3D NMR Experimente Pulssequenz des 3D 15N-NOESY-SQC 1) Zum Beispiel sinnvoll, wenn sich viele Signale in einem 2D Spektrum, z.b. einem 1-1 NOESY oder TOCSY überlagern. 2) Kombination mit einem anderen 2D Experiment, z.b. einem 1-15NSQC oder einem 1-13C-MQC -> 13C-Entkopplung (wenn 15N und 13C markiert) z. B. 15N-SQC + NOESY -> 3D 15N-NOESY-SQC -> nur NOEs von Protonen, die direkt an ein 15N-gebunden sind zu räumlich nahen Protonen 15N- 1 c.s. NOE 1->15N Evolution via 1J 15N c.s. Evolution 15N->1 via 1J & mehr Detektion von 1 unter 15NEntkopplung Gz - Gradientenpulse -> Selektion von Kohärenzen, Unterdrückung von Lösungsmittelsignale oder von Störsignale aufgrund imperfekter 180 Pulse PP von:http://triton.iqfr.csic.es/guide/enmr/enmr3dhet/nohsqc3d.html 3D 15N-NOESY-SQC eines Proteins Das 3D NCA Experiment zur sequentiellen Zuordnung der Proteinsignale - ein Tripelresonanzexperiment F1:1 F2: 15N F3:1 Projektion von F1 auf F2/F3 Ebene! wie 2D 1-15N-SQC Projektion von F2 auf F1/F3 Ebene! wie Amidbereich von 2D 1-1-NOESY Von: http://www.bioc.rice.edu/~mev/spectra3.html Evolution der chemischen Verschiebung Magnetisierungstransfer Aus F. Lottspeich/. Zorbas!Bioanalytik" und J. Cavanagh und andere!protein NMR Spectroscopy"
Weitere NMR-Experimente für die Zuordnung der chemischen Verschiebungen in 15N- und 13C- makierten Proteinen Residual dipolar couplings (RDCs) - Normalerweise direkte dipolare Kopplung in Lösung aufgrund von isotroper Molekülbewegung ausgemittelt - Wenn in!orientierendem" Medium - eingeschränkte Beweglichkeit in eine Raumrichtung -> anisotrope Bewegung in anisotropem Medium Einschränkung der Beweglichkeit durch Messen der Probe in einem komprimierten Polyacrylamidgel Anfertigung einer Gelprobe einer gelösten Substanz squeeze - Messung von RDCs möglich -> Information über die Orientierung von Bindungsvektoren relativ zum Magnetfeldvektor (bzw. Alignmenttensor) Getrocknetes Gel Zugabe von Substanzlösung & Schwellvorgang Kompression mit Stempelinlet
Bestimmung von RDCs von Peptiden der Sequenz EGAAXAASS Anwendung von RDCs für die Strukturaufklärung in der OC 1) Messung isotrope Probe (Referenz) -> Aufspaltung = 1JN- 2) Messung der anisotropen Probe -> Aufspaltung = 1JN- + 1DN- 1)-2) ergibt 1DN- z.b. 1-15N-SQC ohne 15N-Entkopplung während Aufnahme, auch basierend auf natürlicher Isotopenhäufigkeit möglich X = I G W I G Zum Beispiel: Arbeiten der Arbeitsgruppe Thiele an TU Darmstadt 1) C. M. Thiele, Use of RDCs in Rigid Organic Compounds and Some Practical Considerations concerning Alignment Media, Conc. Magn. Res. 2007, 30A, 6580. 2) C. M. Thiele, Residual Dipolar Couplings (RDCs) in Organic Structure Determination, Eur. J. Org. Chem. 2008, 5673-5685. 3) B. Böttcher, C. M. Thiele, Determining the Stereochemistry of Molecules from Residual Dipolar Couplings (RDCs), in Encyclopedia of Magnetic Resonance, (published by R. K. arris, R. E. Wasylishen), John Wiley, Chichester, 2012. 4) R. Berger, J. Courtieu, R. R. Gil, C. Griesinger, M. Köck, P. Lesot, B. Luy, D. Merlet, A. Navarro-Vázquez, M. Reggelin, U. M. Reinscheid, C. M. Thiele, M. Zweckstetter, Is Enantiomer Assignment Possible by NMR Spectroscopy Using Residual Dipolar Couplings from Chiral Nonracemic Alignment Media? A Critical Assessment, Angew. Chem. 2012, 124, 8512 8515, Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 8388 8391. W S. A. Dames et al. J. Am. Chem. Soc., 128(41), 13508-14 (2006) Zusammenfassung1: Magnetisierungstransfer bzw. Korrelation von einem Kern mit benachbarten Kernen in einem Protein Skalare bzw. J-Kopplung - via Bindungselektronen -> Bestimmung der chemischen Verschiebungen einzelener Kernen und welche Kerne über chemische Bindungen verknüpft sind Dipolare Kopplung - durch den Raum zwischen Kernen, die sich räumlich nahe sind über NOE-Effekt -> z.b. zur Gewinnung struktureller Informationen in Form von interatomaren Distanzen (NOESY) R Zusammenfassung 2: Strukturinformationen aus NMR-Daten Distanzen (NOEs) Dihedrale Winkel (3J) Wasserstoffbrücken (3J, EX) Ionisierungskonstante -COO -COO- + + Dynamik N C" C N " O Orientierung von Bindungsvektoren (RDCs) Diffusionskonstanten RDCs Dissoziationskonstanten
Anhang: Atomkerne können eine magnetisches Moment haben Auf den folgenden Seiten sind einige ergänzende Informationen zur 1. Stunden und dem letzten Teil der Vorlesung Resonanz- bzw. Larmorfrequenz Für Kerne mit Spin 1/2, z.b. 1, 15 N, 13 C, 31 P Magnetfeld B 0 Aufbau eines Kernspinresonanzspektrometers Isotopenmarkierung Temperierbarer Probenkopf Für Kerne mit Spin 1/2, z.b. 1, 15 N, 13 C, 31 P Supraleitender Magnet Computer zur Steuerung und Datensicherung Elektronik (Temperaturkontrolle, Freqzenzsynthesizer, A- D Konverter, Verstärker) Zu gering -> Ausweg: Isotopenmarkierung Zum Beispiel durch Produktion des gewünschten Proteins in gentechnisch veränderten Bakterienzellen (Escherichia coli) -> einzige Stickstoffquelle 15 N-Ammoniumchlorid -> einzige Kohlenstoffquelle 13 C-Glucose
Erzeugung detektierbarer Magnetisierung Das 2D 1-15 N- SQC experiment - der Fingerabdruck eines Proteins R 1 J(N, N ) N C " C N " O 1/ 2 x 1 J(N, N ) 1D 1 Spektrum eines Proteins Detektion der 1 Kerne Entwicklung des chemischen Verschiebungen der 15 N Kerne (= Evolution) Transfer von Magnetisierung von 1 zu direkt gebundenem 15 N bzw. umgekehrt (= Mischzeit) Generierung von detekierbarer Protonenmagnetisierung (= Präparation)