Neue Wege mit Enzymen gerhard.kern@univie.ac.at brigitte.koliander@univie.ac.at http://aeccc.univie.ac.at 70. Fortbildungswoche des Vereins zur Förderung des physikalischen und chemischen Unterrichts - 25. Feb. 2016 - Wien 1
Ohne Enzym geht gar nichts. Oder fast nichts. Zumindest in Lebewesen. 2
Überblick Grundlegendes zu Enzymen Verankerung in den Lehrplänen Aktuelle Forschung - Ein Beispiel: Kopplung von Enzymen 3
Enzyme Katalysatoren in lebenden Organismen, aber auch außerhalb von Zellen wirksam (Buchner 1897: Zellfreie Gärung) Katalysatoren ermöglichen Reaktionswege mit geringerer Aktivierungsenergie 4
(Quelle: https://de.wikipedia.org/wiki/aktivierungsenergie [19.03.2016]) Katalysatoren ermöglichen Reaktionswege mit geringerer Aktivierungsenergie 5
Katalysatoren ermöglichen Reaktionswege mit geringerer Aktivierungsenergie und können dadurch - exergone Reaktionen in Gang setzen - Reaktionen beschleunigen (Einstellung des Gleichgewichtszustandes) - Reaktionen gegenüber Konkurrenzreaktionen bevorzugen 6
Katalyse von 2 CO + O 2 CO 2 an Pt Nach: Ertl 2008, S. 3585 7
Enzym-Substrat-Komplex Nach: Alberts et al. 1986, S 137. Quelle: Ertl 2008, S. 3585, Abb. 14 8
Struktur von Enzymen Primärstruktur: Reihenfolge der Aminosäuren Quelle: Resch 2015. Biokatalyse. Vortrag Graz. 9
Struktur von Enzymen Sekundärstruktur: a-helix, b-faltblatt Nach: Mortimer 2010, S 622 und Karlson 1984, S 39 f. 10
Struktur von Enzymen Sekundärstruktur: a-helix, b-faltblatt Quelle: Resch 2015. Biokatalyse. Vortrag Graz. 11
Struktur von Enzymen Tertiärstruktur, z. B. a-amylase Quelle: https://de.wikipedia.org/wiki/amylasen#/media/file:salivary_alphaamylase_1smd.png 12
Schlüssel-Schloss-Prinzip Fischer 1894 Quelle: Resch 2015. Biokatalyse. Vortrag Graz. 13
Induced fit model Koshland 1958 Quelle: Resch 2015. Biokatalyse. Vortrag Graz. 14
Einteilung der Enzyme EC 1 Oxidoreduktasen (Redoxreaktionen), zb Lactat-Dehydrogenase, Glucose-Oxidase EC 2 Transferasen (Gruppenübertragungen), zb Alanin-Transaminase, Hexokinase EC 3 Hydrolasen (hydrolyt. Spaltungen), zb Peptidasen, a-amylase EC 4 Lyasen (Eliminierung/Addition), zb Pyruvat-Decarboxylase, Enolase EC 5 Isomerasen (Umlagerungen), zb Triosephosphat-Isomerase, Racemasen EC 6 Ligasen (Bindungsbildung unter ATP-Verbrauch), zb Acetyl-CoA-Carboxylase, DNA-Ligase Quelle: https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/enzymes/ 15
Vor- und Nachteile von Biokatalysen Vorteile Effiziente Katalysatoren Kombinierbar Viele unterschiedliche Typen Milde Reaktionsbedingungen Wasser als Lösungsmittel Abfall biologisch abbaubar selektiv Nachteile Inhibierung Cofaktoren benötigt eine natürliche Enantiomerenform eingeschränkte Reaktionsbedingungen empfindlich gegenüber Lösungsmitteln können Allergien auslösen selektiv Quelle: Resch 2015. Biokatalyse. Vortrag Graz. 16
Effiziente Katalysatoren zb Carbonatdehydratase EC 4.2.1.1 CO 2 + H 2 O H 2 CO 3 Reaktionsbeschleunigung um Faktor 10 7 2 n = 10 7 n = 23 270 C Quelle: https://en.wikipedia.org/wiki/carbonic_an hydrase#/media/file:carbonic_anhydras e_1ca2.png Quelle: Stryer 1994, S 185 17
Selektivität - Chiralität Fotos Mandelsäure Quelle: Resch 2015. Biokatalyse. Vortrag Graz. 18
Selektivität - Chiralität Fotos Mandelsäure 19
Enantioselektivität Quelle: Resch 2015. Biokatalyse. Vortrag Graz. 20
(S)-(+)-Carvon Chiralität (R)-(-)-Carvon Quellen: https://de.wikipedia.org/wiki/carvone [19.03.2016] und https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/b/b9/mentha_longifolia_2005.08.02_09.53.56.jpg [19.03.2016] 21
Lehrplanbezug Sek I Keine explizite Nennung, jedoch vielfältige Anknüpfungspunkte ausgehend von deren Erfahrungsbereich Erfassung der Zusammenhänge zwischen Mikrokosmos und alltäglichem Erfahrungsbereich von der Erfahrungswelt der Schülerinnen und Schüler ausgehen Einsicht gewinnen in die für die Lebensvorgänge wichtigsten Stoffklassen Beispiele: Enthält eine Phenylalaninquelle (Aspartam) Lactoseunverträglichkeit Amylase Quelle: https://commons.wikimedia.org/wiki/f ile:aspartame.svg [19.02.2016] 22
Basiskonzepte: Lehrplanbezug Sek II - AHS Struktur-Eigenschafts-Konzept: Art, Anordnung und Wechselwirkung der Teilchen bestimmen die Eigenschaften eines Stoffes Donator-Akzeptor-Konzept: Übertragungsreaktionen, zb bei Oxidoreduktasen, aber auch Transferasen Gleichgewichtskonzept: Reversible chemische Reaktionen können zu einem dynamischen Gleichgewichtszustand führen Molekülgeometrie Katalyse chemische Gleichgewichtsdynamik und ihre Beeinflussung Stoffwechselprozesse enzymatische Steuerung von Stoffwechselprozessen 23
Enzyme für die organische Synthese 24
Vor- und Nachteile von Biokatalysen Vorteile Effiziente Katalysatoren Kombinierbar Viele unterschiedliche Typen Milde Reaktionsbedingungen Wasser als Lösungsmittel Abfall biologisch abbaubar selektiv Nachteile Inhibierung Cofaktoren benötigt eine natürliche Enantiomerenform eingeschränkte Reaktionsbedingungen empfindlich gegenüber Lösungsmitteln können Allergien auslösen selektiv Quelle: Resch 2015. Biokatalyse. Vortrag Graz. 25
Enzyme für die organische Synthese Klassisch: Mehrstufensynthese (Zeit, Ausbeute, Reinigung der Zwischenprodukte, Racemat) Enantiomerenreine Substanzen gewünscht pharmazeut. Wirkstoffe, Peptidmimetika, nicht natürlich vorkommende AS oder AS in nicht-natürlicher Konfiguration 26
Enantiomerenreinheit Enantiomerenüberschuss: ee = m 1 m 2 m 1 +m 2 m i Massen der Enantiomere Enantiomerenverhältnis: er = m 1 m 2 m 1 m 2 ee er 100 0 1 98,5 1,5 0,97 65,7 75 25 0,5 3 50 50 0 1 27
Enzyme für die organische Synthese Klassisch: Mehrstufensynthese (Zeit, Ausbeute, Reinigung der Zwischenprodukte, Racemat) Enantiomerenreine Substanzen gewünscht pharmazeut. Wirkstoffe, Peptidmimetika, nicht natürlich vorkommende AS oder AS in nicht-natürlicher Konfiguration Katalytische Tandem-Reaktionen Domino-Reaktionen Kaskadenreaktionen 28
Deracemisierung von Mandelsäure zu optisch reinem L-Phenylglycin (V. Resch) 29
L-Mandelsäure Deracemisierung von Mandelsäure zu optisch reinem L-Phenylglycine (DA V. Resch) D-Mandelsäure Phenyl-Glyoxylsäure L-Phenylglycin L-Phenylglycin Quelle: Resch 2015. Biokatalyse. Vortrag Graz. 30
Gluconolacton Glucose GDH 1. Schritt NADH+H + NAD + 97% Umsatz ee >97 Phenyl-Glyoxylsäure L-Phenylglycin 31
UV-Absorption NADH/NAD + Quelle: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/08/nad-nadh-absorptionskurven.svg/364px-nad-nadh- Absorptionskurven.svg.png 32
2. Schritt 33
3.Schritt 34
Thermodynamische Betrachtungen 35
Thermodynamische Betrachtungen Wichtig, wenn man wissen will, ob eine Reaktion überhaupt in der gewünschten Richtung ablaufen kann: Δ G Gibbs-Energie 36
Thermodynamische Betrachtungen Δ G = Δ H T Δ S 37
Thermodynamische Betrachtungen Δ G = Δ H T Δ S wenn Δ G < 0 dann gilt: Reaktion kann in der gewünschten Richtung spontan ablaufen exergone Reaktion 38
Thermodynamische Betrachtungen DH < 0 DH > 0 DS > 0 spontane Reaktion? DS < 0? keine Reaktion Nach: Bozeman Science, http://static1.squarespace.com/static/50d5cc57e4b0e383f5b1eb34/ t/52d94443e4b08a516dd61d2b/ 1389970499564/AP+Chem-059+Using+Gibb's+Free+Energy+KN+PDF.pdf 39
Thermodynamische Betrachtungen DH > 0, DS > 0 DH < 0, DS < 0 Eis Wasser Nach: Bozeman Science, http://static1.squarespace.com/static/50d5cc57e4b0e383f5b1eb34/ t/52d94443e4b08a516dd61d2b/ 1389970499564/AP+Chem-059+Using+Gibb's+Free+Energy+KN+PDF.pdf 40
Thermodynamische Betrachtungen Δ G kann von einem Katalysator nicht beeinflusst werden! 41
Thermodynamische Betrachtungen Quelle: Alberty 2000, S. 14 42
Thermodynamische Betrachtungen: Biochemie Nach: https://de.wikipedia.org/wiki/glykolyse [22.03.16] 43
Thermodynamische Betrachtungen: Biochemie Δ G = 23,8 kj/mol berechnet aus den Tabellenwerten für die Standard-Gibbs-Energie der beteiligten Stoffe 44
Thermodynamische Betrachtungen: Biochemie Δ G = 23,8 kj/mol Standard Gibbs-Energie bedeutet Standardbedingungen: 25 C Atmosphärendruck ph = 7 Konzentrationen aller Stoffe: 1 mol/l 45
Thermodynamische Betrachtungen: Biochemie Δ G = 23,8 kj/mol Aber: die tatsächliche Gibbs-Energie ist nicht bloß abhängig von der Art des Stoffes, sondern auch von den in der Lösung vorliegenden Konzentrationen. Δ G = Δ G + RT ln C.[D] A.[B] 46
Thermodynamische Betrachtungen: Biochemie Die Spaltungsreaktion ist unter Standardbedingungen sehr ungünstig (Δ G = +24 kj/mol) und würde nicht ablaufen. Durch die schnelle Weiterreaktion beider Reaktionsprodukte wird aber die Konzentration niedrig gehalten. Die Reaktion läuft daher unter physiologischen Bedingungen im annähernden Gleichgewicht ab. 47
Thermodynamische Betrachtungen: Biochemie Quellen: https://de.wikipedia.org/wiki/glykolyse [22.03.16] und Stryer 2013, S. 468f. 48
Thermodynamische Betrachtungen der Reaktion im Reagenzglas 49
Thermodynamische Betrachtungen Since in such a sequence all transformations are reversible the favoured product formed depends on thermodynamics. Calculation of the Gibbs free energy DG for the interconversion of lactic acid and alanine showed that the thermodynamic equilibrium is on the side of the amino acid (-5.7 kcal/mol); thus an a-hydroxy acid should be preferentially converted to the amino acid, which encouraged us to perform further investigations on this subject. Resch et al. 2010, S 994 50
Thermodynamische Betrachtungen Der erste Schritt ist thermodynamisch ungünstig. Daher wäre es gut, wenn viel NAD+ und wenig NADH vorliegen würde. Wenn man nun den 2. Schritt schneller machen könnte,. 51
Thermodynamische Betrachtungen The units of the enzymes employed for the cascade were chosen in such a way that the reductive amination step is six times faster than the oxidation step. 52
Thermodynamische Betrachtungen Employing this set-up it is ensured that NADH is quickly consumed in the second step providing NAD+ for the thermodynamically unfavoured first step, the asymmetric oxidation. 53
Wir danken für Ihre Aufmerksamkeit! 54
Quellen: Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. & Watson, J. D. (1986). Molekularbiologie der Zelle: Weinheim: Verlag Chemie. Alberty, R. A. (2000). Calculating apparent equilibrium constants of enzyme-catalyzed reactions at ph 7. Biochemical Education 28, 12-17. Berg, J. M., Tymoczko, J. L. & Stryer, L. (2013). Stryer Biochemie. Berlin: Springer. Ertl, G. (2008). Reaktionen an Oberflächen: vom Atomaren zum Komplexen (Nobel-Vortrag). Angewandte Chemie 120, 3578 3590. Karlson, P. (1984). Biochemie für Mediziner und Naturwissenschaftler. Stuttgart: Thieme. Mortimer, C. E. & Müller, U. (2010). Chemie. Stuttgart: Thieme. Neufeldt, S. (2003). Chronologie Chemie. Weinheim: Wiley-VCH. Resch, V., Fabian, W. M. F. & Kroutil, W. (2010). Deracemisation of Mandelic Acid to Optically Pure Non-Natural L- Phenylglycine via a Redox-Neutral Biocatalytic Cascade. Adv. Synth. Catal 352, 993-997. Resch, V. (2015). Biokatalyse. Enzyme für grüne Chemie. Vortrag gehalten am 14. Juli 2015 im Rahmen des Seminars "Chemieunterricht am Puls der Forschung" in Graz Stryer, L. (1994). Biochemie. Heidelberg: Spektrum Akademischer Verlag. 55