Aus der Abteilung für Medizinische Parasitologie Leiter: Univ. Prof. Dr. H. Aspöck des Hygiene - Institutes der Universität Wien Vorstand: Univ. Prof. Dr. H. Flamm Der Peroxldase - Test (ELISA) zum Nachweis von Antikörpern gegen Toxoplasma gondii H. Auer, O.Picher und H. Aspöck Seit Einführung der obligaten Toxoplasmose-Überwachung während der Schwangerschaft im Rahmen des Mutter-Kind-Passes in Österreich werden die mit der Durchführung der serologischen Tests befaßten Laboratorien mit einer großen Anzahl von Untersuchungen konfrontiert. Um diese Untersuchungen möglichst ökonomisch und rasch durchführen zu können, wird ständig an der Entwicklung neuer und an der Verbesserung herkömmlicher serologischer Testmethoden gearbeitet. Heute wird im allgemeinen, in Kombination mit der Komplementbindungsreaktion (KBR), dem Indirekten Immunfloureszenztest (IIFT) als Basistest der Vorzug vor dem Sabin-Feldman-Test gegeben, da er bei gleicher Aussagekraft ein Arbeiten mit abgetötetem Material zuläßt und zusätzlich als spezifischer IgM- bzw. IgG-Test eingesetzt werden kann (Flamm et al. 1975, Aspöck 1980). Dem Indirekten Immunfloureszenztest sind allerdings auch Grenzen gesetzt, da das Ablesen der Ergebnisse in großem Maße unmittelbar von der jeweiligen Leistungsfähigkeit der mit dieser Tätigkeit befaßten Personen abhängig ist (Tab. 1). Als mögliche Alternative bietet sich der - vielfach als Serotest der dritten Generation bezeichnete - rationell einsetzbare und vollautomatisierbare Enzyme- Linked-Immuno-Sorbent-Assay (ELISA) an, der bereits routinemäßig in großem Maßstab z.b. in der Hämatologie und Endokrinologie zum Nachweis von Hormonen und Serumproteinen, in der Virologie zum Nachweis von Hepatitis- Antigen und in der Veterinärmedizin zum Nachweis von Antikörpern gegen Trichinen (Ruitenberg et al 1976) eingesetzt wurde. In der Humanparasitologie findet der ELISA, obwohl in mehreren Forschungslaboratorien Projekte über seine Anwendbarkeit laufen, routinemäßig noch in sehr beschränktem Ausmaß Verwendung (Voller 1976, Weiland 1978). Im Rahmen der Toxoplasmosediagnostik scheint die Beantwortung der Frage besonders wichtig, ob und in welchem Ausmaß Beziehungen zu anderen Tests bestehen und insbesondere ob einer der etablierten Basistests durch den ELISA ersetzt werden kann. Da sich in der Literatur keine schlüssigen Angaben finden, haben wir unter dem besonderen Aspekt der Anwendbarkeit im Rahmen des Mutter-Kind- Passes anhand von ca. 250 Seren Schwangerer eine erste orientierende Ver- 46
gleichsuntersuchung durchgeführt, über die im folgenden berichtet werden soll. In den Monaten Oktober und November 1979 wurden 241 Seren von Schwangeren und Patienten mittels Indirektem Immunfluoreszenztest und ELISA auf Antikörper gegen Toxoplasma gondii getestet. Als Antigen wurde wäßriger Extrakt von im Peritonealexsudat von Mäusen gezüchteten und geernteten, gereinigten und durch Ultraschall homogenisierten Toxoplasmen des Stammes BK verwendet. Dieses Antigen wird an die Näpfchenwände von im Handel erhältlichen Mikrotiterplatten gebunden und nach einem Waschvorgang mit Antiserum überschichtet (Abb. 1). Während einstündiger Inkubation bei + 37 C kommt es zur Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen, die nach einem weiteren Waschvorgang mit Peroxidase-konjugiertem Antihumangammaglobulin überschichtet werden. Anschließend an einen dritten Waschvorgang wird geeignetes Substrat zugegeben, auf dem das Enzym seine Wirksamkeit entfalten kann. Dies kann durch einen Farbumschlag sichtbar gemacht werden. Die Farbintensität ist der in der Probe vorhandenen Antikörperkonzentration proportional. Auf Grund der klaren Farbunterschiede zwischen den einzelnen Titerstufen können die Titerendpunkte makroskopisch bestimmt werden. Die Ergebnisse dieser vergleichenden Untersuchung sind aus Abb. 2 ersichtlich. Wegen der besseren Übersicht wurden die einzelnen Testergebnisse drei Sammelklassen zugeordnet: (1) Seren mit negativem Befund; (2) niedrigtitrige Seren mit Titern von 1:16 bis 1:256; (3) hochtitrige Seren mit Titern von 1:1000 oder höher. Folgende dabei gewonnene Befunde erscheinen uns wesentlich: Alle im Indirekten Immunfluoreszenztest negativen Seren waren auch im ELISA negativ - Übereinstimmung von 100 % Auch alle im indirekten Immunfuoreszenztest hochtitrigen Seren ergaben im ELISA Titer von 1:1000 oder höher Übereinstimmung von 100%. Von 110 Seren mit Titern von 1:16 bis 1:256 im IIFT ergaben 106 auch im ELISA Titer von 1:16 bis 1:256 - Übereinstimmung von 96 %. Nur bei vier Seren waren die Ergebnisse abweichend. Es handelt sich dabei durchwegs um Seren mit Titern von 1:16 im IIFT, die im ELISA negativ reagierten. Die durchgeführte Vergleichsuntersuchung läßt also weitgehende Übereinstimmung der Immunfluoreszenztest-Ergebnisse mit den im Enzymtest erzielten Resultaten erkennen. Abweichungen wurden nur in sehr geringem Ausmaß festgestellt. Sie liegen durchwegs im Übergangsbereich von negativ zu positiv. 47
Weitere umfangreiche und kritische Vergleichsstudien, besonders auch unter Einbeziehung spezifischer IgM- und IgG-Titer-Nachweise, sind erforderlich, um die Effizienz des ELISA im Rahmen der Toxoplasmoseuntersuchung der Schwangeren zu beurteilen. Die vorliegenden Befunde zeigen jedenfalls greifbare Möglichkeiten der Ökonomisierung der Toxoplasmosediagnostik auf. Summary: The ELISA for detection of antibodies against Toxoplasma gondii. In a comparative study 241 sera of pregnant women were tested for antibodies against Toxoplasma gondii in the Fluorescent-Antibody-Test (FAT) and in the Enzyme-Linked-lmmuno-Sorbent-Assay (ELISA). A correlation of 100 % between FAT- and ELISA-results was found in negative sera as well as in sera with antibody-titers of 1:1000 or higher. Sera with low antibody levels (1:16 to 1:256) in FAT coincided in a percentage of 96 % with the results obtained with ELISA. Only four sera with titers of 1:16 in the FAT proved to be negative in the ELISA. Further studies will be necessary to clarify the significance of the ELISA which might become an economic addition in the toxoplasmosis surveillance during pregnancy. Tabelle 1 Vor- und Nachteile von Sabin-Feldman-Test, Indirektem Immundluoreszenztest und ELISA vergleichend dargestellt. SFT IIFT ELISA Vorteile: Nachteile: sensitiv spezifisch lebende Erreger Aktivatorserum erforderlich # sensitiv spezifisch tote Erreger Antigen lagerbar nicht vollautomatisierbar zeitaufwendig sensitiv spezifisch tote Erreger Antigen lagerbar vollautomatisierbar. 48
Abb. 1: Prinzip des ELISA schematisch dargestellt Antigenanlagerung Waschvorgang Überschichten mit Antiserum MM Waschvorgang Überschichten mit Konjugat (= Antihumangammaglobulin + Enzym) Waschvorgang Zugabe von Substrat 49
Abb. 2: Vergleich der im Indirekten Immunfluoreszenztest erhaltenen Ergebnisse mit den im Enzymtest festgestellten Resultaten. (Blöcke: Absolutzahlen der IIFT- Ergebnisse; %-Angabe: Übereinstimmung mit ELISA-Resultaten) 120. -100% 100 96% 80 60 40 20 50 T i t e r
Literatur ASPÖCK, H. (1980): Toxoplasmose-Diagnostik In: Neue Aspekte prä- und perinataler Diagnostik und Therapie. Behring-Symp. 11.5.1979, Wien FLAMM, H., H. ASPÖCK, O. PICHER und H. WERNER (1975): Die Toxoplasmose-Untersuchung von Schwangeren und Neugeborenen. Ost. Ärztezeitg. 30/1 (1975) 15 RUITENBERG, E.J., P.A. STEERENBERG, B.J.M. BROST und J. BUYS (1976): Evaluation on the reliability of Immunoenzymatic techniques for the serodiagnosis in Trichinella spiralis infections. Int. Symp. on immunoenzymatic techniques INSERM Symposium O.2.: 149-166 VOLLER, A., A. BARTLETT und D.E. BIDWELL (1976): Enzyme immunoassays for parasitic diseases. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, Vol. 70, No. 2. pp.98-106 WEILAND, G. (1978): Der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Munch, med. Wschr. 120 (1978) Nr. 44: 1457-1460 Anschrift der Autoren: Dr. H. Auer, Dr. O. Picher, Prof. Dr. H. Aspöck Hygiene-Institut der Universität Abt. f. Med. Parasitologie Kinderspitalgasse 15 A-1095 Wien 51