Querschnittsbereich IV Immunologie/Infektiologie 8. Juli 2005 Immundiagnostik PD Dr. Ulrich Sack Institut für Klinische Immunologie und Transfusionsmedizin 08.07.2005 1
Abschlussklausur Wichtig: Am 12. Juli In der Woche vom 10. bis 14. Oktober findet hier im HS OKL die Leistungsüberprüfung statt (Multiple Choice, Fragen entsprechend Hinweisen der Dozenten) 08.07.2005 2
Immundiagnostik Autoantikörpernachweis Proteinanalytik Allergiediagnostik Immunphänotypisierung Immunfunktionstestung Immungenetik 08.07.2005 3
Immundiagnostik Autoantikörpernachweis Proteinanalytik Allergiediagnostik Immunphänotypisierung Immunfunktionstestung Immungenetik 08.07.2005 4
Rheumatoid-Arthritis RF, CCP, CRP ANA Screen (Differenzierung hier meist nicht erforderlich) COMP HLA-DR4: Prognose C1q-Ak (bei Verdacht auf Felty-Syndrom) Kryoglobuline & Immunfixation bei VD Vaskulitis Keine Indikation zur Bestimmung von RA33, Laktoferrin, Kollagen-Typ-II-AK 08.07.2005 5
Autoantikörpernachweis Immunfluoreszenz Titer + wahrsch. Spezifität ELISA Immunoblot Stufendiagnostik: Charakterisierung von Feinspezifitäten schließt immer Screening ein. 08.07.2005 6
Immunfluoreszenz (HEp-2) 08.07.2005 7
Enzyme linked immuno sorbent assay (ELISA) Weit verbreitetes und hochempfindliches Nachweisverfahren Verschiedene Enzyme: z.b. Peroxidase, alkalische Phosphatase Verschiedene Substrate: z.b. chromogene oder fluorogene Substrate Sandwich- oder capture assay : Antikörper 1 an fester Phase + Patientenserum + Antikörper 2* (enthält Antigen) Hierfür müssen sorgfältig abgestimmte monoklonale Antikörper ausgewählt werden, die verschiedene Epitope des gleichen Antigens erkennen. 08.07.2005 8
CCP-Antikörper synonym: APF, Citrullin-, Keratin-, Filaggrinantikörper gerichtet gegen citrulline containing peptides Zielepitop: deiminierte Formen der Pro-Filaggrine, posttranslational aus Arginin gebildet; bei RA z. B. im Fibrin Spezifität: bis zu 99 % Sensitivität: über 80 % Auch bei 22-54 % der RF-negativen RA wahrscheinlich präklinischer Frühmarker prognostisch Höhe mit Aktivität gekoppelt 08.07.2005 9
APF Antiperinukl. Factor AKA Antikeratin Antikörper Nienhuis RLF et al., Ann Rheum Dis, 1964 Young BJJ et al., Br Med J, 1979 08.07.2005 10
CCP-Antikörper synonym: APF, Citrullin-, Keratin-, Filaggrinantikörper gerichtet gegen citrulline containing peptides Zielepitop: deiminierte Formen der Pro-Filaggrine, posttranslational aus Arginin gebildet; bei RA z. B. im Fibrin Spezifität: bis zu 99 % Sensitivität: über 80 % Auch bei 22-54 % der RF-negativen RA wahrscheinlich präklinischer Frühmarker prognostisch Höhe mit Aktivität gekoppelt 08.07.2005 11
Deiminierung von Arginin H O H O N N peptidylarginine deiminase (PAD) NH Ca 2+ NH H 2 N+ NH 2 O NH 2 L-arginine residue (+ charged) L-citrulline residue (neutral) 08.07.2005 12
CCP-Antikörper synonym: APF, Citrullin-, Keratin-, Filaggrinantikörper gerichtet gegen citrulline containing peptides Zielepitop: deiminierte Formen der Pro-Filaggrine, posttranslational aus Arginin gebildet; bei RA z. B. im Fibrin Spezifität: bis zu 99 % Sensitivität: über 80 % Auch bei 22-54 % der RF-negativen RA wahrscheinlich präklinischer Frühmarker prognostisch Höhe mit Aktivität gekoppelt 08.07.2005 13
CCP als RA-Frühindikator 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% CCP-2 positive 0% 10 8 6 4 2 0 years before first symptoms Rantapäa et al. 2003 08.07.2005 14
Rheumatoid-Arthritis RF, CCP, CRP ANA Screen (Differenzierung hier meist nicht erforderlich) COMP HLA-DR4: Prognose C1q-Ak (bei Verdacht auf Felty-Syndrom) Kryoglobuline & Immunfixation bei VD Vaskulitis Keine Indikation zur Bestimmung von RA33, Laktoferrin, Kollagen-Typ-II-AK 08.07.2005 15
ANA-Positivität Autoimmundiagnostik nach konkreten Fragestellungen 50% Nichtrheumatische Erkrankungen 50% Rheumatische Erkrankungen 26% Rheumatoid-Arthritis 11% SLE 7% MCTD 6% Primäres Raynaud-Syndrom Auch infektiös bedingt möglich! 08.07.2005 16
Immundiagnostik Autoantikörpernachweis Proteinanalytik Allergiediagnostik Immunphänotypisierung Immunfunktionstestung Immungenetik 08.07.2005 17
Rheumatoid-Arthritis RF, CCP, CRP ANA Screen (Differenzierung hier meist nicht erforderlich) COMP HLA-DR4: Prognose C1q-Ak (bei Verdacht auf Felty-Syndrom) Kryoglobuline & Immunfixation bei VD Vaskulitis Keine Indikation zur Bestimmung von RA33, Laktoferrin, Kollagen-Typ-II-AK 08.07.2005 18
COMP COMP (Cartilage Oligomeric Matrix Protein) nichtkollagenes Protein der Gelenkknorpelmatrix Pentamer aus identischen, durch Disulfidbrücken verbundenen Molekülkomponenten größter Teil befindet sich in Knorpeln COMP Arthritis Score 08.07.2005 19
Immundiagnostik Autoantikörpernachweis Proteinanalytik Allergiediagnostik: Vorlesung Professor Metzner Immunphänotypisierung Immunfunktionstestung Immungenetik 08.07.2005 20
Immundiagnostik Autoantikörpernachweis Proteinanalytik Allergiediagnostik Immunphänotypisierung Immunfunktionstestung Immungenetik 08.07.2005 21
Nachweis von zellulären Antigenen 1. Direkte und indirekte Immunfluoreszenz Die zum Nachweis verwendeten Antikörper werden mit Farbstoffen (Flurochromen) markiert, die im unsichtbaren Spektralbereich (meist UV) absorbieren und längerwelliges Licht ermittieren. Die Auswertung erfolgt in der Immunhistologie und Immunzytologie im Fluoreszenz-Mikroskop oder maschinell mit der Durchflusszytometrie. 08.07.2005 22
Nachweis von zellulären Antigenen 2. Durchflusszytometrie Mit der fluoreszenzaktivierten Durchflusszytometrie werden Moleküle im Inneren oder auf Zellen nachgewiesen. Die Messung erfolgt maschinell an einem Strom von Einzelzellen. 08.07.2005 23
Immundiagnostik Autoantikörpernachweis Proteinanalytik Allergiediagnostik Immunphänotypisierung Immunfunktionstestung Immungenetik 08.07.2005 24
Expositionstests 1. Hauttest 08.07.2005 25
Messung von Lymphozytenfunktionen 1. Proliferation (LTT) Die DNS-Syntheserate wird häufig verwendet, um ein Maß für die Teilungsaktivität (Proliferation) von stimulierten Lymphozyten zu erhalten. Hierzu wird radioaktives markiertes [ 3 H]-Thymidin eingesetzt. Die Stimulation kann unspezifisch durch Mitogene (2-3d) oder spezifisch durch Antigen erfolgen (7d). Auch Zellen können als Antigen in der Lymphozytenmischkultur (mixed lymphocyte culture) eingesetzt werden. (siehe HLA-Typisierung). Bei der sogenannten Einwegstimulation wird eine der Zellpopulationen (Stimulatoren) durch Bestrahlung oder Antimetabolite blockiert, damit nur die Proliferation 08.07.2005 der Responder gemessen wird. 26
Messung von Lymphozytenfunktionen 2. Zytotoxizität Um das Potential zur Bildung zytotoxischer T-Lymphozyten (CTL) zu erfassen, wird zunächst eine MLC durchgeführt. Im zweiten Schritt werden die Responder (Effektor)-Zellen mit [ 51 Cr]-markierten Zielzellen in Kontakt gebracht, die den gleichen HLA-Phänotyp wie die Stimulatoren aufweisen. Endlich wird das freigesetzte Chrom durch Radioaktivitätsmessung bestimmt. Effektorzellen Zielzellen 51 Cr Messung des 51 Cr im Überstand Markierung der Zielzellen mit Na 2 51 CrO 4 Zugabe von cytotoxischen T- Zellen zu markierten Zielzellen Abgetötete Zellen setzen radioaktives Chrom frei 08.07.2005 27
Messung von Lymphozytenfunktionen 3. ELISPOT-Test Enzyme linked Immuno Sorbent (Assay) E L I SPOT = Punkt, Fleck Nachweis von B-Zellen, die Antikörper produzieren Nachweis von T-Zellen, die Zytokine produzieren Zellzahl bekannt Häufigkeit eines Ereignisses bestimmt Mit Antigen beschichtet Zugabe von Anti-Ig-Antikörpern, die Nachweisenzym tragen Mit Anti-Zytokinantikörpern beschichtet Zugabe von Anti-Zytokin-Antikörpern, die Nachweisenzym tragen Mit dem ELISPOT-Test können einzelne Zugabe von Chromogen B-Zellen, die spezifische Antikörper produzieren, oder individuelle T-Zellen, die bestimmte Zytokine sezernieren, nachgewiesen werden. Das Sekretionsprodukt wird im Umkreis der Zelle als mikroskopisch kleiner Fleck (spot) 08.07.2005 nachgewiesen. 28 Zugabe von Chromogen
Messung von Phagozytenfunktionen 1. Chemotaxis und Phagozytose Chemotaxis ist die Fähigkeit von Zellen zur Wanderung in Richtung auf einen chemotaktischen Reiz. Im Test werden die Zellen (z.b. Granulozyten) einem Konzentrationsgradienten ausgesetzt und ihre Wanderungsstrecke wird qualitativ oder quantitativ bestimmt. Zur Messung der Phagozytose werden markierte Partikel oder Bakterien eingesetzt. Die Aufnahmekapazität für die Partikel ist proportional der Phagozytoseaktivität. Boyden-Kammer Zellen Filter Chemotaktisches Agens Migrationstest unter Agarose Chemotaktisches Agens Zellen b a 08.07.2005 29
Messung von Phagozytenfunktionen 2. Metabolische Aktivitäten und Bakterizidie Keimabtötung kann direkt bestimmt werden, indem lebende Keime mit Zellen inkubiert werden. Anschließend wird die Zahl vermehrungsfähiger Keime ermittelt. Indirekte Methoden erfassen metabolische Aktivitäten mit bakterizidem Potential. Nach der Aufnahme des Mikroorganismus setzt eine Kette von Abtötungsmechanismen ein: Sauerstoff - abhängige Mechanismen O 2 wird zu Superoxidanion reduziert. Dieses und weitere Sauerstoffradikale wirken bakterizid. Unter Einwirkung von Myeloperoxidase entstehen weitere toxische Oxidationsprodukte. Daneben kommt es auch zur Bildung toxischer Stickoxide. Sauerstoff - unabhängie Mechanismen Kationische Proteine (Defensine) aus neutrophilen Ganulozyten haben antibiotikaähnliche Wirkung. Lactoferrin bindet Eisen und entzieht es den Bakterien. 08.07.2005 30
Immundiagnostik Autoantikörpernachweis Proteinanalytik Allergiediagnostik Immunphänotypisierung Immunfunktionstestung Immungenetik 08.07.2005 31
Immungenetik Risikomarker zum Teil diagnostisch nutzbar: shared Epitope (RA); HLA-DR4 HLA-B27 (Mb. Bechterew) PADI4? (RA, Citrullinierung) Nachweis von angeborenen Immundefekten (Humangenetik) Nachweis molekularbiologisch oder phänotypisch (Durchflusszytometrie) 08.07.2005 32
Abschlussklausur Wichtig: Am 12. Juli In der Woche vom 10. bis 14. Oktober findet hier im HS OKL die Leistungsüberprüfung statt (Multiple Choice, Fragen entsprechend Hinweisen der Dozenten) 08.07.2005 33