Praktikum Wasserhygiene 2. Kurstag Dr. Sandro Wolf, Dr. Marina Totrova, Dr. Kerstin Röske Prof. Isolde Röske Präsentationsname XYZ Folie 1 von XYZ
Nähragar (Fleischagar) Einsatz: Universalnährboden zur Züchtung weniger anspruchsvoller Mikroorganismen. Zusammensetzung: Hefeextrakt 3 g/l NaCl 5 g/l Agar-Agar 10 g/l Pepton aus Fleisch, Casein 14 g/l Micrococcus luteus Wirkungsweise : entfällt Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus
Endoagar Einsatz: Selektivnährboden zum Nachweis von Escherichia coli und (fäkalen) coliformen Bakterien in Wasser, Milch, Milchprodukten und anderen Lebensmitteln nach Endo (1904); Nachweis der Laktoseverwertung Zusammensetzung: Pepton aus Fleisch, peptisch 10 g/l Lactose 10 g/l K 2 HPO 4 2,5 g/l Na 2 SO 3, wasserfrei 3,3 g/l Fuchsin (Pararosanilin) 0,4 g/l Agar 15 g/l
Endoagar (Forts.) Wirkungsweise: Bei der Nährbodenbereitung wird Fuchsin durch Sulfit zur farblosen fuchsinschwefligen Säure reduziert. Natriumsulfit und fuchsinschwefel. Säure unterdrücken das Wachstum der meisten grampositiven Bakterien, nicht jedoch der Enterobacteriaceae. E. coli und coliforme Bakterien bilden bei der Verwertung von Lactose neben Säure und Gas intermediär Acetaldehyd. Dieser reagiert mit Sulfit zu einer Additionsverbindung und setzt dabei aus der fuchsinschwefligen Säure den roten Farbstoff Fuchsin frei.
Endoagar (Forts.) Rote Kolonien: Lactose + Bakterien E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter Farblose (schwach rosa) Kolonien: Lactose Bakterien Salmonella, Shigella, Proteus E. coli Proteus vulgaris Klebsiella oxytoca
Cetrimid-Agar Einsatz: Nachweis von Pseudomonas aeruginosa Zusammensetzung: Pepton aus Gelatine Magnesiumchlorid Kaliumsulfat N-Cetyl-N,N,N-trimethylammoniumbromid(Cetrimid) Agar-Agar Pseudomonas aeruginosa Wirkungsweise : Cetrimid dient der weitgehenden Hemmung der Begleitflora. Kolonien von Pseudomonas aeruginosa bilden einen blau-grünen Farbstoff (Pyocyanin) und fluoreszieren im UV-Licht.
Blutagar Einsatz: Institut für Mikrobiologie Professur für Angewandte Mikrobiologie Isolierung und Züchtung anspruchsvoller, vor allem pathogener Mikroorganismen und zur Erfassung der Hämolyseform. Zusammensetzung: Nährsubstrat (Herzextrakt und Pepton) 20 g/l Natriumchlorid 5 g/l Agar 15 g/l Zusatz von frisch gewonnenem, defibriniertem Schafblut ca. 50-80 ml α- Hämolyse: -Umwandlung von Hämoglobin in Methämoglobin bei intakt gebliebener Erythrozytenmembran; - Ausbildung grüner Höfe um die Kolonien (Vergrünung); - häufig bei oralen Streptokokken, Enterococcus faecium β- Hämolyse: -Auflösung der Erythrozyten durch verschiedene Hämolysine (extrazelluläre Enzyme, z.b. Phospholipasen), -Abbau des Hämoglobins; klare Höfe um die Kolonien; -Eiter bildende hämolytische Streptokokken, Staphylococcus aureus
Blutagar Institut für Mikrobiologie Professur für Angewandte Mikrobiologie
TTC-Azid Agar Einsatz: Nachweis von Enterokokken Zusammensetzung: Pepton aus Casein 15,0 g Sojabouillon 5,0 g Hefeextrakt 5,0 g Glukose 2,0 g K 2 HPO 4 4,0 g Na-Azid 0,4 g TTC Wirkungsweise : Na-Azid hemmt das Wachstum GRAM-negativer Keime. Enterokokken sind unempfindlich gegenüber Na-Azid. Enterokokken reduzieren TTC (Triphenyltetrazoliumchlorid) zu rotem Formazan rote Kolonien
Aesculin-Galle Agar Einsatz: Nachweis von Enterokokken Zusammensetzung: Fleischextrakt 3,0 g Pepton aus Fleisch 5,0 g Ochsengalle 40 g Äsculin 1,0 g Eisen-(III)-citrat 0,5 g Wirkungsweise : Die von Enterokokken tolerierten Gallensalze hemmen die Begleitflora. Enterokokken hydrolisieren das Glucosid Äsculin in Glukose und Äsculetin. Äsculetin bildet mit Fe-(III)-Ionen einen olivgrünen bis schwarzen Komplex.
Zwei-Zucker Medium nach Kligler Nachweis von: Laktase (laktosespaltendes Enzym) Gärung in Form von CO 2 -Bildung, H 2 S-Bildung Zusammensetzung: 1 % Laktose (Substrat) 0,1 % Glukose (Substrat) Phenolrot (Indikator) Natriumthiosulfat (Substrat) Eisenammoniumcitrat (Reagenz)
Zwei-Zucker Medium nach Kligler (Forts.) Reaktionen: Durch den Glukoseabbau entsteht Säure und Phenolrot wird beim ph < 7 gelb. Nach Oxidation der Schrägfläche durch den Luftsauerstoff wird der Agar im oberen Bereich realkalisiert (ph steigt über 7) und die Schrägfläche wird rot, Wird auch Laktose gespalten (Säurebildung!), dann bleibt der gesamte Agar durch den Säureüberschuss gelb. Reduktion des Thiosulfat zu Schwefelwasserstoff Das gebildete H 2 S reagiert mit dem Eisenammoniumcitrat zu Eisensulfid, was als schwarzer Niederschlag ausfällt.
Harnstoffverwertung Urease Test: Um Harnstoff als N-Quelle nutzen zu können, müssen die Bakterien über das Enzym Urease verfügen, welches Harnstoff hydrolytisch in Ammoniak und Kohlendioxid spaltet. Die Freisetzung von Ammoniak führt zur Alkalisierung des Mediums (Harnstoff-Agar nach Christensen, enthält neben Harnstoff auch Pepton, Glucose sowie Phenolrot), wodurch es zum Farbumschlag des Indikators Phenolrot von gelb nach rot kommt. Bei Proteus vulgaris ist die Urease konstitutiv vorhanden, bei vielen Bakterien wird ihre Bildung durch Ammonium- Ionen reprimiert, einigen wie z.b. E. coli fehlt dieses Enzym. H 2 N-CO-NH 2 + H 2 O 2 NH 3 + CO 2
SIM-Agar Schwefelwasserstoff/Indolbildung/Mobility Zusammensetzung: Tryptophan (Substrat) Pepton (Cystein-Quelle) Fleischextrakt Dextrose (Substrat) Ammoniumeisen (III)-citrat Natriumthiosulfat Reaktionen: Die Beweglichkeit wird durch eine Trübung des Agars nachgewiesen. Verursacht wird diese Trübung durch die eingewanderten Bakterien. Tryptophan wird enzymatisch zu Indol abgebaut, das mit dem Kovacs-Reagenz nachweisbar ist, es wird jedoch erst nach der Inkubation manuell hinzugegeben. Sulfidbildung durch Schwärzung (FeS) im Bereich des Impfkanals
Indolproduktion dient zur Charakterisierung von Enterobakterien Nachweis des Enzyms Tryptophanase, welches AS Tryptophan in Indol, Pyruvat und Ammoniak spaltet Tryptophanase positiv: E. coli, Proteus vulgaris Tryptophanase negativ: Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes
Simmons-Citratagar Citratverwertung ist gut geeignet zur Unterscheidung von Enterobakterien Citrat kann als C-Quelle verwendet werden, wenn Enzym Citratlyase vorhanden ist Die mit der Citratverwertung einhergehende Alkalisierung wird durch Umschlag des Indikators Bromthymolblau von grün nach blau angezeigt
OF-Test Institut für Mikrobiologie Professur für Angewandte Mikrobiologie Nachweis: Oxidative-Fermentative Verwertung von Kohlehydraten: Zusammensetzung: Pepton Hefeextrakt KH 2 PO 4 Bromthymolblau Zucker (Glucose, Lactose, Maltose,...) Farbe: klar grün (blaugrün) Wirkungsweise: Zuckerabbau führt zur Ansäuerung Farbumschlag des Indikators nach gelb an der Oberfläche des offenen Röhrchens oxidativ im gesamten (im Paraffin verschlossenen) R. fermentativ Blaufärbung: Farbumschlag infolge Alkalisierung (Verwertung v. Pepton)
Biochemische Merkmale VOGES-PROSKAUER-Reaktion und Methylrot-Test: Nachweis: Unterschiede in der Glukoseverwertung der Enterobakterien Zusammensetzung: Pepton/Glukose Wirkungsweise: zunächst bauen alle Enterobakterien Glukose zu Pyruvat ab nachfolgend gemischte Säuregärung (überwiegend entstehen Säuren): Pyruvat --> Lactat / Acetat / Formiat z.b. E. coli, Proteus vulgaris Beim Enterobacter-Typ der Gärung wird vorrangig Acetoin und 2,3-Butandiol (vorwiegend neutrale Endprodukte) ausgeschieden - Butandiol-Gärung.
Biochemische Merkmale VOGES-PROSKAUER-Reaktion: Bei geringer Säureproduktion bei der Glucosevergärung werden z.b. von Enterobacter vorrangig Acetoin und 2,3-Butandiol gebildet. Aus 2 Molekülen Pyruvat wird durch die Katalyse der Acetyllactat-Synthase und der 2- Acetyllacat-Decarboxylase Acetoin gebildet, welches durch die Butandiol-Dehydrogenase zu 2,3- Butandiol reduziert werden kann. VP positiv
Biochemische Merkmale Methylrot-Probe: Indikator Methylrot wird zur bebrüteten Bouillon gegeben. Bei ph-werten < 4,4 erfolgt Farbumschlag nach rot. Methylrot positiv In diesem Fall wurde aus der Glucose viel Säure gebildet. sind Bakterien gewachsen, die Pyruvat zu neutralen Produkten umwandeln --> negativ
Biochemische Merkmale Katalase Test: während der aeroben Atmung wird auch H 2 O 2 gebildet; teilweise auch das extrem toxische Superoxid Die meisten aeroben und fakulativ anaeroben Bakterien haben das Enzym Katalase, welches imstande ist, für die Zellen das giftige H 2 O 2 zu spalten (2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 ). Strikt anaerobe Keime synthet. keine Katalase, Peroxidase oder Superoxid-Dismutase --> Sauerstoff wirkt toxisch Für die Bestimmung von Bakterienkulturen wird der Katalase-Test mit 3%iger H 2 O 2 durchgeführt.
Biochemische Merkmale Oxidase Test: Cytochromoxidase spielt wichtige Rolle im Elektronentransport der Atmungskette, z.b. bei den Gattungen Pseudomonas, Aeromonas, Flavobacterium (u.v.a.) Cytochrom-Oxidase katalysiert die Oxidation eines reduzierten Cytochroms durch molekularen Sauerstoff Es wird nicht von der Familie der Enterobacteriaceae gebildet Nachweis: Bei Anwesenheit von Cytochromoxidase wird das Reagenz Indolphenolblau oxidiert. Innerhalb von 30 sec. tritt eine intensive Blauviolettfärbung auf. Achtung mit Zahnstocher abnehmen, nicht mit Impföse
Biochemische Merkmale API-Testsystem 20 kleine Probengefäße mit unterschiedlichen Testsubstanzen Inokulation der Probengefäße mit Suspension der Reinkultur Ermittelung einer Kennzahl nach Inkubation (meist durch Farbveränderung) API 20 E; API 20 NE; API Staph; API Strep API 20 E mit postiven Testergebnissen (obere Reihe) und negativen Testergebnissen (untere Reihe); Quelle: Biomerieux