WISSENSCHAFTLICHE ÜBERSICHT & PRÄSENTATION DRC Group welches die Synthese des Antigens K88 kontrolliert, nicht nur für den Anstieg der Adhäsion der Mikroorganismen an dem Bürstensaum der Enterozyten, sondern ebenfalls für die Virulenz des experimentell veränderten Stammes verantwortlich ist. Die Adhäsion von E.coli am Epithel der Harnwege führt, zusätzlich zu der mechanischen Fixation der Mikroorganismen in einer neuen ökologischen Nische, zu metabolischen Veränderungen, die mit neuen Konditionen gleichzusetzen sind. Zusätzlich zu den metabolischen Veränderungen führen der mechanische Kontakt und die Adhäsion der P- Fasern an den Epithelzellen zu Veränderungen in dem Konstruktionsprozess neuer Fasern (sie werden kürzer) und stimulieren die Ausbildung einiger Gene von E.coli Virulenz (PAP-Komplex und Hämolysin). Die molekularen Mechanismen der bakteriellen Adhäsion sind bei pathogenen und symbiotischen Spezies unspezifisch, was durch das Beispiel der mikrobiellen Flora der oberen Atemwege, des unteren Verdauungstraktes und Urogenitaltraktes bewiesen wird. Die Grundlage für die Interaktion jeglicher biologischer Systeme und für interzelluläre Kommunikation ist die Liganden-Rezeptoren-Erkennung. Ein Ligand ist der (nach Größe und Molekularmasse) kleinste Teilnehmer von z.b. Oberflächenstrukturen von Bakterienzellen. Der Rezeptor ist der größere Komplementärpartner von z.b. Adhäsionsstellen auf Zellmembranen eukaryotischer Zellen. Liganden und Rezeptoren werden vertreten von Polymeren glycolipidischer oder glycoproteinischer Natur, die aus mehreren Kopien unikaler Subeinheiten bestehen und den Tropismus der unterschiedlichen Pathogene in Bezug auf ihre Zielzellen definieren. Letzteres trägt zu einer bakteriellen Kolonisierung im Wirtsgewebe bei, wo die Rezeptorenkonzentration höher ist. In vivo wird der Adhäsionsprozess stark durch gelöste Komponenten biologischer Flüssigkeiten und Sekrete beeinflusst, die dieselbe chemische Struktur wie die Zellrezeptoren haben. Die Pathogene kontaktieren diese Komponenten noch vor den Zielzellen. Orksov und Birch-Anderson (1980) zeigten, dass E.coli sich noch vor dem oralen Epithel an das Mucin im Speichel bindet. Orale Streptokokken (Streptococcus sanguis, S.mitis, S.salivarius) sind in der Lage die Proteinkomponenten des Speichels zu absorbieren. In dieser Untersuchung konnte gezeigt werden, dass diese Adhäsion durch das proteolytische Enzym Tripsin zerstört werden kann. Die Charakteristika der Adhäsion als multifaktorischer Prozess hängen von verschiedenen Eigenschaften der Bakterien und des Wirtes ab. Es ist bekannt, dass die adhäsiven Charakteristika der Mikroorganismen stark von der Spezies beeinflusst werden. Zum Beispiel kann der Streptococcus mutans nicht an die Epitheliozyten von Zunge und Wange anbinden, doch dafür irreversibel an die Zahnoberfläche. Arbuthnott und Smith (1979) führten an, dass die Adhäsivität von Sp.pyogenes an das orale Epithel 6 Mal stärker ist, als die von E.coli. Die direkte Verbindung der Hydrophobie einer Zelloberfläche und ihrer Adhäsivität wird von einer Vielzahl von Bakterien bewiesen. Zum Beispiel ist St.aureus von suppurativen Flächen hydrophober als St.aureus aus der Umwelt, den www.rocs.de 73
DRC Group WISSENSCHAFTLICHE ÜBERSICHT & PRÄSENTATION Nasenhöhlen oder der Hautoberfläche. Zu den Faktoren, die die adhäsiven Eigenschaften der Wirtszellen und Geweben beeinflussen, gehört auch der individuelle Parameter des Patienten: hohe Kolonisierungsdichte von Str. pyogenes eines an entzündlichen Erkrankungen leidenden Subjektes, geringe Anzahl von Bakterienträgern und fast vollständiges Fehlen bei gesunden Individuen. Die Adhäsion der Mikroorganismen an verschiedenen Stellen des Wirtsorganismus ist unterschiedlich. Betrachtet man Str.salivarius und Str.aureus, so hat die untere Fläche der Zunge die größte Anzahl an Rezeptoren und ist die bevorzugte Nische für einen Befall. Die Variabilität des Rezeptor- Apparates der Epitheliozyten kann sich je nach Heterogenität der Zellzüge verändern. Diese Heterogenität wird durch die physiologischen Veränderungen der oberflächlichen Zellstrukturen während der Differenzierung oder Alterung bestimmt. Pathologische Veränderungen der Wirtsgewebe erschaffen zusätzlich Bedingungen, die die Adhäsion von Bakterien begünstigen. Die Untersuchung der molekularen Eigenschaften von Ligand-Rezeptor-Komplexen, die während der Interaktion von Bakterien mit den entsprechenden Zielzellen entstanden sind, sowie die Untersuchung der Faktoren, die den adhäsiven Prozess in vivo und in vitro beeinflussen, erlauben es uns, präventive Maßnahmen zu entwickeln, die auf die früheren Stadien des Infektionsprozesses abzielen. Die Suche nach antiadhäsiven Wirkstoffen basiert auf der Entwicklung effektiver Blockaden oder Hürden (mit unterschiedlichen Funktionsmechanismen), die einen Einfluss auf die Ligand-Rezeptor-Interaktion ausüben könnten. Einer der bestbekannten Mechanismen bei der Suche nach Adhäsionsinhibitoren ist die Zugabe löslicher Substanzen in das System Bakterie eukaryotische Zelle; diese Substanzen können mit den Liganden der Rezeptoren um die Adhäsionsstellen der Zelloberfläche wetteifern. Somit können alle löslichen Substanzen theoretisch in zwei Gruppen unterteilt werden: fähig zur Interaktion mit bakteriellen oder mit eukaryotischen Zellen. Die selektive Adhäsion an bakterielle Liganden wird wegen dem geringeren Einfluss auf die Rezeptoren der Zielzellen und damit auch auf die unterschiedlichen Prozesse im Wirtsgewebe bevorzugt. Heute existieren zahlreiche Beweise dafür, dass der Gebrauch natürlicher oder synthetischer Zellrezeptoren die Adhäsion von Mikroorganismen an Wirtszellen deutlich verringern oder sogar verhindern kann. Die Interaktion der mikrobiellen Liganden mit Proteinen und Glykoproteinen von Blut (Immunoglobulin A und G, p2-mikroglobulin, Fibrinogen, Fibronectin, Albumin, Transferrin u.a.), Urin (TH-Protein), Speichel (Mucin, Agglutinin) konnte nachgewiesen werden. Diese Tatsache ermöglichte in vielen Versuchen, darunter auch in klinischen, den Einsatz der Mehrzahl der aufgezählten Mischungen als Inhibitoren bakterieller Adhäsion. Somit verfügen wir heute über Informationen zu der antiadhäsiven Wirkung exogener proteolytischer Enzyme. Die Wirkung der Enzyme beschränkt sich nicht auf die Veränderung des Adhäsionscharakters zwischen Mikroorganismen und Zielzellen, sondern führt ebenfalls zur Zerstörung bereits bestehender Kolonien. Un- 74 www.rocs.de
D R C W I S S E N S C H A F T L I C H E Ü B E R S I C H T & P R Ä S E N TAT I O N G ro u p terschiedliche Enzyme zeigen unterschiedlich starke Wirksamkeit. Die Ergebnisse der analytischen Untersuchungen zeigen die Spezifität der benannten Wirkung. konventionellen Nummern markiert: 56 (ROCS) und 57 (Kontrollprodukt). Test-Kulturen und Mikroorganismen. Klinische Stämme von Mikroorganismen, isoliert aus den Mundhöhlen von Freiwilligen: Staphylococcus aureus 20, Das Ziel der Untersuchung ist die Bewertung der Wirkung der Zahncreme mit Bromelin auf die Adhäsion der oralen Bakterien beim Menschen. Streptococcus salivarius 67, Streptococcus sanguis 12, Streptococcus sobrinius 83. Zellkultur muskulokutaner Fibroblasten eines menschlichen Embryos. Material und Methoden Material. Das Versuchsprodukt war das ROCS mit Bromelin. Equipment. Bakteriologische Analysatoren: IEMS-Photometer (LabSystems, Finnland), BBL Crystal (Becton Dickenson, USA); Abbildungssystem Video-TEST-Morphology (Deutschland). Kontrollprobe: mit identischer Zusammensetzung aber ohne Bromelin Die Untersuchung wurde als Blindstudie durchgeführt. Die untersuchten Produkte wurden mit Methoden: mikrobiologische, morphologi- Abbildung 1. Zellen Kontrollprobe Abbildung 3. Zellen + Str.salivarius 67 + 56 (1:20000), Exposition für 2 Stunden Abbildung 2. Zellen + Str.salivarius 67 Abbildung 4. Zellen + Str.salivarius 67 + 56 (1:20000), Exposition für 3 Minuten www.rocs.de 75
DRC Group WISSENSCHAFTLICHE ÜBERSICHT & PRÄSENTATION sche. Alle Messungen sind dreimal wiederholt worden. Phase 1 Die puren Kulturen des Staphylococcus aureus 20, Streptococcus salivarius 67, Streptococcus sanguis 12, Streptococcus sobrinius 83 sind mittels direkter Inokulation aus den Mundhöhlen von Freiwilligen auf 5% Blutagar gewonnen worden. Die extrahierten Stämme wurden mit Hilfe der aufgelisteten bakteriologischen Analysatoren identifiziert. Phase 2 Die antiadhäsive Wirkung der untersuchten Zahncremes ist auf der Zellkultur (CC) der muskulokutanen Fibroblasten eines menschlichen Embryos getestet worden. Die Fibroblasten wurden nach der Methode von Grabovskaya & Totolyan (1977) auf Glasstreifen in Leighton Gewebekulturröhrchen gezüchtet (Igl Nährboden, 24 Stunden, 370C) bis zur Bildung einer konfluenten Molekularschicht. Danach ist der Nährboden entfernt worden und 1,8 ml der untersuchten Zahncremes samt 0,2 ml der 24-Stunden Kulturen des jeweiligen Test-Stammes (108 CFU/ml) beigegeben. Die Mixturen wurden 2 Stunden lang bei 370C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen der Molekularschicht von den nicht anhaftenden Untersuchtes Objekt Adhäsions-Index Adhäsionsintensität der bakteriellen Teststämme Prozentteil geschädigter Zellen Mikrobielle Belastung Adhäsionsprozent im Vergleich zur Kontrollprobe Kontrollprobe Zellkultur (CC) + Bakterien 8 9 10 7 25 30 29 27 200 270 290 189 100 100 100 100 Versuch 56 57 6 7 8 5 24 26 27 26 144 182 216 130 72 70 74 69 7 8 9 6 24 28 28 26 168 224 252 156 84 83 87 83 Tabelle 1. Adhäsive Wirkung der Teststämme bei Zugabe der untersuchten 56 (ROCS) und 57 (Kontrollprobe); Expositionszeit 2 Stunden 76 www.rocs.de
WISSENSCHAFTLICHE ÜBERSICHT & PRÄSENTATION DRC Group Bakterien durch häufige Veränderungen des Nährbodens befreit. Sie wurden mit 96% Ethanol fixiert, mittels Giemsa-Färbung eingefärbt und mikroskopisch untersucht. Die Bewertung des Adhäsionsrückganges der Teststämme wurde nach 1:20000-facher Auflösung jeder Paste mit Zusatz von Humanserum durchgeführt. Die Intensität des adhäsiven Prozesses ist nach den folgenden Parametern bewertet worden: 1) Adhäsionsindex (IA) als durchschnittliche Anzahl von Bakterienzellen auf einer eukaryotischen Zelle; 2) Prozentsatz der beschädigten Zellen des Molekularfilms (PC%); 3) Kontaminierung von 100 Zellen des Molekularfilms bzw. bakterielle Belastung (BL), ermittelt als BL=IAxPC%. Der Adhäsionsgrad jeder Spezies wird nach der bakteriellen Belastung im Vergleich zur Kontrollprobe (100%) definiert. Der Versuch wurde mit 2 Expositionszeiten durchgeführt: 2 Stunden und 3 Minuten, mit einer Zahncremekonzentration von 1:20000, die die Molekularschicht nahezu unverletzt lässt (Abbildungen 1 4). Die Tabelle 1 zeigt anschaulich, dass die 56 und 57 bei einer Expositionszeit von 2 Stunden die Adhäsion der Teststämme nicht stark genug verringert haben. Folgender Prozentsatz konnte bei der Adhäsionsverringerung ermittelt werden: Untersuchtes Objekt Adhäsions-Index Adhäsionsintensität der bakteriellen Teststämme Prozentteil geschädigter Zellen Mikrobielle Belastung Adhäsionsprozent im Vergleich zur Kontrollprobe Kontrollprobe Zellkultur (CC) + Bakterien 8 9 10 7 25 30 29 27 200 270 290 189 100 100 100 100 Versuch 56 57 4 3 2 2 10 18 25 20 40 54 50 40 20 20 17 17 5 4 3 3 12 20 27 21 60 80 81 63 30 30 28 33 Tabelle 2. Adhäsive Wirkung der Teststämme bei Zugabe der untersuchten 56 (ROCS) und 57 (Kontrollprobe); Expositionszeit 3 Minuten www.rocs.de 77