European Union Science Olympiad Test 2 Dublin, 10. April 2003 4 Stunden Bearbeitungszeit Bitte unbedingt zuerst lesen! 1. Es ist nicht erlaubt, irgendwelche Hilfsmittel ins Labor zu bringen. 2. Sie erhalten drei Antwortblätter für die Rohfassungen Ihrer Arbeit. 3. Das vierte Antwortblatt muss Ihre endgültigen Antworten enthalten. 4. Nur dieses vierte.antwortblatt wird bewertet. 5. Geben Sie..Ihre Diagramme und Tabellen mit diesem Antwortblatt ab. Seite 1 von 9
Einleitung Experiment I: Eigenschaften von Proteinen In dieser Aufgabe werden Sie einige Eigenschaften von Proteinen untersuchen. Proteine bestehen aus einer Abfolge von Aminosäuren, die zu langen Ketten angeordnet sind. Diese Ketten formen dreidimensionale Strukturen, wenn sie sich falten. Diese Strukturen geben Proteinen ihre spezifische Form und spezifischen Funktionen. Wenn wir die dreidimensionale Struktur eines Proteins unterbrechen oder zerstören, ist es möglicherweise nicht mehr in der Lage, normal zu funktionieren. Wenn ein Protein Lösungen verschiedener ph-werte ausgesetzt wird, kann es mehr oder weniger löslich werden. Solche Veränderungen können wir anhand optischer und anderer Methoden feststellen. Enzyme gehören zu den bedeutendsten Gruppen von Proteinen. Sie katalysieren sehr wichtige Reaktionen in lebenden Organismen. Jedes Enzym wirkt in der Regel bei bestimmten ph-werten am effektivsten. Sie werden diese Eigenschaft für das bereitgestellte Enzym messen. Enzyme setzen Substrate zu Produkten um. In dieser Aufgabe werden Sie die Produktion eines Farbprodukts durch ein Enzym und die Abhängigkeit der entstandenen Produktmenge von der Konzentration sowie dem Aktivitätsniveau des Enzyms untersuchen. Als Teil der Aufgabe müssen Sie zunächst eine Messmethode entwickeln, die die entstandenen Produktmengen unter Verwendung eines Spektralphotometers festhält. Sie müssen auch eine sogenannte Eichkurve für das Produkt entwickeln und diese Information anschließend zur Untersuchung der Enzymaktivität bei verschiedenen ph-werten verwenden. Phosphatasen sind Enzyme, die die Hydrolyse von Phosphat-Monoestern und die resultierende Freigabe von anorganischem Phosphat katalysieren. Sie kommen in der Natur äußerst häufig vor. Eine typische Reaktion ist: R O PO 3 2 Phosphatase H 2 O HPO 4 2 + R O H (1) Diese praktische Klausur enthält drei Aufgaben, die alle mit der Untersuchung von Proteinen zusammenhängen: a. In Aufgabe A werden Sie das LAMBERT-BEERsche Gesetz kennenlernen und untersuchen, bei welchen Konzentrationen von p-nitrophenol dieses Gesetz zutrifft. b. ln Aufgabe B werden Sie die Auswirkungen des ph-wertes auf das ausgewählte Protein Casein untersuchen und herausfinden, ob es renaturiert werden kann. c. In Aufgabe C werden Sie die Auswirkungen des ph-wertes auf die Aktivität eines Phosphatase-Enzyms untersuchen. Seite 2 von 9
Aufgabe A: Einführung zum LAMBERT-BEERSCHEN Gesetz Beim Durchgang von Licht durch ein Medium wird es teilweise absorbiert und gestreut. Eine Form des LAMBERT-BEERschen Gesetzes kann dazu verwendet werden, die. Abhängigkeit der Lichtintensität von der Konzentration eines Stoffes in einer Lösung zu beschreiben. Sie beschreibt die Beziehung zwischen der erhaltenen Intensität I, der Intensität, die sich bei Nullkonzentration I 0 ergeben hätte, der molaren Konzentration c und der Probenlänge l durch die Formel I = I 0 10 αcl (2) Die Konstante α ist eine Eigenschaft der gelösten Substanz, die als molarer Absorptionskoeffizient bezeichnet wird. Diese Konstante ist nur von der Frequenz des einfallenden Lichts abhängig. Das Produkt αcl wird als optische Dichte der Probe bezeichnet. Der-Logarithmus ist wie folgt definiert: wenn 10 x = y, dann 10 log y = x. Beispiel: 10 log 100 = 2. Wenn wir die Absorption A definieren als dann folgt von Gleichung 2, dass A = αcl (4) Ist mehr als ein absorbierender Stoff vorhanden, so kann Gleichung 4 verallgemeinert werden zu A = (α 1 c 1 + α 2 c 2 + ) l (5) Das LAMBERT-BEERsche Gesetz gilt jedoch nur unter bestimmten Bedingungen. Wenn zum Beispiel eine Veränderung des chemischen Gleichgewichts eintritt, trifft es nicht mehr zu. Die Konzentrationen, für deren Bereich Gleichungen 4 und 5 gelten, werden üblicherweise durch ein Diagramm ermittelt, in welchem die Empfindlichkeit S (sensitivity), die definiert ist als als eine Funktion von A dargestellt wird. Arbeitsvorschrift: (3) (6) Ihnen wurden drei Standardlösungen 300 µm p-nitrophenol in 0,02 M NaOH, 60 µm p- Nitrophenol in 0,02 M NaOH und 0,02 M NaOH zur Verfügung gestellt. Bereiten Sie eine Reihe von Konzentrationen aus p-nitrophenol (5 bis 300 µm) und 0,02 M NaOH vor und messen Sie deren Absorptionen mit Hilfe des Spektralphotometers Cary 5 Seite 3 von 9
i. Wählen Sie die optimale Wellenlänge aus, um den Absorptionswert von p-nitrophenol zu messen. Drucken Sie die erhaltenen Spektren und geben Sie sie als Diagramm 1 ab. ii. Bestimmen Sie eine geeignete Konzentrationsreihe, um eine Standardkurve zu erhalten. Erstellung einer Eichkurve für p-nitrophenol: 1. Bereiten Sie 10 Reagenzgläser mit bis zu 10,0 ml p-nitrophenol-lösung vor. Füllen Sie jedes Glas auf 10,0 ml durch Zugabe von 0,02 M NaOH auf. 2. Mischen Sie die Lösungen gut und lesen Sie die Absorptionswerte bei der optimal gewählten Wellenlänge ab. Verwenden Sie dabei eine Probe mit nur 0,02 M NaOH zur Nulleichung des Spektralphotometers. Beantworten Sie nun Fragen 1 bis 4 auf dem Antwortblatt Aufgabe B: Renaturierung von Casein In dieser Aufgabe werden Sie die Auswirkungen des ph-wertes einer Lösung auf die Löslichkeit von Casein untersuchen. Sie werden die Löslichkeit von Casein bei verschiedenen ph-werten durch die Feststellung von Veränderungen in der Lichtabsorption der Lösung überprüfen. Sie werden bestimmen, ob die Wirkung umkehrbar ist. Arbeitsvorschrift: In diesem Experiment werden Sie sowohl ph- als auch Lichtsonden eines Datensammlers (Data- Loggers) einsetzen. 1. Stellen Sie eine Casein-Lösung her, indem Sie das Casein langsam in ein großes Becherglas eines Magnetrührers mit 250 ml 0,01 M NaOH geben und unter Verwendung des Magnetrührstäbchens bei mittlerer Geschwindigkeit auflösen. Am besten geben Sie kleine Mengen Casein während des Rührens zu, statt das gesamte Protein gleichzeitig. Beginnen Sie sofort mit dieser Aufgabe, da sie wenigstens 20 Minuten in Anspruch nehmen wird. Seite 4 von 9
2. Kalibrieren Sie die ph-sonde anhand der bereitgestellten Standardwerte. Notieren Sie den ph-wert der unbekannten Probe unter Frage 5 des Antwortblatts. Beantworten Sie nun Frage 5 auf dem Antwortblatt 3. Bauen Sie die Apparatur gemäß der beigefügten Abbildung auf. Kalibrieren Sie die Lichtsonde. Stellen Sie Umgebungslicht auf 0 und Umgebungslicht + Lichtquelle auf 100. 4. Ihre Aufgabe besteht darin, Veränderungen im ph-wert und in der Lichtintensität über eine Zeit hinweg zu beobachten. Erfassen Sie diese Parameter unter Verwendung der Sonden und des Daten-Loggers; verwenden Sie eine Stoppuhr zur Erfassung der Zeit. Stellen Sie Ihre Daten in einer Tabelle mit der Bezeichnung Tab. 2 dar. Verwenden Sie dafür ein neues Blatt und legen Sie dies dem Antwortblatt bei. 5. Geben Sie ungefähr 300 µl 1 M HCI tropfenweise der Casein-Lösung zu. Beachten Sie, dass sich ein weißer Niederschlag bilden wird, der durch Rühren verschwindet. 6. Erfassen Sie die Lichtintensität in regelmäßigen Abständen. 7. Wiederholen Sie den Prozess für jede weitere Zugabe von Säure. 8. Geben Sie weiterhin Säure zu, bis sich entweder der Niederschlag auflöst oder der ph-wert unter 2 fällt. 9. Wiederholen Sie den Vorgang mit derselben Lösung durch tropfenweise Zugabe von 1M NaOH, bis die Lösung trüb wird. Geben Sie weiterhin Base zu, bis sich entweder der Niederschlag auflöst oder der ph-wert über 13 steigt. 10. Zeichnen Sie die folgenden Diagramme für die Zugabe von Säure und Base: "Diagramm 3", für ph und Zeit, "Diagramm 4" für Lichtintensität und Zeit und "Diagramm 5" für Lichtintensität und ph, und legen Sie diese dem Antwortbogen bei. 11. Wiederholen Sie die Zugabe von HCl und NaOH, um festzustellen, wie oft sich das Protein löst, bevor es denaturiert. Notieren Sie die Anzahl der Zyklen unter Frage 6 auf dem Antwortblatt. Die Versuchsaufsicht muss jetzt auf der ersten Seite des Antwortblattes unterschreiben. Beantworten Sie nun Fragen 6 bis 8 auf dem Antwortblatt Seite 5 von 9
Aufgabe C: Enzymaktivität Arbeitsvorschrift: Bestimmung des ph-optimums für Enzymaktivität Ihnen wurden Ethylendiamin-Carbonat-Puffer mit den folgenden ph-werten zur Verfügung gestellt: 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0; 10,0 und 11,0. 1. Pipettieren Sie 9,0 ml der Standard-Enzym-Phosphatase in ein Reagenzglas und stellen Sie dieses in den Reagenzglashalter. Diese Phosphatase-Verdünnung wird innerhalb von 30 Minuten bei Zimmertemperatur das p-nitrophenol-produkt linear bilden. 2. Pipettieren Sie genau 5,5 ml 0,1 M NaOH in 9 weitere Reagenzgläser und bewahren Sie diese getrennt auf. Diese Ansätze werden benötigt, um später die Enzymreaktion zu stoppen. 3. Geben Sie je 2,0 ml Pufferlösung, 2,0 ml 2,5 mm NPP (= Nitrophenolphosphat, nicht Nitrophenol) und 1,0 ml Enzymlösung in weitere Reagenzgläser. Sie werden die Pufferlösungen zur Bestimmung des optimalen ph-bereichs für Phosphatase verwenden. 4. Entnehmen Sie nach genau 30 Minuten Aufbewahrung bei Raumtemperatur 5 ml aus jedem Reagenzglas und geben Sie diese Lösungen je einem der Reagenzgläser mit NaOH zu. 5. Bestimmen Sie die Enzymaktivität für jede dieser Lösungen durch Messen der Absorption. Notieren Sie Ihre Ergebnisse in Tab. 3 auf dem Antwortblatt. Beantworten Sie dies in Frage 9 auf dem Antwortblatt 6. Stellen Sie sicher, dass Sie zumindest eine Kontrollprobe haben, und geben Sie an, worum es sich handelt. 7. Zeichnen Sie ein Absorption-pH-Wert-Diagramm mit der Bezeichnung "Diagramm 6". Beantworten Sie nun Fragen 10 bis 11 auf dem Antwortblatt Seite 6 von 9
European Union Science Olympiad ANTWORTBLATT Test 2 Dublin 2003 Land: Team-Nr. Unterschrift der Laboraufsicht für Aufgabe B, Frage 6: Versuchsleiter, Name: Unterschrift: Seite 7 von 9
Aufgabe A: Einführung zum LAMBERT-BEERschen Gesetz 1. Optimale Wellenlänge für die photometrische Untersuchung von p-nitrophenol: Stellen Sie in einer Diagramm 1 dar, wie Sie diesen Wert gewählt haben. Zeichnen Sie Abbildungen und Tabellen auf einem neuen Blatt und reichen Sie dies zusammen mit dem Antwortblatt ein. 2. Tragen Sie in die Tabelle die zur Erstellung der Eichkurve für p-nitrophenol verwendeten Daten ein. Berechnen Sie in der letzten Spalte die p-nitrophenol-konzentration. Menge an NaOH Menge an 60 µm Menge an 300 µm Röhrchen- p-nitrophenol- Nr. Nitrophenol Nitrophenol Konzentration 3. Stellen Sie in einem Diagramm mit der Bezeichnung "Diagramm 2" die Absorption in Abhängigkeit von der p-nitrophenol-konzentration dar. 4. Bestimmen Sie mit größtmöglicher Genauigkeit, bei welchen Konzentrationen von p-nitrophenol das LAMBERT-BEERsche Gesetz zutrifft. Wenn Sie ein weiteres Diagramm beilegen möchten, bezeichnen Sie dieses mit "Diagramm 2A". Konzentrationsbereich: Wert von α: Seite 8 von 9
Aufgabe B: Renaturierung von Casein 5. Der ph-wert der unbekannten Probe beträgt 6. Wieviele Zyklen haben Sie erreicht? Bitten Sie die Laboraufsicht, auf der ersten Seite des Antwortblatts zu unterzeichnen. 7. Bei welchen ph-werten war das Protein löslich bei welchen unlöslich? 8. Schätzen Sie den isoelektrischen Punkt von Casein (tatsächliche Ladung von Casein gleich Null). Aufgabe C: Enzymaktivität 9. Schreiben Sie auf, was Sie als Kontrolle benutzt haben Tab. 3 Bestimmung des optimalen ph-wertes ph-wert Absorption 10. Optimaler ph-wert für NPP-Aktivität 11. Gibt es andere ph-werte, bei denen das Enzym ebenfalls hohe Aktivität aufweist? Falls ja, geben Sie diese bitte hier an: Seite 9 von 9