Manuelle Zählung der Leukozyten TEAS Themen Leukozyten, Neubauer-Kammer, Türk sche Lösung, Hämolyse, Leukozytose, Leukopenie. Prinzip Leukozyten werden, wie Erythrozyten, mit dem mikroskopischen Zählkammerverfahren gezählt. Man erhält die Anzahl an Leukozyten in einem bestimmten Blutvolumen. Dafür wird die Blutprobe zunächst mit Türk scher Lösung behandelt, um die Erythrozyten zu zerstören (hämolysieren), während die Leukozyten erhalten bleiben. Die Türk sche Lösung enthält noch einen Farbzusatz (Gentianaviolett), durch den die Leukozytenkerne leicht violett angefärbt und damit besser sichtbar werden. Material Studenten-Basis-Set 1 Mikroliterpipette 10 100 µl 47141-03 1 Mikroliterpipette 100 1000 µl 47141-05 1 Digitale Stoppuhr 24025 1 Zählkammer nach Neubauer 64697 1 Pipettenspitzen 2-200 μl im Halter, 96 Stk. 47148-11 1 Pipettenspitzen 50-1000 μl im Halter, 100 Stk. 47148-12 1 Einweghandschuhe, M, Latex, 100 Stk. 46395 1 Einmalreaktionsgefäß, 1,5 ml, 1000 Stk. 37653 1 Mikroskop 62194-93 Chemikalien 1 Türk sche Lösung oder Essigsäure 3% 31900-10 Beachten Sie stets die Vorbemerkungen, wenn Sie diesen Versuch durchführen. Abb. 1: P5921400 www.phywe.com P5921400 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 1
TEAS Manuelle Zählung der Leukozyten Aufgaben Bestimmen Sie die Leukozytenzahl einer Blutprobe. Untersuchungsmaterial Untersuchungsmaterial Als Untersuchungsmaterial dient kapillär entnommenes Vollblut oder EDTA-Blut siehe Präanalytik. Durchführung: In einem Mikroreaktionsgefäß werden 950 µl Türk sche Lösung oder die gleiche Menge 3%ige Essigsäure und 50 µl gut gemischtes EDTA-Blut pipettiert. Es entsteht eine Verdünnung von 1 : 20. Das optisch plan geschliffene Deckglas wird mit leichtem Druck beider Daumen auf die mit etwas Wasser angefeuchteten seitlichen Trägerschienen der Neubauer-Kammer aufgeschoben. Auf beiden Flächen sollten dann sogenannte Newton sche Ringe sichtbar sein. Sie entstehen durch Interferenz des Lichts an der oberen und unteren Grenzfläche des Luftkeils zwischen Deckglas und Steg. Sind sie zu sehen, so liegt die Höhe des Zwischenraums zwischen den Trägerstegen und dem Deckglas in der Größenordnung der Lichtwellenlängen, ist also zu vernachlässigen. In diesem Zustand verrutscht das Deckglas beim Kippen der Zählkammer nicht. Nach gutem Vermischen der Lösungen in den Reaktionsgefäßen kann nun die Zählkammer (nach Neubauer) gefüllt werden (innerhalb einer Stunde nach dem Mischen der Lösungen), dann die Leukozyten 2 Minuten sedimentieren lassen. Gezählt wird unter dem Mikroskop mit dem 10-er Objektiv. Ausgezählt werden die 4 Eckquadrate mit jeweils 16 Kleinquadraten der Zählkammer. Hinweis Es sind grundsätzlich Doppelbestimmungen auszuführen. Weichen die gefundenen Werte um mehr als 15% voneinander ab, ist die Zählung zu wiederholen. Abb. 2: Füllen der Neubauer-Kammer Grundlagen Zur Leukozytenzählung eignen sich, wie bei der rot schraffiert:1 Erythrozytenzählung, das mikroskopische Zählkammerverfahren und die mechanisierte Be- mit 16 Eckquadrat stimmung mit elektronischen Zählgeräten. Kleinquadraten Bei der manuellen Zählung der Leukozyten in der Neubauer-Kammer muss keine so starke Verdünnung wie bei der Erythrozytenzählung vorgenommen werden, da die Anzahl der Leukozyten im Vergleich zur Erythrozytenzahl relativ gering ist. Kernhaltige rote Blutkörperchen, die bei pathologischen Zuständen im peripheren Blut vorkommen können, werden oft als Leukozyten verkannt und mitgezählt. Neubauer-Kammer Abb. 3: Zählkreuz der Neubauer-Kammer Bei Erwachsenen liegen die Konzentrationen normalerweise bei 4000 10.000 Leukozyten pro Mikroliter (µl) Blut. Bei einem höheren Wert spricht man von einer Leukozytose, bei einem kleineren 2 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P5921400
Manuelle Zählung der Leukozyten TEAS Wert von einer Leukopenie. Eine erhöhte Leukozytenzahl tritt bei allen Entzündungen, meist bakterieller Art, und bei Leukämien auf. Die Leukozytenzahl ist vermindert bei bestimmten Infektionskrankheiten, z.b. Typhus, Miliartuberkulose, Virusinfektionen, Lupus erythematodes LE, Leukämien (aleukämische Phase), bei allen zytotoxischen Einflüssen, Knochenmarksaplasie, Agranulozytose, Pancytopenie und physiologisch im Greisenalter. Auswertung Aus der Fläche (1 mm 2 ) und der Höhe (1/10 mm) eines Eckquadrats lässt sich dessen Volumen als 0.1 mm 3 bestimmen. In diesem Versuch zählt man die Leukozyten in den 4 Grundquadraten, also in 0.4 mm 3. Durch folgende Umrechnung mit dem Verdünnungsfaktor 20 erhält man die Anzahl N Leukozyten pro µl Blut: n ist die gezählte Anzahl in 0.4 mm 3 1:20 verdünntem Blut und N die Anzahl Leukozyten pro µl Blut. Die SI-Einheit (Internationale Einheitensystem, abgekürzt SI von frz. Système international d unités) ist die Anzahl Leukozyten pro Liter, da ein Liter 10 6 µl enthält, muss der Wert einfach damit mulitpiziert werden: 10 000 / µl = 10 10 9 / l Beispiel Kammer 1 2 3 4 Anzahl Leukozyten 51 47 48 54 Gesamtzahl: 200 Berechnung Gesamtleukozytenzahl pro µl: 200 50 = 10 000/µl Referenzwerte Neugeborene Bei der Geburt 9000-30000 /µl 2 Wochen alt 5000-20000 /µl Kinder 1-3 Jahre 6000-17500 /µl 4-7 Jahre 5500-15500 /µl 8-13 Jahre 4500-13500 /µl Erwachsene 4000-10000 /µl Achtung: Die angegebenen Normalwerte beziehen sich auf die westeuropäische Bevölkerung! www.phywe.com P5921400 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 3
TEAS Manuelle Zählung der Leukozyten Hinweis Die Schwankungsbreite der Kammermethode beträgt ca. ± 10%. Diese Kammer-Methode zeigt eine Reihe von Fehlerquellen, die zu Fehlinterpretationen führen können: - Blut angeronnen - falsches Verdünnungsvolumen - Benutzung von ungeeichten, defekten, spülfeuchten, ungereinigten Gerätschaften - mangelhafte Durchmischung - Deckglas falsch auf die Kammer aufgelegt - Kammer nicht luftblasenfrei gefüllt - Kammer überfüllt - Sedimentationszeit zu kurz - Zählung in der Kammer falsch durchgeführt - Falscher Verdünnungsfaktor zur Berechnung benutzt Fragen: - Unter welchen Umständen kann es zu einer physiologischen Erhöhung der Leukozytenzahl kommen? Physiologisch kommt es zu einer höheren Leukozytenzahl im Säuglingsalter, nach Nahrungsaufnahme, körperlicher Belastung, Stress und Sauerstoffmangel. 4 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P5921400
Manuelle Zählung der Leukozyten TEAS Protokoll Sie können Ihre Ergebnisse in der folgenden Tabelle notieren: 1. Bestimmung Kammer 1 2 3 4 Anzahl Leukozyten Gesamtzahl: 2. Bestimmung Kammer 1 2 3 4 Anzahl Leukozyten Gesamtzahl: Fragen: - Unter welchen Umständen kann es zu einer physiologischen Erhöhung der Leukozytenzahl kommen? www.phywe.com P5921400 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 5
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