aufbewahrt. Der Rest der Folie wurde über Nacht bei 5%-iger Skin-mild aufbewahrt. Am nächsten Tag begann die Immundetektion mit der Inkubation des Primärantikörpers 8D7 (1:2500 mit 5%-iger Skin-mild verdünnt) für eine Stunde in einer flachen Schale. Alle Inkubations- und Waschschritte wurden auf einer Wippe durchgeführt. Danach folgten drei Waschgänge à 15 Minuten mit 10 ml 1%-igem Tween. Die darauf folgende Inkubation mit dem Sekundärantikörper (anti mouse) (1:10000 mit 5%-iger Skinmild verdünnt) erfolgt wieder über eine Stunde mit den sich anschließenden drei Waschgängen à 15 Minuten, allerdings diesmal mit 0,2%-igem Tween. Währendessen wurde die Filmkassette vorbereitet, d.h. eine Doppelfolie musste eingelegt und mit Tesafilm eingeklebt werden. Der nun benötigte ECL-Kit musste Raumtemperatur haben. Die Detektions-Reagenzien 1 und 2 wurden im Verhältnis 1:1 gemischt und 2ml pro Membran aufpipettiert, so dass die Membran genügend bedeckt war. Nach genau einer Minute wurden die überschüssigen Reagenzien abgegossen und die Folie blasenfrei in die Filmkassette eingelegt. In die Filmkassette wurde in der Dunkelkammer ein Kodak Röntgenfilm (Biomax ML, CAT: 8761520, Hersteller: Kodak, Rochester, NY, USA) eingelegt und die Kassette gut verschlossen. Die Belichtung erfolgte für eine Minute und dann wurde der Film entwickelt. 2.13 Statistische Analyse Die Datenanalyse wurde mit dem Softwareprodukt Microsoft Excel durchgeführt. Für die statistische Beurteilung wurden der Mittelwert, Median und Standardfehler berechnet. Für die Signifikanzanalyse unverbundener Stichproben wurde der t- Test nach Student (zweiseitig) verwendet. Das Signifikanzniveau wurde bei 5% (p< 0,05) angesetzt. 26

3.Ergebnisse 3.1.Zellzyklus Analyse Um die antiproliferativen Effekte des Ro5-4864 und PK 11195 in den Pankreaszelllinien AsPC-1, BxPC-3, Capan-1, MiaPaCa-2 und Panc-1 nachzuweisen, führten wir eine Zellzyklus Analyse mit den Zellen, die mit den jeweiligen Agentien inkubiert wurden, durch. Dabei hielten wir uns an das Protokoll des Cell Cycle Plus (Beckton and Dickinson). Die Reaktion der Zelllinien AsPC-1 und BxPC3 auf die Inkubation mit den pbr-ligand wurde in drei oder mehr verschiedenen Ansätzen untersucht, was eine statistische Auswertung erlaubte. Zur Überprüfung der allgemeinen Gültigkeit dieser Ergebnisse, führten wir die Inkubationsversuche auch an den Pankreaskarzinomzelllinien Capan-1, Mia- PaCa-2 und Panc-1 durch. Diese Versuche wurden nur einmal durchgeführt. Nach 48 h Inkubation von AsPC-1 Zellen mit Ro5-4864 bei einer Konzentration von 50 µmol, zeigten die Zellen einen signifikanten G1 Arrest im Vergleich zur Kontrolle (79.22% vs. 62.23%, p< 0.05). Bei höheren Konzentrationen (75 und 100 µmol) führte die Inkubation zu einer konstanten Zunahme der Zellen in der Sub G1 Phase. Bei einer Konzentration von 100 µmol wurden signifikant mehr Zellen in der Sub-G1-Phase gezählt, als dies bei nicht exponierten AsPC-1 Zellen der Fall war (39.21% vs. 4.19% (p<0.01)). Für die BxPC-3 Zelllinien zeigten sich vergleichbare Ergebnisse. Bei Inkubation mit 50 µmol Ro5-4864 resultierte nach 48h ein signifikanter G1 Arrest der Tumorzellen (84.54% vs. 62.9%, p<0.05). Die Zugabe von 100 µmol ergab einen signifikanten Anstieg der Zellen in der Sub-G1-Phase (85.24% vs. 4.07%; p<0.01) (Abbildung 1a und b). 27

AsPC1 + Ro5-4864 nach 48h Prozentanteil 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Control 50µMol 75µMol 100µMol Konzentrationen G2 S G1 subg1 Abbildung 1a: Zellzyklus Analyse von AsPC-1 Zellen nach Inkubation mit Ro5-4864 nach 48h. Im Vergleich zur Kontrolle wurden bei einer Konzentration von 50 µmol signifikant mehr Zellen in der G1-Phase gezählt (79.22% vs. 62.23% (*p<0.05)) als dies bei nicht exponierten AsPC-1 Zellen der Fall war. Bei einer Konzentration von 100 µmol wurden signifikant mehr Zellen in der Sub-G1-Phase gezählt, als dies bei nicht exponierten AsPC-1 Zellen der Fall war (39.21% vs. 4.19%, p<0.01). (39,21% vs. 4.19%,**p<0.01) 28

BxPC-3 + Ro5-4864 nach 48h Prozentanteil 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Control 50µMol 75µMol 100µMol Konzentrationen G2 S G1 subg1 Abbildung 1b: Zellzyklus Analyse von BxPC-3 Zellen nach Inkubation mit Ro5-4864 nach 48h. Im Vergleich zur Kontrolle wurden bei einer Konzentration von 50 µmol signifikant mehr Zellen in der G1-Phase gezählt (84.54% vs. 62.9%, p<0.05); In der höheren Konzentration von100 µmol zeigte sich eine signifikanter Anstieg der Zellen in der Sub-G1 Phase (85.24% vs. 4.07%, p<0.01) Die Inkubation von Pankreaskarzinomzellen mit dem spezifischen pbr-liganden PK 11195 resultierte ebenfalls in einem Arrest der Zellen in der G1-Phase des Zellzyklus sowie einem Anstieg des Anteils von Zellen in der Sub-G1-Phase. 48 h nach Zugabe von PK 11195 zu AsPC-1-Zellen, führten die Konzentrationen 75 und 100 µmol zu einem signifikanten G1 Arrest (85.65% und 84.19% vs. 61.88%, (p<0.05)); Die Konzentration von 200 µmol schädigte die Zellen derart stark, dass sich eine signifikante Erhöhung des Anteils der Zellen in der Sub-G1-Phase nachweisen ließ (37.35% vs. 3.78% p<0,01) (Abbildung 2a). 29

AsPC-1 + PK 11195 nach 48h Prozentanteil 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Control 50µMol 75µMol 100µMol 200µMol G2 S G1 sub G1 Konzentrationen Abbildung 2a: Zellzyklus Analyse von AsPC-1 Zellen nach Inkubation mit PK 11195 für 48h. Die Konzentrationen von 75 und 100 µmol führten zu einem signifikanten G1 Arrest (85.65% und 84.19 vs. 61.88%, *p<0.05); Bei 200 µmol zeigte sich ein signifikanter Anstieg der Zellen in der Sub G1 Phase 37.35% vs. 3.78% **p<0.01) Zellen der Pankreaskarzinomzelllinie BxPC3 reagierten vergleichbar. Bei Inkubation von 75 und100 µmol PK 11195 verharrten die Zellen nach 48 h in der G1 Phase (76.26% und 80.53% vs. 65.35%, p<0.05) und bei 200 µmol fanden sich signifikant mehr Zellen im Vergleich zur Kontrolle in der Sub-G1-Phase (68.77% vs. 5.51%, p<0.05) (siehe Abbildung 2b). 30

BxPC-3 + PK 11195 nach 48h Prozentanteile 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Control 50µMol 75µMol 100µMol 200µMol G2 S G1 sub G1 Konzentrationen Abbildung 2b: Zellzyklus Analyse von BxPC-3 Zellen nach Inkubation PK 11195 für 48h. Die Konzentrationen von 75 and 100 µmol führten zu einem signifikantem G1 Arrest (76.26% and 80.53 vs. 65.35% *p<0.05); Inkubation mit 200 µmol führten zu einem signifikanten Anstieg der Zellen in der sub G1 Phase 68.77% vs. 5.51% **p<0.01) Zellen der Zelllinien Capan-1 reagierten auf die Zugabe der Agenzien vergleichbar. Die Inkubation von 50 µmol Ro5-4864 führte nach 24h zu einem ausgeprägtem G1 Arrest im Vergleich zur Kontrolle (77,4% vs. 40,27%). Nur noch 7,58% der Zellen konnten bei dieser Konzentration in der Synthese Phase (S- Phase) nachgewiesen werden, wobei sich von den Kontrollzellen 29,3% in der DNA-Synthese-Phase befanden. Bei Zugabe von 100 µmol Ro5-486 war der G1-Arrest nicht mehr zu erkennen, da in dieser Konzentrationshöhe die Zellen zu stark geschädigt waren und ein großer Teil schon in der Sub-G1-Phase ist. Ob die Zellen aus dem G1-Arrest heraus in die Sub-G1-Phase gekommen, also in Apoptose gegangen sind, wird hierbei nicht gezeigt. Bei steigender Konzentration der Agenzien kann dann kein G1-Arrest mehr nachgewiesen werden, wohl aber ein großer Teil nichtvitaler Zellen (Abbildung 3a). Auch die Zelllinie MiaPaCa-2 und Panc-1 zeigten dieses Reaktionsprofil. Nach 24h Inkubation von MiaPaCa2 mit 50 µmol Ro5-486 zeigten die Zellen einen G1 Arrest (69,60% vs. 51,31%). In der S-Phase befanden sich 22,60% im Vergleich 31

zu 8,21% bei der Negativkontrolle. Die Ergebnisse dieser Versuche, sowie die der Zelllinien MiaPaCa-2 und Panc-1 sind in den Abbildungen 3a-f dargestellt. Capan-1 + Ro-5 4864 nach 24h 100% 90% 80% 70% Prozentanteil 60% 50% 40% G2 S G1 Sub G1 30% 20% 10% 0% Kontrolle 10µmol 50µmol 100µmol Konzentration Abbildung 3a: Zellzyklus Analyse von Capan-1 Zellen nach Inkubation Ro5-4864 für 24h. Die Inkubation von 50 µmol führte nach 24h zu einem ausgeprägtem G1 Arrest im Vergleich zur Kontrolle (77,4% vs.40,27% ). 7,58% der Zellen konnten bei dieser Konzentration in der Synthese Phase (S-Phase) nachgewiesen werden. In den Kontrollzellen befanden sich 29,31% in der DNA-Synthese-Phase. 32

Capan-1 + PK 11195 nach 24h 100% 80% Prozentanteil 60% 40% G2 S G1 Sub G1 20% 0% Kontrolle 10µmol 50µmol 100µmol Konzentrationen Abbildung 3b: Zellzyklus Analyse von Capan-1 nach 24h Inkubation mit 50 µmol PK 11195 zeigten die Zellen einen G1 Arrest (77,56% vs. 39,20%); in der S-Phase befanden sich 9,81%, im Vergleich zu 31,02% bei der Negativkontrolle. MiaPaCa2 + Ro5-4864 24h 100% 80% Prozentanteil 60% 40% G2 S G1 Sub G1 20% 0% Kontrolle 10µmol 50µmol 100µmol Konzentration Abbildung 3c: Zellzyklus Analyse von MiaPaCa-2 nach 24h Inkubation mit 50 µmol Ro5-4864 zeigten die Zellen einen G1 Arrest (69,60% vs. 51,31%); in der S-Phase befanden sich 8,21%, im Vergleich zu 22,60% bei der Negativkontrolle. 33

MiaPaCa2 + PK11195 24h 100% 90% 80% 70% Prozentanteil 60% 50% 40% 30% G2 S G1 Sub G1 20% 10% 0% Kontrolle 10µmol 50µmol 100µmol Konzentration Abbildung 3d: Zellzyklus Analyse von MiaPaCa-2 nach 24h Inkubation mit 50 µmol PK 11195 zeigten die Zellen einen G1 Arrest (78,88% vs. 48,43%); in der S-Phase befanden sich 4,82%, im Vergleich zu 23,79% bei der Negativkontrolle. Panc-1 + Ro5-4864 nach 24h 100% 90% 80% 70% Prozentanteile 60% 50% 40% G2 S G1 Sub G1 30% 20% 10% 0% Kontrolle 10µmol 50µmol 100µmol Konzentrationen Abbildung 3e: Zellzyklus Analyse von Panc-1 nach 24h Inkubation mit 50 µmol Ro5-4864 zeigten die Zellen einen G1 Arrest (62,77% vs. 42,67%); in der S-Phase befanden sich 8,52%, im Vergleich zu 22,89% bei der Negativkontrolle. 34

Panc-1 PK 11195 nach 24h 100% 80% Prozentanteile 60% 40% G2 S G1 Sub G1 20% 0% Kontrolle 10µmol 50µmol 100µmol Konzentrationen Abbildung 3f: Zellzyklus Analyse von Panc-1 nach 24h Inkubation mit 50 µmol PK 11195 zeigten die Zellen einen G1 Arrest (69,94% vs. 42,38%); in der S-Phase befanden sich 2,85%, im Vergleich zu 23,87% bei der Negativkontrolle. 3.2. Expression des pbr in Pankreaskarzinomlinien Die Inkubation der Zelllinie AsPC1 und BxPC3 mit einem Anti-pBR Antikörper und nachfolgender FITC-Markierung zeigte eine deutliche Fluoreszensintensitätsvertärkung der Zellen im Vergleich zu Zellen, die nur mit dem FITC markierten Zweit-Antikörper inkubiert wurden. Dies demonstriert, dass die für die Versuche verwendeten Zelllinien den pbr-rezeptor an ihrer Oberfläche exprimieren. ( Abbildung 4) 35

AsPC-1 BxPC-3 Zellzahl * 54.33% Zellzahl * 58.15% Fluoreszensintensität Fluoreszensintensität Abbildung 4: Inkubation der AsPC1 und BxPC3 mit einem Anti-pBR-Antikörper und nachfolgender FITC-Markierung. In der anschließenden Facscananalyse zeigt sich eine deutliche Fluoreszensintensitätsvertärkung der Zellen die mit einem AntipBR Antikörper inkubiert (*) wurden im Vergleich zu nichtmarkierten Zellen 3.3. Cytochrom C Cytochrom C in Zelllysaten und Kulturüberständen. Um die Art des Zelltodes weiter zu charakterisieren, wurden nach 48h Inkubation Cytochrom C- Messungen im Kulturüberstand und in den Zelllysaten durchgeführt. Cytochorm C ist ein Marker für den programmierten Zelltod. Bei einer Konzentration von 100 µmol führte die Inkubation mit Ro5-4864 zu einer signifikanten Erhöhung des Cytochrom C Spiegels im Kulturüberstand von AsPC-1 Zellen (1.84 ± 0.5ng/ml vs. 0.57 ± 0.06ng/ml, p<0.05). Im Kulturüberstand von BxPC-3 Zellen führte die Zugabe von 100 µmol Ro5-4864 ebenfalls zu einem signifikanten Anstieg des Cytochrom C Gehaltes (2.7 ± 0.1ng/ml vs. 0.49±0.06ng/ml, p<0.01). Mit den Liganden PK 11195 konnte kein signifikanter Unterschied von Cytochrom im Überstand im Vergleich zu der Kontrolle erreicht werden. (siehe Abbildung 5a und 5b). In Zelllysaten der beiden Zelllinien konnte hingegen bei einer Konzentration von 100 µmol nach Inkubation mit jeweils dem einen oder andern Liganden ein signifikant erniedrigter Cytochrom C Spiegel gemessen werden (siehe Abbildung 6a und 6b). 36

AsPC-1 + Ro5-4864 / PK 11195 nach 48h 2,5 2 p<0,05 rel.od 1,5 1 0,5 0 Control Ro5-4864 50µM Ro5-4864 100µM PK 11195 50µM PK 11195 100µM Abbildung 5a: Bei einer Konzentration von100 µmol führte die Inkubation mit Ro5-4864 zu einer signifikanten Erhöhung des Cytochrom C Spiegels im Kulturüberstand von AsPC-1 Zellen (1.84 ± 0.5ng/ml vs. 0.57 ± 0.06ng/ml, p<0.05). BxPC-3 + R05-4864 / PK 11195 nach 48h 3 2,5 p<0,01 2 rel.od 1,5 1 0,5 0 Control Ro5-4864 50µM Ro5-4864 100µM PK 11195 50µM PK 11195 100µM Abbildung 5b: Im Kulturüberstand von BxPC-3 Zellen führte die Zugabe von 100 µmol Ro5-4864 ebenfalls zu einem signifikanten Anstieg des Cytochrom C Gehaltes (2.7 ± 0.1ng/ml vs. 0.49 ± 0.06ng/ml, p<0.01). 37