Bernhard-Strigel-Gymnasium Kollegstufe Jahrgang:... 2009/2011 Memmingen Leistungskurs:... Biologie Kollegiatin:... Marina Schweizer Facharbeit Sphagnumklassifikation durch Sequenzanalyse Abgegeben am: 23.12.2010 Bewertung: Facharbeit: Note: Punkte: Mündliche Prüfung: Note: Punkte: Datum und Unterschrift des Kursleiters: Eingetragen in das Kursblatt:
- 2 - Inhaltsverzeichnis 1. Einführung... Seite 3 2. Vorbereitung... Seite 3 2.1. Materiallisten... Seite 3 2.2. Ablaufplan... Seite 5 3. DNA-Extraktion... Seite 5 4. Restriktionsverdau... Seite 8 5. Gelelektrophorese... Seite 8 6. Fehleranalyse... Seite 10 7. Sequenzanalyse... Seite 11 8. Ergebnis... Seite 14 9. Literatur- und Quellenverzeichnis... Seite 15 10. Erklärung des Kollegiaten... Seite 16
- 3-1. Einführung Moose lassen sich in verschiedene Gattungen gliedern, eine von diesen ist Sphagnum oder besser bekannt als Torfmoos. Diese Gattung lässt sich weiter in mehrere Arten aufteilen, wie zum Beispiel in die, in unserer Region häufig vorkommende, Art der Sphagnum magellanicum. Um Sphagnum zu klassifizieren gibt es mehrere Möglichkeiten. Einerseits kann man mikroskopisch die einzelnen Arten unterscheiden, andererseits ist dies auch auf genetischem Wege möglich, unter anderm durch die Nutzung der Sequenzanalyse. Ich werde nun im Folgenden in einzelnen Schritten näher erläutern, wie man die sphagnum DNA mithilfe der Sequenzanalyse einer bestimmten Art zuordnen kann. 2. Vorbereitung Um im Labor fehlerfrei arbeiten zu können, ist eine sorgfältige Vorbereitung sehr wichtig. Diese beinhaltet eine Checkliste der benötigten Materialien und einen zeitlich angepassten Ablaufplan um ein flüssiges Arbeiten gewährleisten zu können und unnötige Verzögerungen zu verhindern. 2.1 Materialliste Das wichtigste Utensil zur Sphagnumklassifikation ist Sphagnum selbst. Diese Moosart findet man in verschiedenen Mooren und ist eindeutig von anderen Moosen zu unterscheiden. Im Folgenden befindet sich eine kurze Auflistung der benötigten Materialien für die einzelnen Arbeitsschritte. DNA-Extraktion: Mörser Pipetten mit passenden Spitzen Sterile Eppis Vortexer Heizblock (vorgewärmt auf 65 C)
- 4 - Eis Zentrifuge Stickstoff Kit (beinhaltet DNeasy Mini Spin Columns, QIAshredder Mini Spin, collection tubes (2ml), Puffer AP1, Puffer AP2, Puffer AP3/E, Puffer AW, Puffer AE, RNase ) Ethanol der vor Gebrauch zu dem Puffer AP3/E dazugegeben werden muss Restriktionsverdau: 1µl 10fach konzentrierten Puffer Heizblock ( vorgewärmt auf 37 C) 0,5µl RE-Lösung 8µl steriles Wasser Zentrifuge Pipetten mit passenden Spitzen Gelelektrophorese: Agarose TAE-Puffer Mikrowelle Lederhandschuhe Gelkammer + Gelkamm Gelladungspuffer Zentrifuge Größenmarker Pipetten mit passenden Spitzen Skizzenblock Spannungsquelle
Sequenzanalyse: - 5-4 Reagenzgläser universeller Primer 4 verschiedene Typen an ddntps (ddatp, ddgtp, ddctp, ddttp) 4 verschiedene Typen an dntps (datp, dgtp, dctp, dttp) DNA Polymerase Pipetten mit passenden Spitzen 2.2 Ablaufplan Es ist schwer einen optimalen Ablaufplan darzustellen, da jeder sein eigenes Arbeitstempo hat. Was jedoch klar definiert werden kann, ist die Abfolge der einzelnen Arbeitsschritte. Im Vorfeld sollte natürlich geprüft werden ob alle benötigten Utensilein vorhanden sind. Sollten vorgewärmte Heizblocke o.ä. benötigt werden, ist es sinnvoll zu Beginn entsprechenden Maßnahmen durchzuführen. Auch ist es ratsam jeden Arbeitsschritt nach dem andern durchzuführen. Jedoch ist eine Möglichkeit für eine schnellere Sphagnumklassifikation, während des Laufens der Gelelektrophorese, bereits mit der Sequenzanalyse zu beginnen. Da natürlich meist mehrere Proben bearbeitet werden, sollte dies möglichst parallel ablaufen. 3. DNA-Extraktion Eine der Hauptvoraussetzungen für die Sequenzanalyse ist die DNA-Extraktion. Sie sorgt dafür, dass die DNA isoliert wird und somit mit ihr optimal gearbeitet werden kann. Zunächst werden die Sphagnum Proben zerkleinert, um den weiteren Verlauf zu erleichtern. Dazu werden ca. 20 g getrocknetes Sphagnum in eine Mörser-Schale gegeben und mit flüssigem Stickstoff übergossen, bis die Probe darin schwimmt. Daraufhin wird das Sphagnum mit dem Mörser-Löffel zerdrückt bis es nur noch aus grünem Pulver besteht und der ganze Stickstoff verdampft ist. Dieses Sphagnumpulver wird nun in sterile Eppis gegeben. Anschließend wird mithilfe des DNeasy Plant Mini Kits weitergearbeitet. Dieses ist ein Baukasten zur Extraktion und Reinigung von Pflanzen DNA und enthält bereits die wichtigsten Hilfsmittel.
- 6 - Auch liegt ein auf englisch geschriebenes Handbuch bei, das die einzelnen Schritte genau beschreibt. (QIAGEN, 2006) Im Folgenden werde ich diesen Leitfaden zusammenfassen und eventuell ein wenig davon abweichen, um ihn für meine Zwecke abzurunden. Da wir bei unseren Versuchen im Labor die DNA mit der alternativen Methode des Protokolls zerkleinert haben, werde ich mit dem im Handbuch benannten siebten Schritt fortfahren. Allerdings sollten im Vorfeld die Puffer auf ihre Konsistenz geprüft werden. Falls die Puffer AP1 und AP3/E Fällungsprodukte ausweisen, sollte diese bei 65 C erwärmt werden, um ihre optimale Liquidität wieder herzustellen. Dabei ist jedoch zu beachten, dass der Puffer AP3/E nicht erwärmt werden darf, falls er schon mit Ethanol versetzt wurde. Außerdem sollte zu den Puffern AW und AP3/E vor ihrer ersten Benutzung Ethanol hinzugegeben werden, da diese im Kit als Konzentrate vorliegen. 1. In die Eppis mit 20 mg des grünen Sphagnumpulver werden 400 µl des Puffers AP1 und 4 µl der RNase A dazugegeben und mit dem Vortexer durchgeschüttelt, bis keine Klumpen mehr sichtbar sind. Anschließend wird die Lösung bei 65 C im vorgewärmten Heizblock für 10 min inkubiert. Der Puffer AP1 sorgt dafür, dass die Zellmembranen zerstört werden und die RNase verdaut die RNA. Durch die Benutzung des Vortexers wird die Diffusion beschleunigt. Während der Inkubationszeit läuft der Vorgang ab, da der Puffer und die RNase bei einer Temperatur von 65 C am best möglichsten arbeiten. 2. Als nächstes werden 130µl des Puffers AP2 in die Eppis gegeben und durch Schütteln gemixt. Der Puffer AP2 ist dafür zuständig, dass in der Lösung Proteine und Polysaccharide gefällt werden. 3. Danach wird das Lysat 5 min auf Eis incubiert und anschließend weitere 5 min bei 14 000 rpm zentrifugiert. 4. Die Sphagnumprobe wird nun in ein QIAshredder Mini spin column pipettiert, welche wiederum in einem Eppi platziert ist und 2 min bei 14 000 rpm zentrifugiert. Dabei fließt das Lysat durch die QIAshredder Mini spin column, in welcher Verunreinigungen hängen bleiben, in das Sammelgefäß. Es kann vorkommen, dass nicht alle Verunreinigungen entfernt werden können und als Niederschlag im Eppi liegen bleiben. Die daraus entstehende Kugel sollte im nächsten Schritt nicht mitaufgenommen werden.
- 7-5. Das Sphagnumgemisch wird nun, möglichst ohne den vorher benannten Niederschlag mit aufzunehmen, in ein neues Eppi pipettiert. Die Lösung sollte ungefähr ein Volumen von 450 µl aufweisen, um dieses jedoch exakt festzustellen, ist es ratsam mehrmals 100 µl bzw. 50 µl zu pipettieren. 6. Zu dieser Sphagnumlösung wird nun das 1,5fache des Lösungsvolumens von dem Puffer AP3/E, der zuvor mit Ethanol versetzt wurde, dazugegeben. Bei einer Lysatmenge von 450 µl entspricht das einer Puffermenge von 675 µl. Anschließend wird die Probe durch Pipetieren gemixt. 7. Das ganze Gemisch, jedoch maximal 650 µl, wird nun in ein DNeasy Mini spin column pipettiert, welches in einem Eppi platziert ist. Ein eventuell entstehender Rest sollte nicht vernichtet werden. 8. Diese Probe wird nun für 1 Minute bei 8000 rpm zentrifugiert. Der entstandene Durchfluss wird verworfen wohingegen das Eppi weiter verwendet wird. 9. Der eventuell in Schritt 7 entstandene Rest kann nun ebenfalls in das DNeasy Mini spin column pipettiert und bei 8000 rpm eine Minute lang zentrifugiert werden. Der Durchfluss kann wieder verworfen werden, ebenso das Eppi. 10. Das DNeasy Mini spin column wird nun in einem neuen Eppi platziert und anhand von 500 µl des Puffers AW gewaschen. Dieses Gemisch wird erneut bei 8000 rpm eine Minute lang zentrifugiert und der Durchfluss wird verworfen, jedoch nicht das Eppi. Der Puffer AW sorgt dafür, dass die DNA im DNeasy Mini spin column hängen bleibt, im Gegensatz zu anderen noch vorhandenen Stoffen, welche nach der Zentrifugation den Durchfluss bilden. 11. Ein weiteres Mal werden 500 µl des Puffers AW zu dem Lysat dazugegeben. Die Probe wird 2 min bei 14000 rpm zentrifugiert und das DNeasy Mini spin column anschließend in einem neuen Eppi platziert. 12. Nun werden 100 µl des Puffers AE dazugegeben und die Probe wird bei Raumtemperatur 5 min inkubiert und danach bei 8000 rpm 1 min zentrifugiert. Der Puffer AE bewirkt das
- 8 - Abfallen der DNA aus dem DNeasy Mini spin column, d.h. die isolierte DNA bildet nun den Durchfluss im Eppi. 13. Zum Schluss wird der Schritt 12 nochmals wiederholt, jedoch nur mit 75 µl des Puffers AE. 14. Das DNeasy Mini spin kann verworfen werden, da nun in dem Eppi die extrahierte Sphagnum DNA vorliegt. Diese kann bei 20 C gelagert werden. 4. Restriktionsverdau Für den weiteren Verlauf ist es sinnvoll die Sphagnum DNA in kleinere Fragmente zu zerteilen, da diese besser in der Gelelektrophorese wandern. Diesen Verfahren nennt man Restriktionsverdau. Dabei wird die DNA mit einem Restriktionsenzym geschnitten. Bei unserem Versuch im Labor verwendeten wir das Restriktionsenzym EcoR1. Bei diesem Arbeitsschritt wird 1 µl der in Schritt 3. extrahierten Sphagnum DNA in einem neuen Eppi mit 1 µl des dem Enzym entsprechenden Puffers, 8 µl sterilem Wasser und 0,5 µl der RE-Lösung, welche in diesem Fall das Restriktionsenzym EcoR1 enthält, gemischt. Anschließend im short spin Modus zentrifugiert und für 5 min bei 37 C im Heizblock inkubiert. 5. Gelelektrophoreses Die Gelelektrophorese ist ein Verfahren mit dessen Hilfe sich die einzelnen DNA-Fragmente trennen und so besser unterscheiden lassen. Diese Technik basiert auf einer Spannung die an dem Gel angelegt wird und der Laufgeschwindigkeit der Fragmente. Auch ist ihre Größe und ihre Ladung (DNA ist immer negativ geladen) von entscheidender Bedeutung. Die Resultate einer Gelelektrophorese können über die verschiedensten Einzelheiten Aufschluss geben. Für das weitere Verfahren jedoch, ist der schlichte Nachweis, dass die Proben DNA enthalten, ausreichend. Zur Herstellung des Gels werden 0,2 g Agarose mit 20 ml 1%-iger TAE-Puffer vermischt und unter Beobachtung in der Mikrowelle aufgekocht. Dabei ist zu beachten, dass die Mischung
- 9 - keine Klumpen enthält. Anschließend wird sie vorsichtig in die Gelkammer gegossen und der Gelkamm wird eingesetzt. Wichtig dabei ist, dass man bei einer fest gepolten Gelkammer den Kamm auf die negative Seite setzt da DNA negativ geladen ist und somit zum positiven Pol wandert. Nun muss das Gel abkühlen bis es milchig-trüb ist. Danach wird soviel TAE-Puffer in die Gelkammer gegossen bis das ganze Gel leicht bedeckt ist, im Anschluss kann der Gelkamm entfernt werden. Die daraus entstandenen Taschen können nun befüllt werden. Als erstes werden 5 µl des Größenmarkers in die Taschen pipettiert. Meistens entweder in die beiden äußersten oder in die mittlere Tasche. Bevor das Gel weiter beladen werden kann, müssen 5 µl der verschiedenen Sphagnumlösungen jeweils mit 2 µl Gelladungspuffer in einem neuen Eppi vermengt und im short spinn Modus zentrifugiert werden. Diese Lösungen können nun in die restlichen Taschen pipettiert werden. Dabei ist es wichtig ein Skizze anzufertigen, welche festhält in welcher Tasche sich welche Probe bzw. der Marker befindet. Wenn man dies vergisst, kann eine spätere Auswertung sehr schwer werden, da man nicht mehr weiß um welche Probe es sich in welcher Tasche handelt. Als nächstes wird die Spannungsquelle mit 84 Volt angeschlossen. In diesem Fall ist bei einer nicht fest gepolten Gelkammer die genaue Polung zu beachten. Aufgrund des DNA Wanderungsverhalten zum positiven Pol, muss an die Seite der Gelkammer mit den Taschen, in welchen sich die Sphagnum DNA befindet, der negative Pol angebracht werden. Nachdem die Spannungsquelle eingeschaltet wurde, wird das Gel solange laufen gelassen bis der Marker, der durch eine blaue, für das bloße Auge erkennbare Bande gekennzeichnet ist, beinahe am Ende des Gels angelangt ist. Man lässt den Marker nicht ganz bis zum Ende laufen, da es sonst sein könnte, dass sehr kleine DNA Fragmente vom Gel fallen. (Abb.1: Polung der Gelkammer und Skizze)
- 10 - Die anschließende Färbung des Gels sollte nicht von Laien durchgeführt werden, da dazu krebserregende Stoffe benützt werden und man deshalb sehr vorsichtig mit ihnen umgehen sollte. Nach dem Lauf wird das Gel für ungefähr 10-30 Minuten in eine mit Ethidiumbromidlösung gefüllte Wanne gelegt und anschließend auf einem UV-Leuchttisch begutachtet. Da sich Ethidiumbromid zwischen die DNA legt, wird diese unter UV-Licht sichtbar und dadurch lässt sich anhand von blauen Banden nachweisen, ob DNA existiert und wie weit sie gewandert ist. Es ist üblich dieses Ergebnis fotographisch festzuhalten. Sollte keine DNA zu erkennen sein, muss in den vorherigen Schritten ein Fehler unterlaufen sein. 6. Fehleranalyse Natürlich läuft ein so komplexer Versuch bei den ersten Durchläufen nicht immer fehlerfrei ab. Um sich im Vorfeld über mögliche Fehler in Kenntnis setzten zu können, werde ich folgend einige, die mir oder Kollegiaten unterlaufen sind, aufzeigen und analysieren, wieso sie sich ereigneten bzw. welche Folgen daraus entstanden sind. Zuvor möchte ich jedoch einen kurzen zeitliche Überblick über meine Laborarbeit geben. Bei den Versuchen im Labor habe ich mit den, von uns vorher im Schorenmoos gesammelten, Sphagnumproben gearbeitet. Ich führte am 11.06.2010 mit der Probe 001 (später: DNA 005) und der Probe 003b (später DNA 006) sowie am 21.06.2010 mit der Probe 007 (später: DNA 010) die DNA-Extraktion durch. Der Restriktionsverdau und die Gelelektrophorese erfolgten mit allen drei Proben am 05.07.2010. Aufgrund von Zeitmangel konnte ich die Sequenzanalyse nicht selbst im Labor durchführen und werde sie später nur theoretisch aber leider ohne Einfluss eigener Erfahrungen beschreiben. Ein Fehler der uns öfters unterlaufen ist, bestand darin, dass wichtige Utensilien fehlten oder leer waren. Einst fehlte die RNase, welche, wie sich später herausstellte, zwar im Kit vorhanden, aber falsch bzw. für uns unverständlich beschriftet war. Dies führte dazu das wir unseren Versuch beim ersten mal ohne RNase fortsetzten und somit die RNA nicht verdaut werden konnte.
- 11 - Dies hat zu Folge das als Ergebnis der DNA-Extraktion keine reine DNA sondern ein RNA- DNA Gemisch vorliegt. Diese Sphagnumprobe ist nicht für den weiteren Gebrauch geeignet, da bei der Gelelektrophorese die RNA und die DNA nicht mehr unterschieden werden können und die Sequenzanalyse somit ein falsches Ergebnis liefert. Auch hatten wir einmal keinen Stickstoff vorrätig, weshalb wir unsere Sphagnumproben erst, nachdem wir Neuen besorgt hatten, zerkleinern konnten. Durch solche Fehler verzögerte sich unsere Laborarbeit unnötig und wertvolle Zeit ging verloren. Deshalb ist es sehr wichtig, im Voraus zu überprüfen ob alle wichtigen Materialien vorrätig sind und falls während der Arbeit auffallen sollte, dass ein Stoff zur Neige geht und somit beim nächsten Arbeitstag zu wenig bzw. keiner mehr vorrätig sein sollte, sollte dieser bis dahin wieder aufgefüllt werden. Essenziell ist auch das Verständnis über den nachfolgenden Schritt. Ein Missachten dieses Punktes führte bei unserem Versuch im Labor dazu, dass wir bei der Arbeit mit dem Kit (vgl. 3.2. Schritt 7) den entstandenen Rest der Probe einfach vernichteten. Somit verringerten wir sinnloserweise die Menge unseres Ergebnisses der DNA-Extraktion. Daneben ist ein weiteres Problem, welches auftreten kann, eine ergebnislose Gelelektrophorese, d.h. unter UV-Licht ist keine DNA sichtbar. Dies kann mehrere Fehler als Ursache haben. Einerseits kann es sein, dass die DNA-Extraktion ineffektiv ausgefallen ist. Andererseits kann die Ursache auch eine mangelhafte Ethidiumbromidlösung sein. 7. Sequenzanalyse Die Sequenzanalyse ist ein Verfahren, wodurch man die genaue Abfolge der einzelnen Nucleotide einer DNA herausfinden kann. Dadurch kann man feststellen inwiefern sich die DNAs verschiedener Arten einer Gattung unterscheiden bzw. ähneln. Darüber hinaus lässt sich somit ein unbekanntes Lebewesen einer bestimmten Art zuordnen. Eine sehr bekannte Methode der Sequenzanalyse ist die SANGER-COULSON Methode, welche auch als Kettenabbruch-Methode bekannt ist. Sie basiert auf kettenabrechenden Didesoxynukleotidtriphosphaten ( ddntp ), welche die DNA-Replikation beenden, sobald sie anstelle von Desoxynukleotidtriphosphaten (dntp ) eingebaut werden. Der strukturelle Unterschied zwischen ddntps und dntps ist, dass nach dem Einbau von ddntps in den neu gebildeten DNA-Strang eine Hydorxylgruppe (OH-Gruppe) fehlt um
- 12 - weitere Nukleotide anzuknüpfen. Somit beendet der Einbau von ddntps die DNA Replikation. (Abb. 2: Unterschied zwischen ddntp und dntp) Zu Beginn der Sequenzanalyse wird die DNA mit der PCR vermehrt. Für das weitere Verfahren benötigt man jedoch nur die codogenen Einzelstränge der DNA die sequenziert werden soll. Der Doppelstrang wird anhand einer Denaturierung und einer darauf folgenden Gelelektrophorese getrennt. Somit erhält man mehrere gleiche codogene Einzelstränge. Da der Versuch in vitro stattfindet, werden als nächstes vier Reagenzgläser benötigt. In jedes von ihnen werden einige Sphagnum Einzelstränge gegeben. Des Weiteren werden ein universeller Primer, die DNA-Polymerase und die vier verschiedenen dntps (datp, dgtp, dttp, dctp), wobei eins von ihnen radioaktiv markiert ist, beigemischt. Außerdem wird in jedes der vier Reagenzgläser eines der vier verschiedenen ddntps gegeben. Zum Beispiel in Reagenzglas eins (A) das Abbruchnukleotid ddatp, in Reagenzglas zwei (G) das Abbruchnukleotid ddgtp, usw. Wenn nun der DNA Strang synthetisiert wird, entstehen durch die vier verschiedenen Abbruchnukleotide in jedem Reagenzglas unterschiedlich lange, zum Originalstrang komplementäre, neue Stränge. Dabei ist es jedoch wichtig auf das Verhältnis zwischen ddntp und dntp zu achten. Wenn zu viele ddntps vorhanden sind bricht die DNA Replikation zu oft zu früh ab und im schlimmsten Fall entstehen somit keine von den längst möglichsten Strängen. Wenn jedoch zu wenig ddntps gegenwärtig sind, kann daraus resultieren, dass kaum bis gar keine kurzen DNA Stränge vorhanden sind. Das Verhältnis von ddntp zu dntp sollte ungefähr 1 zu 100 betragen. Im Anschluss an diese DNA Replikation, wird eine Gelelektrophorese (siehe Schritt 5) durchgeführt. Jedoch wird dieses mal kein Größenmarker benötigt. Des Weiteren bedarf es nur vier Taschen, in welche das Ergebnis der vier verschiedenen Reagenzgläser pipettiert wird. Somit entstehen vier Banden, die jeweils nach ihrem
- 13 - Abbruchnukleotid benannt sind. Auch hier ist es erforderlich eine Skizze anzufertigen, welche festhält, in welcher Tasche sich das Ergebnis welches Reagenzglases befindet. Nachdem das Gel richtig beladen wurde, kann es, wie in Schritt 5 beschrieben, laufen gelassen werden. Da die DNA in dem Gel mit bloßem Auge nicht sichtbar ist, sorgen die radioaktiven dntps dafür, dass durch die Autoradiographie, die Stellen sichtbar werden, an denen sich ein DNA Strang befindet, der ein solches radioaktives dntp eingebaut hat. Dadurch, dass eines der vier normalen dntps (datp, dgtp, dttp, dctp ) komplett durch radioaktive dntps ersetzt wurde (z.b. alle datps sind radioaktiv), sollte jeder Strang anhand der Autoradiographie sichtbar sein. Nachdem die DNA Stränge sichtbar gemacht wurden, lässt sich nun die Reihenfolge der Nukleotide des Strangs einfach ablesen. Beginnend mit dem kürzesten Strang, der Strang der im Gel am weitesten gelaufen ist, liest man nun bis zum längsten, am wenigsten weit gelaufenen, Strang. Jeder Strang bekommt das Nucleotid zugeteilt, in wessen Bande es sich befindet, d.h. wenn der kürzeste Strang sich in der A-Bande befindet bzw. an letzter Stelle ein A Abbruchnukleotid hat, beginnt der abgelesene Strang mit einem A-Nucleotid. Befindet sich der nächste Strang in der G-Bande, lautet der abgelesene Strang bis dahin AG. Ist man am Ende angelangt, hat sich ein neuer Strang gebildet, der komplementär zu dem ursprünglichen Sphagnum-DNA-Strang ist. Dieser lässt sich nun aus dem neuen Strang ableiten, indem man die Nukleotide durch ihr entsprechendes Basenpaar ersetzt. Wenn der Strang z.b. mit AG beginnt, wird daraus nun TC (A => T ; G => C ). Das Resultat daraus ist der original DNA Strang von 3 nach 5. Liest man ihn von hinten nach vorne, hat man ihn in 5 -> 3 Form. (Abb. 3 : Beispiel einer Sequenzanalyse )
- 14-8. Ergebnis Das Endergebnis dieses Verfahrens ist der original sphagnum DNA-Strang. Führt man diese Versuche mit mehreren Sphagnumproben durch, kann man ihre DNA Stränge vergleichen und somit anhand der Nukleotidabfolge Unterschiede feststellen. Katalogisiert man diese Ergebnisse der Sphagnumpflanzen, welchen man im Vorfeld schon eine bestimmte Art zuordnen konnte, so kann man im Anschluss mit Hilfe dieses Katalogs Sphagnumpflanzen, welche sich nicht auf eine andere Art und Weise eindeutig zuweisen lasse, anhand ihrer DNA einer Art zuordnen.
- 15-9. Literatur- und Quellenverzeichnis Bücher: CHAWLA, H.S. (2002): Introduction to Plant Biotechnology. Second Edition. Enfield, USA: Science Publishers, Inc. ISBN 1-57808-228-5 KREUTZIG THOMAS (1984 ) Kurzlehrbuch Biochemie, Elsevier GmbH, München ISBN-10: 3-437-41774-6 / ISBN-13: 978-3-437-41774 QIAGEN (Juli 2006): DNeasy Plant Handbook. DNeasy Plant Mini Kit,Cat. no.: 69104 SCHMITT, P. Einführung in die Grundarbeitstechniken der Molekulararbeit Internetseiten: http://www.molecular-plant-biotechnology.info/recombinant-dna-technology/dnasequencing.htm (zuletzt aufgerufen am: 15.12.2010) HENSEL, LUKAS (2009) http://www.lukopolis.de/biomain.php?biopage=abbrucha (zuletzt aufgerufen am: 11.12.2010 ) QIAGEN (2003-2009) Frequently Asked Questions FAQs, What is the composition of buffer AE? http://www.qiagen.com/faq/faqview.aspx?faqid=730&searchtext=buffer+ae&faqcate goryid=0&menuitemid=0&productlineid=0 ( zuletzt aufgerufen am: 21.12.2010) SPEKTRUM DER WISSENSCHAFT VERLAGSGESELLSCHAFT MBH: http://www.wissenschaftonline.de/abo/lexikon/bio/6443 (zuletzt aufgerufen am: 19.12. 2010) Abbildungen: Titelbild: Sphagnum magellanicum (http://www.nature-diary.co.uk/2007-07-17.htm) Abb. 1: Polung der Gelkammer und Skizze (Privatfoto der eigenen Laborarbeit) Abb. 2: Unterschied zwischen ddntp und dntp (http://www.bioinformatics.nl/webportal/background/techniques.html ) Abb. 3: Beispiel einer Sequenzanalyse (http://www.biocompare.com/articles/productreview/1221/dneasy-plant-mini-kit- From-Qiagen.html)
- 16 - Erklärung des Kollegiaten: Ich erkläre, dass ich die Facharbeit ohne fremde Hilfe angefertigt und nur die im Literaturverzeichnis angeführten Quellen und Hilfsmittel benützt habe. Memmingen, den 23.12.2010... (Unterschrift des Kollegiaten)