Protokoll Versuch 1 d Bestimmung der photochemischen Aktivität isolierter Chloroplasten mit der Sauerstoffelektrode Chloroplasten verlieren bei ihrer Isolation die umhüllende Doppelmembran, die in der Thylakoidmembran verankerten Enzymkomplexe bleiben jedoch erhalten (PSI, PSII, LHCI, LHCII, Cytochrom b6/f, ATP-Synthetasen). Ferredoxin, NAD + und die Enzyme der CO 2 - Fixierung gehen bei der Isolation verloren, die Elektronenakzeptoren Ferredoxin und NAD können jedoch durch externe Akzeptoren (Hill-Reagenzien) ersetzt werden, so dass Sauerstoff gebildet werden kann. Der Versuch wurde nach Anleitung im Script durchgeführt. Es wurde zunächst die Sauerstoffbildung in Abhängigkeit zu der Lichtintensität gemessen. Anschließend wurde getestet, wie das System auf einen Entkoppler (Ammoniumsalz) und auf ein Herbizid (DCMU) reagiert. Zum Schluss wurde noch mit Hilfe der Extinktionen bei 664nm, 647nm und 750nm die Chlorophyllkonzentration in der Thylakoidsuspension bestimmt. 1. Sauerstoffproduktion in Abhängigkeit der Lichtintensität Ohne Graufilter (100% Lichtdurchlässigkeit) : 4,0 Skalenteile/min = 11,364 µmol O 2 /min Graufilter 1 (68% Lichtdurchlässigkeit) : 4,5 Skalenteile/min = 12,784 µmol O 2 /min Graufilter 2 (54% Lichtdurchlässigkeit) : 3,2 Skalenteile/min = 09,091 µmol O 2 /min Graufilter 3 (28% Lichtdurchlässigkeit) : 3,0 Skalenteile/min = 08,523 µmol O 2 /min Graufilter 4 (11% Lichtdurchlässigkeit) : 2,5 Skalenteile/min = 07,102 µmol O 2 /min Graufilter 5 (06% Lichtdurchlässigkeit) : 1,0 Skalenteile/min = 02,841 µmol O 2 /min 1 Skalenteil = 2,841 µmol O 2 Umrechnung auf µmol O 2 /h: Ohne Graufilter: 11,364 µmol O 2 /min = 681,84 µmol O 2 /h = 23,121 µmol O 2 mg -1 Chl h -1 Graufilter 1: 12,784 µmol O 2 /min = 767,04 µmol O 2 /h = 26,010 µmol O 2 mg -1 Chl h -1 Graufilter 2: 09,091 µmol O 2 /min = 545,46 µmol O 2 /h = 18,496 µmol O 2 mg -1 Chl h -1 Graufilter 3: 08,523 µmol O 2 /min = 511,38 µmol O 2 /h = 17,341 µmol O 2 mg -1 Chl h -1 Graufilter 4: 07,102 µmol O 2 /min = 426,12 µmol O 2 /h = 14,450 µmol O 2 mg -1 Chl h -1 Graufilter 5: 02,841 µmol O 2 /min = 170,46 µmol O 2 /h = 05,780 µmol O 2 mg -1 Chl h -1 Chlorophyllkonzentration in der Suspension = 648,78057mg/l Chlorophyllkonzentration in der Elektrodenkammer = (648,78057 / 22) mg/l = 29,49002591mg/l 100% = 90 W/m 2 68 % = 61,2 W/m 2 54 % = 48,6 W/m 2 28 % = 25,2 W/m 2 11 % = 12,2 W/m 2 6 % = 5,4 W/m 2
2. Sauerstoffproduktion in Abhängigkeit von Entkoppler (Ammoniumsalz) Bei 100% Lichtintensität: 5,5 Skalenteile/min = 15,626 µmol O 2 /min = 937,56 µmol O 2 /h = 31,792 µmol O 2 mg -1 Chl h -1 3. Sauerstoffproduktion in Abhängigkeit von Herbizid (DCMU) Bei 100% Lichtintensität: 0 Skalenteile/min Die Versuchsergebnisse zeigen deutlich die Abhängigkeit der Sauerstoffproduktion von der Lichtintensität. Das Optimum liegt jedoch nicht wie erwartet bei 100%, sondern bei 68%. Es ist zu vermuten, dass bei einer zu hohen Lichtintensität bestimmte Enzyme gehemmt werden. Der zweite Teilversuch mit dem Entkoppler Methylammoniumchlorid zeigte eine deutlich erhöhte Sauerstoffproduktion. Der Entkoppler erhöht die Permeabilität der Thylakoidmembran für H + -Ionen, so dass sie nicht mehr über die Elektronentransportkette transportiert werden und diese somit schneller ablaufen kann. Das heißt, es wird mehr Sauerstoff pro Zeiteinheit gebildet. Beim Herbizid hingegenwar keine Sauerstoffproduktion mehr feststellbar, was darauf zurückzuführen ist, dass DCMU das PSII (Ort der H 2 O-Spaltung, bzw. O 2 -Produktion) hemmt. Bei der Spaltung des Wassers werden außer Sauerstoff und Elektronen noch Protonen produziert, d.h. der ph-wert erniedrigt sich im Inneren des Thylakoidraumes. Dies müsste sich dann früher oder später auch im Medium bemerkbar machen (Konzentrationsgefälle) und mit Hilfe von Indikatoren messbar sein. Script zum Pflanzenphysiologischen Praktikum SS 2000, Versuchsgruppe 1: Photosynthese, 1d
Protokoll Versuch 1 e Hill-Reaktion isolierter Chloroplasten mir DCPIP Mit sogenannten Hill-Reagenzien als künstliche Elektronenakzeptoren kann man die Sauerstoffproduktion in isolierten Chloroplasten anregen. Solche Hill-Reagenzien sind z.b. Fe 3 + - Verbindungen und der blaue Farbstoff Dichlorphenolindiphenol (DCPIP). DCPIP wird am Plastochinon reduziert und wird dann farblos. Hemmt man nun die Elektronentransportkette durch z.b. DCMU (es verhindert die Reaktion von Plastochinon zu Plastohydrochinon) kann DCPIP nicht mehr reduziert werden. Der Versuch wurde gemäß Anleitung 1e durchgeführt. Reagenzglas DCPIP DCMU Chloroplastensuspension Färbung vor Versuchsbeginn 1 + - + blaugrün (Dunkelkontrolle) 2 + + + blaugrün 3 + - + blaugrün 4 - - + grün Reagenzglas Färbung nach Versuchsende 1 blaugrün = keine Veränderung 2 blaugrün = keine Veränderung 3 grün 4 grün = keine Veränderung Nur in Reagenzglas 3 läuft die Hillreaktion ungestört ab, da sowohl Licht vorhanden ist, als auch die Elektronentransportkette nicht gestört ist. Der blaue Farbstoff wird entfärbt und nur die grüne Farbe der Chlorophylllösung ist noch zu sehen. Reagenzglas 1 fehlt das Licht, in Reagenzglas 2 ist die Elektronentransportkette gehemmt. Script zum Pflanzenphysiologischen Praktikum SS 2000, Versuchsgruppe 1: Photosynthese, 1e
Protokoll Versuch 1 f Nachweis des bei der Photosynthese entstehenden Sauerstoffs Der bei der Photosynthese entstehende Sauerstoff kann mit Hilfe von Farbstoffen nachgewiesen werden. Die Farbstoffe werden dabei oxidiert. Ein solcher Farbstoff ist Indigocarmin. Im reduzierten Zustand ist er gelb, im oxidierten blau. Der Versuch wurde gemäß der Anleitung im Script durchgeführt. Einer Indigocarminlösung wurde eine Wasserpflanze (Elodea) zugesetzt. Eine zweite Lösung diente als Kontrolle. Die Indigocarminlösungen wurden zuvor mit Natriumdithionit sauerstofffrei gemacht. Versuchsergebnisse Mit Elodea: Blaufärbung der Indigocarminlösung (erst in direkter Umgebung der Pflanze, später die ganze Lösung) Ohne Elodea: keine Entfärbung Bei Beleuchtung stieg die Photosynthesetätigkeit der Pflanze und es wurde Sauerstoff gebildet. Der Sauerstoff oxidierte das gelbe Indigocarmin und es wurde blau. Script zum Pflanzenphysiologischen Praktikum SS 2000, Versuchsgruppe 1: Photosynthese, 1f
Protokoll Versuch 1 g Photoreduktion von Methylrot durch Chlorophyll Das durch Bestrahlung mit Licht angeregte Chlorophyllpaar P680 (PSII) erreicht durch die Anregung ein stark negatives Redoxpotential und gibt somit Elektronen an nachgeordnete Akzeptoren ab. Kehrt P680 in den Grundzustand zurück, hat es eine Elektronenlücke. Diese Lücke wird durch die Photolyse des Wassers geschlossen. Die von P680 ausgehende Elektronenübertragung kann mit Hilfe von Methylrot nachgewiesen werden. Methylrot wird dadurch reduziert und entfärbt sich. Reagenzglas Methylrot Chlorophyllsuspension Ascorbin säure Natriumdithionit Färbung vor Versuchsbeginn 1 + + + - bräunlich (Dunkelkontrolle) 2 + + + - bräunlich 3 + + - - bräunlich 4 + - + - rot 5 + - - + farblos Reagenzglas Färbung nach Versuchsende 1 bräunlich = keine Farbveränderung 2 Entfärbung bis hin zur Farbe Rohchlorophylllösung 3 bräunlich = keine Farbveränderung 4 rot = keine Farbveränderung 5 farblos = keine Farbveränderung Damit Methylrot reduziert werden kann, ist ein Elektronendonator mit sehr negativem Redoxpotential nötig. Das Redoxpotential der Ascorbinsäure (Reagenzglas 4) und das der chlorophyllhaltigen Lösung (Reagenzglas 3) reichen hierzu allein nicht aus. Nur in Kombination ist es möglich, unter Lichteinfluss Methylrot zu reduzieren (Reagenzglas 2). Natriumdithionit hat jedoch ein so negatives Redoxpotential, dass es Methylrot sofort reduzieren kann, ohne dass Licht notwendig ist. Script zum Pflanzenphysiologischen Praktikum SS 2000, Versuchsgruppe 1: Photosynthese, 1b Heldt, Hans W.: Pflanzenbiochemie, 2. Auflage 1999, Kapitel 3 Die Photosynthese ist ein Elektronentransportprozeß