Lipid Rafts und Cavaeolae

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1 Lipid Rafts und Cavaeolae 1

2 Plasma Membran Komposition Die Plasma Membran von Säugetierzellen enthält 4 Hauptklassen von Phospholipiden: Phosphatidylcholin Phosphatidylethanolamin Phosphatidylserin Sphingomyelin Zusammen mehr als die Hälfte aller Lipide in zellulären Membranen 2

3 Phospholipide bestehen aus zwei langkettigen Fettsäuren, die über eine Esterbindung an eine kleine hydrophile Gruppe gebunden sind 3

4 Phospholipids sind amphipathisch Deshalb aggregieren Phospholipide nicht in Tropfenform, sondern orientieren sich spontan zu Membranen, mit den hydrophilen Gruppen nach aussen, zur wässrigen Umgebung. Moleküle, die mit einem Ende mit der wässrigen Umgebung interagieren und mit dem anderen Ende hydrophob sind, werden als amphipathisch bezeichnet (Griechisch, tolerant für beides ). 4

5 Plasma Membran Komposition Die Phospholipide sind asymmetrisch zwischen dem inneren und äußeren Bi-Layer angeordnet 5

6 Glykolipide Zusätzlich zu den Phospholipiden enthalten Membranen von Säugetieren Glykolipide. Diese Glykolipide findet man hauptsächlich im äußeren Leaflet des Bilayers, mit den Kohlenhydratresten an der Zelloberfläche. Sie stellen aber nur einen relative geringen Anteil aller Lipide dar (~2%). 6

7 Struktur von Glykolipiden Zwei Kohlenwasserstoff Ketten vereinen sich zu einer polaren Kopfgruppe über ein Serin mit einem Kohlenhydratrest (zb. Zucker) 7

8 Cholesterin Zusätzlich enthalten Zellmembranen von Säugern Cholesterin. Cholesterin, ist ein Hauptbestandteil zellulärer Membranen und damit in gleichen molaren Mengen wie Pospholipide vertreten. Aber: Cholesterin kann nicht spontan Membranen bilden! 8

9 Cholesterin im Bilayer Die Cholesterinmoleküle orientieren sich im Bilayer mit ihren Hydroxylgruppen in die unmittelbare Nachbarschaft zu den polaren Kopfgruppen der Phospholipidmoleküle. Die starre, plattenförmige Steroidstruktur interagiert und stabilisiert dadurch teilweise jene Abschnitte der Kohlenwasserstoffketten, die am nächsten zu den polaren Kopfgruppen liegen. 9

10 Lipid-Zusammensetzung von Membranen 10

11 Cholesterin und Mikroviskosität Einflüsse von Cholesterin auf die Viskosität der Membran sind Temperaturabhängig. Bei höheren Temperaturen, kann Cholesterin die freie Beweglichkeit der Fettsäurenketten der Phospholipide behindern und somit den äußeren Bilayer steifer/rigider machen. Dadurch verändert sich auch die Zellmembran-Permeabilität für kleine Moleküle. Jedoch bei niedrigen Temperaturen hat Cholesterin den gegenteiligen Effekt: Durch die Interaktion mit den Fettsäurenketten der Phospholipide, kann Cholesterin Membranen vorm Einfrieren bewahren und deren Beweglichkeit/Mikro-Viskosität bewahren. 11

12 Das Fluid Mosaic Modell In Biomembranen sind nahezu alle Membranproteine lateral mobil und frei diffundierbar. Im Fluid Mosaic Modell, wird die Membran als zweidimensionales Mosaik dargestellt, das von Phospholipiden und Proteinen gebildet wird. 12

13 Lipid Rafts sind Andock- und Interaktionsplattformen für Proteine raft caveola.... formed by dynamic clustering of sphingolipids and cholesterol and move within the fluid bilayer, e.g. during signal transduction. From Simons and Ikonen, Nature 1997, 387:

14 Sie entstehen und bestehen aus einem dynamischen Zusammenschluss von Cholesterin und Sphyngolipiden im äußeren Leaflet des Bilayers. Die gesättigten Kohlenwasserstoffketten der Sphyngolipide erlauben dem Cholesterin sich optimal in der äußeren Hälfte der Membran zu verankern. Das innere Leaflet enthält mehr Phospholipide mit gesättigten Fettsäuren und auch Cholesterin. 14

15 Rafts bilden Caveaolae Caveolae on the plasma membrane of a human fibroblast. (A) Electron micrograph of a fibroblast in cross-section showing caveolae as deep indentations in the plasma membrane. (B) Deep-etch electron micrograph showing numerous caveolae at the cytoplasmic side of the plasma membrane. 15

16 Caveoline: 150 AS Membran Proteine Sind die Bausteine der Caveolae N- und C-Terminus ragen ins Zytoplasma vor = integrales und nicht transmembranes Protein Oligomerisieren Hydrophobes Ende steckt in der Membran Binden Cholesterin 16

17 Funktionen von Caveolae: Endozytose, Transzytose Signal Transduktion Cholesterin Transport Pathogen Eintritt in Zellen Potozytose Lipid-verankerte Membran Rezeptoren in Caveolae nehmen kleine Moleküle wie Vitamine und Lipide auf. 17

18 Methoden zur Untersuchung von Raft- Strukturen? 18

19 Biochemische Anreicherung / Reinigung von Caveolae and Rafts Extraktion mit Triton-X 100 auf Eis. Rafts and damit assoziierte Proteine werden dadurch unlöslich. Flotation in Zucker / Optiprep Gradienten. Das detergenzunlösliche Material flotiert hoch, wegen des Lipidgehaltes. 19

20 Flotation and Visualisierung von Rafts Oliferenko et al., JCB

21 Intracelluläres Annexin II wird von Innen an antibody-crosslinked CD44 Microdomänen rekrutiert Oliferenko et al., JCB

22 Keine Cluster wenn Cholesterin aus Membranen depletiert wird CD44 annexin II merge Oliferenko et al., JCB

23 Immunogold und Freeze Fracture 23

24 Größere Lipid-Domänen können mittels Single Molecule Microscopy dargestellt werden G.J. Schütz, G. Kada, V.Ph. Pastushenko and H. Schindler EMBO J. 19 No.5 (2000) DOPE (monounsaturated phosphoethanolamine analogue): frei diffundierbar DMPE (saturated acyl chains): wird in Mikrodomänen fest gehalten 24

25 Rafts Visualiserung durch Atomic Force Microscopy Atomic force microscopy reveals sphingomyelin rafts (orange) protruding from a dioleoylphosphatidylcholine background (black) in a mica-supported lipid bilayer. Placental alkaline phosphatase (PLAP; yellow peaks), a glycosylphosphatidylinositolanchored protein, is shown to be almost exclusively raftassociated. Saslowsky, D.E., et al. (2002) J. Biol. Chem. 277,

26 Photonic Force Microscopy Kai Simons (Dresden, Germany) has used photonic force microscopy to measure the size of lipid rafts. By comparing the drag force of raft proteins (such as a GPI-anchored protein) and non-raft proteins (such as transferrin receptor) in the presence or the absence of cholesterol, he estimated the diameter of a single raft. The conclusion is that each raft is very small and contains a very small subset of proteins, leading to the prediction that in order to act as signalling and/or sorting devices, they need to cluster. 26

27 Raft Eigenschaften Größe: bis zu 25±10 nm Das entspricht ungefähr 3,500 Sphyngolipid Molekülen Protein Anzahl hängt vom Packungsgrad ab, wahrscheinlich gibt es um die 30 Proteine in Rafts Cluster mit bis zu 15 identen Molekülen wurden beschrieben Statistisch gesehen, können jedoch nur ein relativ kleiner Anteil aller verfügbaren Raft Proteine gleichzeitig in Rafts auch sein. Das wiederum könnte wichtige Auswirkung auf die prinzipiellen Mechanismen der Signalweiterleitung in und durch Rafts haben. 27

28 Raft-Typologie: Nomenklatur 28

29 Experimentelle Tools um Rafts zu zerstören: Cholesterol sequestration/ depletion Filipin (Antibiotic) Pore formation (Saponin, Digitonin, Streptolysin O) Methyl-beta-cyclodextrin Cholesterol biosynthesis Lovastatin Raft Stability Exogenous Cholesterol Exogenous Gangliosides Exogenous polyunsaturated fatty acids 29

30 Signal Transduktion in Lipid Rafts und Caveolae FCεRI T-cell Receptor B-cell Receptor CD44 H-ras Integrins enos EGF Receptor Insulin Receptor EphrinB1 Receptor Neutrophin GDNF Hedgehog 30

31 Wie werden Signale in Rafts induziert und integriert? 31

32 Wie werden Signale in Rafts induziert und integriert? 32

33 A nnex Der CD44 Rezeptor ist in Rafts und intergiert mit dem Zytoskelett CD44 in II A nnex in II Lipid rafts 33

34 out-side-in Signaltransduktion in CD44 Rafts nach Ligandenbindung durch Hyaluronsäure (HA)? HA HA HA CD44 HA II in A nnex Lipid rafts A nnex in II? 34

35 . Okamoto et al., 1999 HA HA HA HA HA CD44 Annexin II TIAM Rac- GDP Bourguignon et al., 2000 Rac- GT P Oliferenko et al., JCB 2000 lamellipodia outgrowth Cytoskeletal rearrangements 35

36 Rafts in Fc Rezeptor Signaltransduktion 36

37 37

38 Rafts in T-Cell Rezeptor Signaltransduktion 38

39 ? Offene Fragen? Wieviel Arten von Rafts? Funktion von Caveolae in Signaltransduction? Welche Signalwege brauchen Rafts? Welche Proteine gehen in Rafts und warum? Wie werden Caveolae internalisiert Rolle des Zytoskelettes? 39