Georg-August-Universität Göttingen Fakultät für Biologie und Psychologie Pflanzenphysiologie Versuch Photosynthese Mitarbeiter: Drusenheimer, Nadja Gocht, Daniela Mai, Oliver Walther, Kathleen Betreuer: Ch. Leuschner, D. Hertel, H. Depta, Versuchsdatum: 26.10.2001 Abgabedatum: 02.11.2001
1. Aufgabenstellung In den Versuchen sollte die unterschiedliche Photosynthesleistung von Pflanzen, die an verschiedene Lebensräume angepasst sind, ermittelt und miteinander verglichen werden. Dabei sollten Sonnenpflanzen, Schattenpflanze und Wasserpflanze zuerst bei Volllicht und danach die Photosyntheseleistung der einzelnen Plfanzen bei veränderten Lichtintensitäten miteinander verglichen werden. Als Versuchspflanzen standen uns zur Verfügung: Landpflanzen: Helianthus annuus, Asteraceae (Sonnenpflanze) Salvia pratensis, Lamiaceae (Sonnenpflanze, angenommen) Aegopodium podagraria, Apiaceae (Schattenpflanze) Wasserpflanze: Elodea canadensis, Hydrocharitaceae 2. Theorie Die Photosynthese ist der wichtigste biochemische Prozess auf der Erde. Hierbei werden von Pflanzen mit Hilfe des Sonnenlichts aus einfachen anorganischen, energiearmen Verbindungen niedermolekulare organische, energiereiche Verbindungen (Kohlenhydrate) aufgebaut: 6 CO 2 + 12 H 2 O C 6 H 12 O 6 + 6 O 2 + 6 H 2 O E = + 2827 kj Aus dieser Glukose kann die Pflanze dann nach Bedarf Stärke, Lipide und Proteine aufbauen. Die meisten Landpflanzen nutzen zur Photosynthese durch das Chlorophyll a/b in den Thylakoiden der Chloroplasten insbesondere zwei Wellenlängenbereiche des sichtbaren Lichts: ca. 430-500 nm und ca. 680 nm. Andere Pflanzen nutzen zur Energiegewinnung in der Lichtreaktion auch noch andere Moleküle wie Chlorophyll c (Braunalgen), Carotinoide und Phycobiline. Dadurch kann das nutzbare Lichtspektrum erweitert werden, was insbesondere für Wasserpflanzen wichtig ist. Die von Chlorophyll b/c, den Carotinoiden und den Phycobilinen aufgenommene Energie wird vom Photosystem (PS) II über eine Elektronenkette zum Chlorophyll a im PS I transferiert. Dabei entsteht ATP in einer nichtzyklischen Photophosphorilierung und danach NADPH aus NADP + in einem nichtzyklischen Elektronenfluss nach dem PS I: ADP + P i ATP NADP + + H 2 O NADPH + H + + ½ O 2 Die anschließende Dunkelreaktion, bei CO 2 zu C 6 H 12 O 6 reduziert wird, ist unabhängig vom Licht. Dies geschieht im Stroma der Chloroplasten. In dieser Reaktion werden die in der Lichtreaktion gebildeten Energieträger ATP und NADPH wieder oxidiert. Die dabei freiwerdende Energie wird im Calvin-Zyklus zum Aufbau von Kohlenhydraten verwendet: 3 CO 2 + 9 ATP + 6 NADPH + 6 H + PGAL + 9 ADP + 8 P i + 6 NADP + + 3 H 2 O Das meiste dieses Glyceraldehyd-3-Phosphat (PGAL) wird dann ins Cytosol der Zelle transportiert, wo es in Saccharose umgewandelt wird. Das im Chloroplasten verbleibende PGAL wird tagsüber als Stärke im Stroma gespeichert. In der Nacht wird es zu Saccharose umgewandelt und über die Leitbündel in andere Pflanzenteile wie z.b. diewurzel transportiert. Die Photosyntheseleistung, also die Fähigkeit CO 2 zu fixieren, einzelner Pflanzen ist dabei sehr unterschiedlich. Es wird dabei zwischen Sonnenpflanzen und Schattenpflanzen sowie Wasserpflanzen unterschieden. Die Standortanpassung entscheidet, um was für eine Pflanze 2
es sich handelt. So sind Sonnenpflanzen bzw. Sonnenblätter auf Wiesen und Äcker bzw. in der äußeren (Licht-) Krone von tropischen Bäumen zu finden. Sie sind befähigt, große Leistungen zu erbringen (bis zu 30 µmol CO 2 m -2 s -1 ), haben allerdings einen sehr hohen Grundumsatz, sodaß der Lichtkompensationspunkt (Photosyntheseleistung = 0, also CO 2 - Fixierung = Respirations-prozesse) recht hoch ist. Bei Schattenpflanzen (Waldböden, innere Baumkrone) liegt dieser Punkt wesentlich niedriger. So können sie schon bei geringen Lichtintensitäten effektiv CO 2 fixieren. Allerdings liegt die apparente Photosyntheseleistung auch weit unter der von Sonnenpflanzen. Bei Wasserpflanzen liegt dieser Wert noch tiefer, da die Lichtintensität mit zunehmender Wassertiefe rapide abnimmt. Auch liegt bei diesen der Lichtkompensationspunkt noch niedriger als bei Schattenpflanzen, damit sie auch bei geringsten Lichtmengen Photosynthese betreiben können. Begrenzender Faktor für die Photosynthese ist jedoch nicht nur die Lichtintensität, sondern auch die Temperatur, die Luftfeuchtigkeit und der CO 2 -Gehalt des umgebenden Mediums. 3. Durchführung und Versuchsaufbau Bei der Bestimmung der Photosyntheseleistung von Pflanzen gibt es zwei Möglichkeiten, die beide im Versuch angewendet wurden. Bei Wasserpflanzen misst man die O 2 -Freisetzung und bei den Landpflanzen die CO 2 -Fixierung. Bei beiden Methoden wird nur die apparente Photosyntheserate, also die Differenz aus tatsächlicher CO 2 -Fixierung durch die Photosynthese und den pflanzlichen Atmungsprozessen (Mitochondrienatmung und Photorespiration), gemessen. Messung der O 2 -Freisetzung bei Elodea canadensis: Aufgrund des geringen Anteils gelösten Sauerstoffs in Wasser (nur 1,35 mmol l -1 bei 20 C) lässt sich die O 2 -Anreicherung durch die Photosynthese sehr leicht messen. Ein intakter Teil einer E. canadensis wird in eine Audusbürette geschoben. Diese wird bis zum Ende in einen mit Bicarbonat angereichertem Wasser (0,1 mol NaHCO 3 ) gefüllten Zylinder geschoben. Das Bicarbonat soll eine ausreichende Versorgung an CO 2 sicherstellen. Aufgrund von CO 2 HCO 3 - CO 3 2- wird durch das Bicarbonat das Gleichgewicht in die Richtung des gelösten CO 2 verschoben. Als Lichtquelle wird ein Diaprokjektor verwendet. In den Strahlengang wird vor die Audusbürette eine wassergefüllte Glasküvette zur Wärmeisolierung gestellt. Vor Beginn des Versuches wird durch Ansaugen des Wassers durch den oberen Gummischlauch eine gleichmäßige Verteilung der Bicarbonatlösung gewährleistet. Eventuell vorhandene Gasbläschen müssen vor Versuchsbeginn aus der Messkapillare abgelassen werden. Bei Bestrahlung mit einer bestimmten Lichtintensität produziert die Pflanze eine bestimmte Menge O 2 pro Zeiteinheit. Dieser Sauerstoff sammelt sich in der Messkapillare und kann so an der Meßskala abgelesen werden. Der Versuch wird bei der höchsten Lichtintensität (1500 µmol Photonen m -2 s -1 ) begonnen, da die Pflanze sich schneller auf eine geringe Lichtintensität einstellen kann als umgekehrt. So ist sichergestellt, dass wirklich der Faktor Licht und nicht die fehlende Enzymaustattung limitierend wirkt. Nach einer Adaptionszeit von jeweils 5 min kann mit der nächsten Messung begonnen werden. Dabei dauert die Messung von 250 1500 µmol Photonen m -2 s -1 5 min und von ca. 3 (Tageslicht) 100 µmol Photonen m -2 s -1 10 min. Abschließend wird die Anzahl der Blätter bestimmt und die erhaltenen Werte auf 1 m² hochgerechnet (siehe Berechnungen). 3
Messung der CO 2 -Fixierung bei Landpflanzen Bei den Landpflanzen bestimmt man nicht die O 2 -Freisetzung, sondern wegen der niedrigen CO 2 -Konzentration in der Luft die CO 2 -Fixierung. Dazu wird in das CO 2 -Gaswechselmeßsystem LI-6400 ein Teil eines Blattes in eine Plexiglaskammer eingespannt. Im Kammerinneren wird über einen Sensor registriert, wie schnell die Kammerluft im Vergleich zu einer Referenzkammer verarmt. Da CO 2 bei 2-5 mm Wellenlänge eine spezifische Strahlungsabsorbtion hat, kann die CO 2 -Konzentration der Kammerluft über einen Infrarot-Gasanalysator bestimmt werden. Die entsprechenden Lichtintensitäten werden über eine Kaltlicht-quelle in der Kammer eingestellt und für jeweils 3 min beibehalten. Dann wird die Photosyntheseleistung pro m² direkt abgelesen. Verwendete Lichtintensitäten: Bei Landpflanzen: 1500,1000, 750, 500, 250, 100, 50, 20, 0 µmol Photonen m -2 s -1 Bei Wasserpflanzen: 1500,1000, 750, 500, 250, 100, 50, µmol Photonen m -2 s -1, Tageslicht 4. Berechnungen Blattfläche: A Blatt = 0,13 cm² (im Durchschnitt) Z Blatt = 65 A O = A Blatt * Z Blatt = 0,13 cm² * 65 = 8,45 cm² = 8,45 *10-4 m² Photosyntheseleistung: 1 mol O 2 = 24056 cm³ 1 cm³ = 1 ml = 24056-1 mol W PS = 24056-1 mol * V O2 * (t * A O ) -1 Bsp: E. canadensis bei I = 1500 µmol Photonen m -2 s -1 W PS = 24056-1 mol * 0,03 cm³ * (300 s * 8,45 *10-4 m²) -1 W PS = 4,9195 µmol m -2 s -1 Quanteneffizienz: Q = mol Photonen * (mol CO 2 ) -1 = (y 2 y 1 ) (x 2 x 1 ) -1 H. annuus: m = (1,35 (-2,87)) (50 0) -1 = 0,0844 S. pratensis: m = (1,25 (-1,53)) (45 0) -1 = 0,0618 A. podagraria: m = (1,95 (-1,35)) (40 0) -1 = 0,0825 4
5. Auswertung und Ergebnisse Die Landpflanzen 1. Lichtkompensationspunkt: Der Lichtkompensationspunkt ist der Punkt (im Graphen mit römisch 1 gekennzeichnet), bei der der Kohlendioxidverbrauch durch die Photosynthese und die Kohlendioxiderzeugung durch die Photorespiration gleich sind. Bei Schattenpflanzen ist der Lichtkompensationspunkt bei geringerer Lichtintensität als bei Sonnenpflanzen erreicht. Wir schlussfolgern daraus, dass die Photorezeptoren einer Schattenpflanze empfindlicher auf Licht reagieren.so haben sie mehr Thylakoide und Granum in den Chloroplasten, mehr Antennenpigmente und eine geringe Atmungsrate pro Blattfläche. Weil Schattenpflanzen an Standorten mit geringerer Lichtintensität leben, müssen sie bei geringerem Licht Photosyntheseleistung erbringen um zu überleben. Dies zeigte sich auch in unseren Versuchen, bei dem Aegopodium podagraria als Beispiel einer Schattenpflanze den niedrigsten Lichtkompensationspunkt hatte, bei bei 19 µmol Photonen m -2 s -1. Im Gegensatz zu den Schattenpflanzen haben die Sonnenpflanzen ihren Lichtkompensationspunkt erst bei höherer Lichtintensität, weil sie eine höhere Atmung pro Blattfläche aufweisen. Insgesamt stört sie diese höhere Atmungsrate nicht, da sie aufgrund ihres Standorts an viel Licht gewöhnt sind. Auch dies wurde im Versuch durch Helianthus annuus, die ihren Lichtkompensations-punkt bei 34 µmol Photonen m - ²s -1 hat, bestätigt. Sie ist ein typisches Beispiel für eine Sonnenpflanze. Ein anderes Beispiel für eine Sonnenpflanze ist Salvia pratensis. Ihr Lichtkompensationspunkt liegt bei 25 µmol Photonen m -2 s -1. Sie ist eine schwache Sonnenpflanze, die auch an schattigen Standorten überlebensfähig ist. 2. Sättigungslichtstärke: Die Sättigungslichtstärke ist die Lichtintensität, bei der 90% der maximalen Photosyntheseleistung erbracht wird. Bei Schattenpflanzen ist die Sättigungslichtstärke niedriger als bei Sonnenpflanzen, weil die beteiligten Enzyme eine geringere Kapazität haben. Daraus leitet sich eine geringere Leistungsfähigkeit der CO 2 -Assimilation ab. Dies zeigte sich im Versuch bei A. podagraria, die ihren Lichtsättigungspunkt bei 350 µmol Photonen m -2 s -1 hat. Im Gegensatz dazu haben Sonnenpflanzen, wie H. annuus, die ihren Lichtkompensations-punkt bei 930 µmol Photonen m -2 s -1 haben, ihren Lichtsättigungspunkt bei höheren Werten, da die Kapazität der Photorezeptoren größer ist. Bei S. pratensis ist der Lichtsättigungspunkt bei 720 µmol Photonen m -2 s -1. Diese Kurve ähnelt stark der der Schattenpflanzen, was ihre Bezeichnung als Sonnenpflanze in Frage stellt. Dennoch sind die Photorezeptoren bei höherer Lichtintensität gesättigt, was sie als Sonnenpflanze auszeichnet. 3. Photosynthesevermögen: Das Photosynthesevermögen ist die 90%ige Photosyntheseleistung bei Lichtsättigung. Schattenpflanzen haben schon bei niedriger Lichtintensität diese Photosyntheseleistung erreicht, da sie eine geringere Atmungsrate besitzen. Die zeigt sich an A. podagraria, die das Photosynthesevermögen von ca. 8,6 µmol CO 2 m -2 s -1 am Lichtsättigungspunkt hat. Bei H. annuus liegt der Wert bei ca. 24,6 µmol CO 2 m -2 s -1. Der Wert ist so hoch, weil die Enzyme der Sonnenpflanzen eine höhere Leistung erbringen. Bei S. pratensis ist der Wert 9,3 µmol 5
CO 2 m -2 s -1. Auch hier kann man sie als Sonnenpflanze anzweifeln, da der Wert eher dem einer Schattenpflanze ähnelt. 4. Quanteneffizienz: Die Quanteneffizienz bezeichnet die Menge von fixiertem Kohlendioxid pro eingestrahlter Photonen. Um die Quanteneffizienz auszurechnen, nimmt man die Werte aus dem anfänglichen, linear ansteigenden Bereich des jeweiligen Graphen, die sich aus dem eingezeichneten Steigungsdreieck ergeben (siehe Rechnungsteil). Schattenpflanzen haben einen höheren Quanteneffizienzwert als Sonnenpflanzen, da sie bei gleicher Anzahl von Photonen mehr Kohlendioxid fixieren können, weil deren Photorezeptoren empfindlicher sind. Nach unseren Berechnungen hat A. podagraria eine Quanteneffizienz von 0,0825. H. annuus hat eine Quanteneffizienz von 0,0844. Der Wert ist geringer, weil sie als Sonnenpflanze mehr Photonen je assimiliertem CO 2 -Molekül benötigt und so nicht auf jedes Photon am Anfang ihrer Kohlendioxidfixierung angewiesen ist. S. pratensis hat eine Quanteneffizienz von 0,0618. Damit liegt sie höher als die Schattenpflanze, was verwunderlich ist, da ihr Wert theoretisch kleiner als der der Schattenpflanzen sein sollte, weil sie eine Sonnenpflanze ist. 5. Dunkelatmungsrate des Blattes: Die Dunkelatmungsrate ist die Kohlendioxidfreisetzung des Blattes durch Zellatmung bei völliger Dunkelheit. Bei Schattenpflanzen ist dieser Wert weniger negativ als bei Sonnenpflanzen. Das bedeutet, dass sie weniger Energie verbrauchen und so auch im Dunkeln weniger Redukte für die Photosynthese produzieren, da sie schon bei geringer Lichtintensität Photosynthese betreiben können (Lichtkompensationspunkt), aber auch schon bald ihre maximale Photosyntheseleistung erreicht haben. Die Dunkelatmungsrate bei A. podagraria liegt bei -1,35 µmol CO 2 m - 2 s -1. Im Gegensatz dazu haben Sonnenpflanzen ihre Dunkelatmungsrate bei negativeren Werten, wie H. annuus bei 2,87 µmol CO 2 m -2 s -1, weil sie aufgrund ihrer hohen Photosynthese-leistung mehr Energie verbrauchen. S. pratensis hat einen Wert von 1,53 µmol CO 2 m -2 s -1. Dies weist abermals mehr zur Schattenpflanze als zur Sonnenpflanze hin. Photosynthese bei Landpflanzen Photosyntheseleistung bei einer Wasserpflanze 30 6 Photosyntheseleistung [µmol CO 2 m -2 s - 25 20 15 1 ] 10 5 0 Aegopodium podagraria Salvia pratensis Helianthus anuus 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Photosyntheseleistung [µmol CO 2 m -2 s -1 ] 5 4 3 2 1 Elodea canadensis -5 Lichtintensität I [µmol Photonen m -2 s -1 ] 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Lichtintensität I [µmol Photonen m -2 s -1 ] Die Wasserpflanze Elodea canadensis: Bei der Wasserpflanze wurde die Sauerstofffreisetzung gemessen und dann auf die Kohlendioxidfixierung umgerechnet. Aufgrund dieser Meßmethode ist es nicht möglich, 6
negative Werte zu bestimmen und damit die Dunkelatmungsrate oder den Lichtkompensationspunkt anzugeben. Da im Dunkeln O 2 verbraucht wird und nicht entsteht, kann keine Sauerstofffreisetzung stattfinden und folglich auch nicht gemessen werden. Hätten wir wie bei den Landpflanzen die Kohlendioxidfixierung gemessen, könnten wir eine Dunkelatmungsrate und einen Lichtkompensationspunkt bestimmen. Das Photosynthesevermögen, 90% bei Lichtsättigung, liegt bei 3,5 µmol CO 2 m -2 s -1 und dessen Sättigungslichtstärke bei 670 µmol Photonen m -2 s -1. Im Vergleich mit den Landpflanzen ähneln die Werte eher denen einer Schattenpflanze. Dies lässt sich dadurch erklären, dass aufgrund der Fähigkeit des Wassers, Licht zu absorbieren und zu reflektieren, nicht genügend Licht die Pflanze erreicht. Also muß sie die wenigen Photonen, die sie erreichen, effektiv nutzen. Dies spiegelt sich in der Quanteneffizienz von 0,1444 wieder. Der Wert ist so hoch, weil der Bereich bis zur Dunkelrate nicht mit in die Rechnung einfließen kann. Obwohl es sich bei S. pratensis, wie der Name (Wiesensalbei) schon sagt, um eine Sonnenpflanze zu handeln scheint, zeigt sie jedoch kein typisches Verhalten einer solchen. Gerade in der Quanteneffizienz, aber auch im Photosynthesevermögen und der Dunkelatmungsrate, verhält sich S. pratensis wie eine Schattenpflanze. Die erhaltenen Ergebnisse für H. annuus und A. podagraria entsprechen den Erwartungen, die wir an eine Sonnen- bzw. Schattenpflanze hatten. Die Graphen haben Lehrbuchqualität. Der Knick im Graphen von E. canadensis bei ca. 100 µmol Photonen m -2 s -1 ist der Kategorie der zufälligen Fehler zurückzuführen, also auf einen Ablesefehler oder Ähnliches. Das Ansteigen der Geraden zeigt eher auf einen systematischen Fehler, da er sich gleichmäßig verteilt. 5. Fehlerdiskussion Eine Fehlerdiskussion bei der Messung der CO 2 -Fixierung am LI-6400 kann nicht erfolgen, da nichts über die interne Genauigkeit des Geräts bekannt ist. Zufällige Fehler können jedoch ausgeschlossen werden. Die Ergebnisse der Messung der O 2 -Freisetzung bei E. canadensis können jedoch bestenfalls eine grobe Näherung sein, da der systematische Fehler aufgrund des Versuchsaufbaus schon bei 10 1-10 3 liegt. Zum einen liegt der Lichtsensor nicht im direkten Strahlengang vom Projektor zur Audusbürette, sondern daneben. Das führt gerade bei höheren Lichtintensitäten aufgrund der Strahlbündelung zu enormen Abweichungen. Bei geringeren Lichtintensitäten (<500 µmol Photonen m -2 s -1 ) annuliert sich dieser Fehler, da der Strahlengang durch die größere Entfernung von Pflanze und Sensor beide gleichmäßig beleuchtet. Auch eine weitere Reduktion der Lichtintensität durch die Audusbürette wird nicht berücksichtigt. Ein weiterer, nicht zu unterschätzender Fehler kommt durch den Abgleich mit einem Unterwasser- Lichtsensor zustande. Da nur ein Abgleich gemacht wurde, ist dieser mit Fehlern behaftet, was sich schon allein daran erkennen lässt, das sich keine Eichgerade bildet (siehe Graph), sondern eine solche erst durch eine näherungsweise Approximation entsteht. Durch ein wiederholtes Abgleichen und den daraus resultierenden Durchschnittswerten hätte dieser Fehler minimiert werden können. Weitere Fehler kommen treten bei der Berechnung der Photosyntheseleistung auf. So lag die Temperatur während des Versuchs bei über 20 C, weswegen das Molvolumen (angegeben mit 1 Mol O 2 = 24056 cm³) höher ist. Die Blattfläche ist nur ein Durchschnittswert, weswegen hier auch ein Fehler angenommen werden kann. 7
Obwohl unsere erhaltenen und berechneten Werte für die Photosyntheseleistung in der richtigen Grössenordnung lagen, ist die erhaltene Kurve jedoch nicht mit den Graphen der Landpflanzen vergleichbar. Dies liegt zum einen an den oben beschriebenen systematischen Fehlern, bei denen immer auftretende zufällige Fehler wie z.b. die Ableseungenauigkeit noch nicht berücksichtigt sind, und zum anderen an der Auswahl des Lichtspektrums. E. canadensis erreicht auch in den im Versuch genutzten Lichtstärken ihre maximale Photosyntheseleistung. Insofern ist der Verlauf der Kurve mit dem exponentiellen Anstieg bei hohen Lichtintensitäten nur durch die beschriebenen Fehler zu erklären. 6. Literatur Raven, P.H.; Evert, R.F.; Eichhorn, S.E.: Biology of Plants, 6 th Edition; W.H. Freeman & Company, Worth Publishers, New York, 1999 Raven, P.H.; Evert, R.F.; Eichhorn, S.E.: Biologie der Pflanzen, 3. Auflage; Walter de Gruyter GmbH & Co. KG, Berlin, New York, 2000 Nultsch, W.: Allgemeine Botanik, 11. Auflage; Thieme, Stuttgart, 2001 Leuschner, C.; Hertel, D.; Hölscher, D.; Depta, H.: Praktikumsskript Praktikumsversuch: Photosynthese, Georg-August-Universität Göttingen, Göttingen, 2000 8