Facharbeit. Versuch einer Sphagnum-Klassifikation durch PCR

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1 Bernhard-Strigel-Gymnasium Kollegstufe Jahrgang: /2011 Memmingen Leistungskurs:... Biologie Kollegiatin:... Mohammed Graibei Facharbeit Versuch einer Sphagnum-Klassifikation durch PCR Abgegeben am: Bewertung: Facharbeit: Note: Punkte: Mündliche Prüfung: Note: Punkte: Datum und Unterschrift des Kursleiters: Eingetragen in das Kursblatt:

2 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung DNA Extraktion und Nachweis verschiedener Sphagnumproben Vorbereitende Schritte DNA Extraktion Restriktionsverdau Gelelektrophorese Fehleranalyse Weitergang der Kartierung mithilfe der PCR Ziel der PCR Benötigtes Material Auswahl des Primers Ablauf der PCR Vorbereitung der Probe Denaturierung Annealing ( =Hybridisierung) Elongation ( =Polymerisierung) Abschluss der PCR Endgültige Kartierung Literaturverzeichnis Fachbücher Internetquellen Bildquellen Anhang... 17

3 -3-1. Einleitung Aus dem Leistungskurs-Biologie des Bernhard-Strigel-Gymnasiums gab es eine Reihe von Schülern, die in diesem Fach ihre Facharbeit erstellen wollten. Ein Teil dieser Schüler entschied sich eine Facharbeit im Bereich Biotechnologie und so entstand die AG Sphagnum. Die AG Sphagnum unter Leitung von Herr Weber setzte sich zum Ziel, verschiedene, aus dem Schorenmoos gesammelte Proben des Mooses der Gattung Sphagnum anhand ihrer morphologischen sowie ihrer genetischen Eigenarten zu kartieren und näheres über Vorkommnisse im besagten Moor, sowie eventuelle, evolutiv bedingte Gemeinsamkeiten zu erschließen. Dieses ehrgeizige Projekt erwies sich jedoch als eine derart große Herausforderung, dass sie in dieser Form nicht im gesetzten Zeitrahmen zu bewältigen war. Stattdessen wurden die beteiligten Schüler der AG Sphagnum auf verschiedene Teilbereiche angesetzt, die einen hypothetischen Weitergang der Arbeit behandelt und somit den Weg für andere Schüler ebnen soll, indem die praktischen Erfahrungen die die Gruppe gemacht hat weitergeben werden. Thema dieser Facharbeit ist es, die praktisch durchgeführte DNA- Extraktion darzustellen und anzuleiten, sowie den weiteren Verlauf bei Durchführung einer PCR zu erschließen. Zu letzterem Teil der Facharbeit sei zu erwähnen, dass seine Funktionsweise nicht durch praktische Arbeit erprobt werden konnte, sich also nur theoretisch mit dieser entscheidenden Prozedur auseinandersetzt. Dieser Umstand mindert jedoch nicht dessen Wichtigkeit, ist die PCR doch für eine Genkartierung unerlässlich. 2. DNA Extraktion und Nachweis verschiedener Sphagnumproben 2.1 Vorbereitende Schritte Um die genetische Sphagnum-kartierung zu ermöglichen, gilt es, die DNA aus dem Moos zu isolieren. Auf dieser DNA-Isolation basieren auch alle folgenden Schritte, es muss also besonders in diesem Arbeitsschritt auf Sorgfältigkeit geachtet werden. Im schulischen Labor wurde diese DNA-Isolation mithilfe des Qiagen DNeasy Plant Mini Kits durchgeführt, daher orientieren sich folgende Angaben auf die Arbeit mit diesem Kit, sind aber selbstverständlich auch auf gleichartige Kits anwendbar. Vor der eigentlichen Arbeit sind jedoch gewisse

4 -4- Vorbereitungen zu treffen. Die dazu benötigten Mittel werden hier aufgrund ihrer Vielzahl aufgelistet: Vorheizen eines Heizblocks auf 65 C Stoppuhr bereithalten Überprüfung des oben genannten Kits auf Vollständigkeit, sowie Gültigkeit der enthaltenen Lösungen Vorbereitung der benötigten Utensilien (Pistil & Mörser, flüssiger Stickstoff, Spatel, Pipetten) Eis in Styroporbox lagern Vortexer bereitstellen Zentrifugen einstellen: 1x 8000 rpm 1x rpm Bekleidung mit Schutzkittel und Schutzbrille Proben bereithalten, in diesem Falle die Moose der Gattung Sphagnum 2.2 DNA Extraktion Nachdem die Vorbereitungen getroffen wurden, kann mit der Isolation begonnen werden. Um die Zellen der Probe mechanisch zu öffnen, erwies sich die Methode der Zerreibung einer Moosprobe (40 mg, wegen der Feuchtigkeit der Probe; 20 mg wenn die Probe trocken wäre), die mithilfe von flüssigem Stickstoff gefroren wurde, in einem Mörser als schnell und sauber. Nachdem die Probe nun mechanisch bearbeitet wurde, folgt der chemische Teil, in dem das Erzeugnis zunächst in ein Eppendorf Gefäß gegeben wird. Um die Lyse der Zelle herbeizuführen wird der Puffer AP1 (400 µl) hinzugefügt, sowie die RNase A (4 µl) um enthaltene RNA zu verdauen. Sollte die RNase im Eppendorf-Reaktionsgefäß (im Nachfolgenden kurz Eppi genannt) nicht vollständig nach unten pipettiert werden können, sollte es kurz (<1 Sek.) zentrifugiert werden. Nun wird das Eppi im Vortexer durchmischt, bis keine Verklumpungen mehr zu sehen sind. Dies ist wichtig, damit die Lyse überall Wirkung zeigt. Nach der Durchmischung wird das Eppi in den vorgeheizten Heizblock (65 ) gelegt und 10 Minuten lang stehen gelassen. 130 µl des Puffers AP2 werden nun dem Lysat hinzugefügt, durch leichtes Schütteln durchmischt und für 5 Minuten auf das vorbereitete Eis gelegt. Durch

5 -5- diesen Puffer werden enthaltene Proteine abgebaut. Der Empfehlung des Herstellers folgend, sollte das Eppi nun für 5 Minuten bei rpm zentrifugiert werden. Dies ist nötig, um wahrscheinlich entstandene Ablagerungen zu sammeln und den Überstand abpipettieren zu können. Dieser Überstand wird nun in ein sogenanntes Mini Spin Column gegeben, welches im Kit enthalten ist. Es ist eine Säule, die das Lysat von Zellresten reinigen soll. Dieses Erzeugnis wird 2 Minuten lang mit rpm zentrifugiert. Dabei entsteht am Boden des Columns ein Pellet, eine Ansammlung von Zellresten, die nicht aufgewirbelt werden sollten. Die Flüssigkeit sollte nun ca. 450 µl fassen und muss im folgenden Schritt in ein neues steriles Eppi übertragen werden, in das zusätzlich die 1.5 fache Menge (hier: 650 µl) des Puffers AP3/E (das E steht für Ethanol, der vorher hinzugegeben werden muss) gegeben wird. Dieses Gemisch sollte nun durch wiederholtes Pipettieren durchmischt und dann, zusammen mit einem evtl. verbleibenden Niederschlag, in ein DNeasy Mini Spin Column überführt werden, zunächst nur 650 µl. Das Mini Spin Column muss nun 1 Minute bei 8000 rpm zentrifugiert und der Durchfluss verworfen werden. Das Cap (unterer Teil, indem sich der Durchfluss sammelt) jedoch sollte aufgehoben werden, um einen etwaigen Rest zentrifugieren zu können und die DNA Ausbeute zu erhöhen. Danach kann auch das Cap verworfen werden. Die Säule wird nun über ein neues Cap gesteckt und mit 500 µl des Puffers AW (auch diesem sollte Ethanol hinzugefügt worden sein) versetzt, ein Puffer der zur Waschung der Säulenmembran dient. Nach einminütiger Zentrifugation bei 8000 rpm, Verwerfung des Durchflusses (Cap jedoch wieder verwenden), sowie der darauffolgenden wiederholten Hinzugabe des Puffers AW (500 µl) und darauffolgender zweiminütiger Zentrifugation bei rpm sollte die Membran deutlich heller erscheinen, was die Waschung der Membran bestätigt. Die Säule muss nun unter größter Sorgfalt entfernt werden, um einen Kontakt mit dem zu verwerfenden Durchfluss zu vermeiden. Dies hätte eine Kontamination und somit Verschmutzung der Säule mit Ethanol zur Folge. Die vorsichtig entfernte Säule muss über ein Eppi (Volumen ml) gesteckt werden, wobei auf die Säulenmembran 100 µl des Puffers AE gegeben werden. Säule und Eppi müssen nun 5 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen werden, um sie im finalen Schritt der DNA Extraktion 1 Minute lang bei 8000 rpm zu zentrifugieren. Um die maximale Ausbeute an DNA zu gewährleisten, sollte das ganze wiederholt werden, jedoch nun mit nur 75 µl AE Puffer. Nun ist man im Besitz der gereinigten Sphagnum DNA, die im folgenden Abschnitt einem Restriktionsverdau unterzogen wird.

6 Restriktionsverdau Der Restriktionsverdau muss durchgeführt werden, um die DNA-Fragmente zu verkleinern und somit die Gelelektrophorese ermöglichen zu können. Zur Durchführung des Restriktionsverdaus werden 2 µg unserer gereinigten DNA zusammen mit 1 µl Puffer (10-fach konzentriert) und 8 µl sterilem Wasser in ein Eppi gegeben. Zuletzt muss man noch die jeweilige Restriktionsenzymlösung (bei der AG Sphagnum war dies das Enzym EcoRI) hinzugeben, die man vorher in der Styroporbox gekühlt gehalten hat, um die Funktion des Enzyms nicht zu beeinträchtigen. Das Volumen der zu hinzuzufügenden Lösung beträgt hierbei 5 µl. Nach Durchmischung muss der Ansatz nur noch abzentrifugiert und bei 37 C für Minuten inkubiert (SCHMITT, o. J.: S.28) werden. Die vorhandene DNA wurde somit vom Restriktionsenzym an den für ihn spezifischen Sequenzen geschnitten und verkürzt, was wiederum Voraussetzung für eine erfolgreiche Gelelektrophorese ist. 2.4 Gelelektrophorese Um überhaupt ein Vorhandensein von DNA in den Proben nachzuweisen, ist es erforderlich, die nicht aussagekräftige Lösung optisch sichtbar zu machen. Dies geschieht bei der Gelelektrophorese. Das Prinzip lautet, die DNA-Fragmente, die beim Restriktionsverdau geschnitten wurden, mittels elektrischer Spannung durch ein Gel zu ziehen, um sie später zu färben und Ergebnisse zu erhalten. Man beginnt mit der Erstellung eines Agarosegels. Dazu müssen 0,2 g Agarose und 20 ml des Puffers TAE gemischt werden (vorzugsweise in einem sterilen Fläschchen). Nach der groben Durchmischung wird das diese Komponenten enthaltende Fläschchen ohne Deckel in einer Mikrowelle erwärmt. Es ist ratsam, Lederhandschuhe anzuziehen, da sich das aus Glas bestehende Fläschchen sehr stark erwärmt. In kurzen Intervallen wird es nun in die Mikrowelle gegeben, wieder herausgenommen und überprüft. Dies geschieht solange, bis Agarose und TAE Puffer nicht mehr unterschieden werden können, sich also eine klare, farblose und vor allem klumpenfreie Flüssigkeit ergeben hat. Danach muss der Deckel zwecks Kondensationsschutz aufgesetzt werden. Ist es abgekühlt, kann es in die Gelelektrophoresekammer abgegossen werden. Jetzt muss noch der sogenannte Kamm

7 -7- aufgesetzt werden, um die nötigen Taschen herzustellen, in die die präparierte Lösung hineinpipettiert werden kann. Nun muss man lediglich die Festigung des Gels abwarten. Ist das Gel gefestigt, so werden 5 µl der DNA-Lösung gemeinsam mit 2 µl eines Gelladungspuffers in einem Eppi gemischt. Dies geschieht, um dafür Sorge zu tragen, dass die in die Taschen pipettierten Lösungen dort einerseits absinken und verbleiben (dazu dient der Glycerinanteil im Gelladungspuffer), sowie um die Wanderung der DNA durch das Gel optisch verfolgen zu können, was durch die zwei enthaltenen, unterschiedlichen Farbstoffe ermöglicht wird (vgl. SCHMITT, o. J.: S. 22). Die Gelkammer wird nun mit dem TAE-Puffer begossen, bis die gesamte Kammer leicht bedeckt ist, wobei der Kamm nun entfernt werden kann. In der Mitte oder auch an beiden äußeren Taschen wird nun ein Marker (100 bp) vorsichtig hineinpipettiert. Es ist darauf zu achten, dass die das Markergen enthaltende Lösung, sowie später die zu analysierenden Proben, genau in die Taschen pipettiert werden und ein Berühren des Gels mit der Pipette ausgeschlossen wird. Bevor jedoch die Proben hineinpipettiert werden, ist es unerlässlich, sie eindeutig zu bezeichnen und zu protokollieren, in welche Tasche die Probe pipettiert wurde. So sollte jede Probe auch später noch ihrem entsprechenden Ausgangsmoos zweifelsfrei zugeordnet werden können. Ist dies geschehen, so kann die Gelelektrophoresekammer an den Strom geschlossen werden, und zwar mit einer Spannung von Volt. Wichtig ist, dass der Strom korrekt angelegt wird, d.h. die negativ geladenen DNA Fragmente müssen sich auf der Seite der negativen Elektrode (hier: Kathode) befinden, um folglicherweise von dieser abgestoßen zu werden und im Gegenzug zur positiven Elektrode (hier: Anode) hingezogen zu werden. Nach einiger Wartezeit sollte die Kammer vom Strom getrennt werden, es ist darauf zu achten, dass diese Wartezeit nicht zu lang ist, da sonst die Gefahr besteht, dass die DNA-Fragmente über das Ende des Gels gelangen und eine sinnvolle Aussage über die Verteilung der Fragmente nicht mehr möglich ist. Ist die Wartezeit jedoch zu kurz, so ist das Gel nicht aussagekräftig, da die Banden sich teilweise überlagern und nicht eindeutig differenzierbar sind. Final kann das Ergebnis nur ausgewertet werden, wenn das Gel einer Färbung mithilfe von Ethidiumbromid unterzogen wird, welche aufgrund der mutagenen Eigenschaften des Ethidiumbromids nur von der Lehrkraft durchzuführen ist. Die Wirkung dieser Chemikalie wird jedoch erst im abgedunkelten Raum unter UV-Licht vollends sichtbar (siehe Abb. 1) und kann nun auch zur Verifizierung / Falsifizierung des Vorkommens von DNA in der Lösung genutzt werden. Das Gel sollte zudem fotografiert werden, um die Ergebnisse festhalten zu können und spätere Rückschlüsse auf den unternommenen Versuch möglich zu machen.

8 -8- Abb.1: Gel bei Betrachtung unter UV-Licht (Musterbeispiel) 2.5 Fehleranalyse Eine gelelektrophoretische Auswertung der von der AG Sphagnum bearbeiteten Proben ergab, dass in den vorhergehenden Schritten ein Fehler unterlaufen sein muss, der einen derartigen Verlauf bewirkt hat und dieser nicht bei der Elektrophorese zu suchen ist. Eine Auswertung der Proben findet folglich im Rahmen einer Fehleranalyse statt. Auf ein ordnungsgemäßes Ablaufen der Elektrophorese Abb. 2: Nachweis der misslungenen DNA-Isolation kann man schließen, wenn man den Ladder à 100 bp (siehe Abb.2) betrachtet, welcher als einziger, verglichen mit den ihn umgebenden Proben, differenziert erscheint und eine Bandenbildung erkennen lässt, was de facto die Gelelektrophorese als Fehlerquelle ausschließt. Weiterhin ist erkennbar, das einige Proben überhaupt nicht durch das Gel gelaufen sind. Dies ist dadurch zu erklären, dass es bei ihnen schlichtweg zu Vergleichszwecken unterlassen wurde, den Restriktionsverdau durchzuführen, die Proben jedoch trotzdem Teil der gelelektrophoretischen Auswertung waren. Es entstehen somit Lücken zwischen den einzelnen Banden, die verdaute DNA enthalten, durch die DNA, die bedingt durch fehlenden Restriktionsverdau zu groß verblieben, um durch das Gel zu wandern. Eine mögliche Erklärung für die Undeutlichkeit der Banden, die nur schwerlich optisch sichtbar sind, ist die Tatsache, dass die RNase A während der DNA-Extraktion bei

9 -9- einigen Proben nicht hinzugegeben wurde, da sie beim benötigten Zeitpunkt nicht auffindbar war. Dies hätte bewirkt, dass die Proben durch die RNA kontaminiert gewesen wäre und somit natürlich anders auf die chemische Behandlung reagiert hätte, was eine Erklärung für die undeutlichen Banden liefert. Weiterhin muss in Betracht gezogen werden, dass die Lösung durch unsauberes Arbeiten anderweitig kontaminiert worden sein können. Dies kann zwar nicht durch einen konkreten Verdacht untermauert werden, jedoch spricht die misslungene DNA-Isolierung für eine solche Fehlerquelle. Auch eine möglicherweise zu geringe Menge an DNA in den Proben könnte verantwortlich gemacht werden. Dies wäre zumindest eine Erklärung für die nur sehr schwach erscheinenden Banden, die in Abbildung 2 erkennbar sind (ausgenommen der 100 bp Marker im Zentrum). 3. Weitergang der Kartierung mithilfe der PCR 3.1 Ziel der PCR Um die aus den vorherigen Schritten gewonnene DNA-Kartierungstechnisch nutzen zu können, ist deren Vermehrung und Amplifikation nötig. Dies geschieht im Verlauf der Polymerase Chain Reaktion, zu Deutsch Polymerase Kettenreaktion, welche spezifisch die benötigte DNA exponentiell und in kurzer Zeit vermehrt. Namensgebend ist der zyklische Verlauf von Denaturierung, Annealing und Elongation. Die replizierten DNA-Fragmente können, wenn richtig gewählt, ein bestimmtes genetisches Merkmal repräsentieren, was für eine Kartierung unserer Sphagnum-Proben von Nöten ist. Die PCR setzt nach der DNA- Extraktion an, die bereits zuvor durch Gelelektrophorese auf Qualität sowie Quantität der enthaltenen DNA überprüft worden sein sollte. Da nach BRUHN/SCHÄFER/FÖLSCH (2008: S.124) nur ein qualitativer Nachweis benötigt wird, wird die konventionelle PCR angewandt, deren Funktionsweise im Folgenden erklärt wird.

10 Benötigtes Material Um eine PCR durchführen zu können, werden einige Materialien benötigt, die hier aufgelistet und kurz erklärt werden: Aus Sphagnum isolierte DNA: Thermocycler: je 1 Primer für Anfangs- und Endsequenz: Taq-Polymerase: Mg 2+ -Ionen: Desoxy-Nucleotide (dntps): Pufferlösung 10x konzentriert: Reaktionsgefäße: wird auch als Template bezeichnet, und wurde während der DNA-Extraktion gewonnen Gerät, das die Templates einem vorgegebenen Muster folgend erwärmt und abkühlt Da die Primerauswahl eine sehr gewichtige Rolle in der PCR innehat, wird sie gesondert erörtert (siehe 3.3 Auswahl des Primers) Hitzeresistent; synthetisiert den DNA Strang vom 5 -Ende des Primers zum 3 -Ende mithilfe der dntps und den Mg 2+ -Ionen nach BRUHN/SCHÄFER/FÖLSCH (2008: S.126) komplexieren [sie] mit DNA und dntps, dem Substrat der Polymerase, was auf ihre Wichtigkeit bei der Elongation hinweist Sie sind die Substrate der Taq-Polymerase, bilden also den Werksstoff für die synthetisierte DNA und sind somit essentiell für die PCR dient dem Aufrechterhalten eines für die Taq-Polymerase geeigneten ph-werts möglich sind, für den im Schullabor verwendeten Eppendorf Mastercycler, 20- und 50 µl Reaktionsgefäße; sie sind speziell für den Einsatz in einem Thermocycler gefertigt worden 3.3 Auswahl des Primers Die sogenannten Forward- / Reverseprimer oder auch Sense- / Antisenseprimer lagern sich spezifisch am DNA-Strang an und dienen als Startpunkt für die Polymerase. Zuerst muss jedoch ein Primer gefunden werden, der hinsichtlich des Ziels der PCR ausgewählt wird. Es stellt sich somit die Frage, welcher sequenzspezifische Primer, den man auf einer Vielzahl an Webseiten (beispielsweise bestimmen lassen kann,

11 -11- verwendet wird. Seine Sequenzierung ist dabei entscheidend für die Temperatur während der Annealing-Phase. Diese Amplifikation des gewünschten Gens (siehe Abbildung 3) ist nur möglich, wenn die dafür benötigten Sequenzen die Primeranlagerung dementsprechend gestalten, dass sie die Polymeraseaktivität nur an den zu synthetisierenden Stellen ermöglichen. Bereits nach wenigen Zyklen wird die gewünschte Sequenz ohne Reste der umgebenden DNA repliziert. Die Möglichkeit des Random Primings kann nach näherer Betrachtung ausgeschlossen werden, da es die Bedingungen, die eine Genkartierung stellt, nicht erfüllt. Sie eignet sich nur, um unbekannte DNA unspezifisch bezüglich der Primersequenz als auch der entstehenden DNA zu replizieren. Doch um einen sequenzspezifischen Primer selektieren zu können, muss die Sequenz in Erfahrung gebracht werden. Hilfestellungen dafür bieten sogenannte Gendatenbanken, die sich aber für Sphagnum schwerer finden lassen als beispielsweise das menschliche Genom. Ist diese jedoch gefunden kann der Primer mithilfe der genannten Methoden ermittelt werden. Abb.3: Amplifikation eines bestimmten genetischen Merkmals 3.4 Ablauf der PCR Vorbereitung der Probe Die genannten Inhalte werden vermengt, wobei deren Zusammensetzung sehr variabel ist und die bestmögliche Zusammensetzung teilweise nur durch mehrere Versuche mit verschiedenen Ansätzen herauszufinden ist. BRUHN/SCHÄFER/FÖLSCH (2008: S. 125) versuchen eben diese Variablen bei ihren Angaben miteinzubeziehen und versuchen darauf beruhend eine allgemeine Zusammensetzung zu präsentieren:

12 -12- ( )0,1 500 ng DNA-Template, je 0,2-0,5 µm des Sense / Forward und Antisense / Reverseprimers ( ), µm dntps, einem spezifischen PCR-Puffer (in der Regel als 10- fach-konzentrat), 1-5 mm MgCl 2 und 1-5 U hitzestabiler Taq-Polymerase ( ). Diese Lösungen werden entweder in ein 0,2 ml oder 0,5 ml Reaktionsgefäß gegeben. Dieses wird zusammen mit anderen Proben, wenn vorhanden, in den Eppendorf Mastercycler gegeben. Nachdem der Thermocycler beladen wurde, kann der Heizdeckel geschlossen werden, der eine Ölschicht als Kondensationsschutz überflüssig macht. Nun kann das Gerät seine Arbeit aufnehmen Denaturierung Sind die Proben im Thermocycler verstaut, beginnt dieser mit seinem vorprogrammierten, dreiphasigen Zyklus. Die erste, als Denaturierung bezeichnete Phase, bewirkt das Auftrennen des DNA-Doppelstrangs, was durch eine Erhitzung auf 95 C (Fachbücher zeigen leichte Differenzen, die von 94 C 96 C variieren können) erreicht wird. Diese Auftrennung bietet Anlagerungsstellen für Primer, was wiederum Voraussetzung für das Annealing ist. MÜLHARDT (2003: S. 74) warnt vor den Folgen einer zu langen Denaturierung, denn es leiden alle Komponenten unter der Hitze ( ). Demzufolge ist eine fünf Sekunden dauernde Denaturierung bei geforderter Temperatur völlig ausreichend. Allerdings muss beachtet werden, dass der Thermocycler einige Sekunden benötigt, um diese Temperatur zu erreichen, diese Zeit also mit einberechnet werden muss. Abb.4: Schematische Darstellung der Denaturierung

13 Annealing (= Hybridisierung) In der Annealing-Phase ist vor allem die Temperatur entscheidend, da diese keinen fest definierten Wert hat. Sie wird durch die Zusammensetzung der Primer festgelegt, was eine Kenntnis der Sequenz der Primer voraussetzt. Darauf basierend lässt sich die Schmelztemperatur des Primers rechnerisch ermitteln. Dies kann anhand von moderner Software geschehen, beispielsweise auf der Internetseite oder auch mittels mathematischer Berechnungen. Als einfacheres Beispiel hierfür sei die WALLACE-Regel genannt, die sich besonders für kurze Primer (ca. 20 bp) eignet: T M = 2 (A + T) + 4 (G + C) Ist die Schmelztemperatur genauest möglich errechnet, so sollten von ihr nochmals 5 10 C subtrahiert werden, um zu gewährleisten dass die Primer an die definierte Sequenz binden, wie in Abbildung 5 gezeigt ist. Durch die Bindung der Primer an die DNA wird für die Polymerase eine Bindungsstelle und somit die Voraussetzungen für deren Aktivität geschaffen. Abb.5: Schematische Darstellung der Hybridisierung Elongation (= Polymerisierung) Die abschließende Phase, Elongation genannt, dient der Komplementierung des einsträngigen DNA-Fragments. Dabei setzt die Taq-Polymerase am Primer an und beginnt bei 72 C die DNA zu komplementieren. Die Synthese erfolgt in Richtung 5 -Ende des Primers über dessen 3 -Ende. In diesem Schritt werden auch insbesondere das Substrat dntp und die Mg 2+ -Ionen verwendet, die im Überfluss vorhanden sein sollten. Besonders gewichtig ist hier die Zeit, in der die Temperatur für die Polymerase günstig ist. Eine zu lange Erhaltung dieser Temperatur hätte das vermehrte Auftreten von Fehlern zur Folge, eine zu kurze Temperaturerhaltung

14 -14- würde frühzeitig die Polymeraseaktivität unterbrechen und somit unvollständige Syntheseprodukte hervorbringen. Abb.6: Schematische Darstellung der Polymerisierung Abschluss der PCR Ist die Polymerisation beendet, so wird die DNA erneut denaturiert, was zum einen eine weitere Polymerisation unterbindet und desweiteren den zyklischen Ablauf von neuem beginnen lässt. Ein Zyklus benötigt je nach Bedingungen 2 4 Minuten, für eine sinnvolle Menge an DNA-Amplifikaten sollten ca. 30 dieser Zyklen durchgeführt werden. Schon innerhalb dieser kurzen Zeit ist es möglich, eine beachtliche, millionenfache Anzahl an DNA Kopien zu erhalten Endgültige Kartierung Nach Beendigung stellt sich die Frage, wie die DNA, die nun isoliert und einer PCR ausgesetzt wurde, zur Sphagnum-Kartierung zu gebrauchen ist. Dazu müssen in erster Linie weitere molekularbiologische Techniken angewandt werden. Besonders das RFLP-Verfahren sowie die Sequenzierung sind für eine weitere Bearbeitung der Proben interessant und lassen DNA-Sequenzvergleiche der verschiedenen Sphagnum Arten und somit eine Kartierung zu, bei der schlussendlich genetische oder auch beispielsweise standortbedingte Unterschiede (beispielsweise durch Vergleich morphologisch identischer Sphagnum-Proben, die an verschiedenen Standorten gesammelt wurden) sowie Gemeinsamkeiten analysiert und ausgewertet werden können.

15 Literaturverzeichnis 4.1 Fachbücher BRUHN, Hans D.; SCHÄFER, Heiner UND FÖLSCH, Ulrich R.(2008): Labormedizin: Indikationen, Methodik und Laborwerte. Stuttgart: Schattauer GmbH. ISBN DAUMER, Karl (1995): Biologie für die gymnasiale Oberstufe. Genetik. 7., unveränderte Auflage. München: Bayerischer Schulbuch Verlag. ISBN EPPENDORF (2004): Mastercycler Personal. Bedienungsanleitung LINDER, Herrmann, Hrsg. Bayrhuber/Kull.(2005): Linder Biologie. 22., neubearbeitete Auflage. Braunschweig: Bildungshaus Schulbuchverlage Schroedel. ISBN MÜLHARDT, Cornel (2003): Der Experimentator. Molekularbiologie/Genomics. 4. Auflage. Heidelberg: Spektrum Akademischer Verlag. ISBN QIAGEN (2006): DNeasy Plant Handbook SCHMITT (O.J.): Einführung in die Grundarbeitstechniken der Molekularbiologie, Memmingen V-GENE (2004): Whole Blood Genomic DNA Mini-prep Kit. For PCR, Southern blot, RAPD, AFLP and RFLP, etc. 4.2 Internetquellen Davidson College, Department of Biology: Random Priming Technique. ( ) ROZEN, Steve und SKALETSKY, Helen J.: Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. ( )

16 Bildquellen Titelbild: Sphagnum Palustre. Foto: Walter Obermayer Abbildung 1: Beschriftetes Musterbeispiel für die Gelelektrophorese ( Abbildung 2: Abbildung 3: Selbsterstellte Gelelektrophorese Vereinfachte Darstellung der DNA-Amplifikation Abbildung 4,5 & 6: Schematische Darstellung von Denaturation, Hybridisierung und Polymerisierung

17 Anhang Gesamtübersicht: DNA- Extraktion Isolierung der DNA aus dem jeweiligen Sphagnum-Moos Reinigung der isolierten DNA Geschieht mithilfe eines Restriktionsenzyms Kürzt die DNA-Fragmente für die Gelelektrophorese Restriktionsverdau Gelelektrophorese Gel wird mit DNA beladen Bandenbildung dient der Überprüfung von Quantität & Qualität der Probe Polymerase Kettenreaktion Denaturierung Annealing Elongation

18 -18- Erklärung des Kollegiaten: Ich erkläre, dass ich die Facharbeit ohne fremde Hilfe angefertigt und nur die im Literaturverzeichnis angeführten Quellen und Hilfsmittel benützt habe. Benningen, den (Unterschrift des Kollegiaten)