Deregulated expression of the c-myc

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1 Kopplung von Zellzyklus- und Zellwachstumskontrolle durch Zielgene des Proto-Onkogens c-myc Coupling of cell cycle and cell growth control by target genes of the proto-oncogene c-myc Institut für Klinische Molekularbiologie und Tumorgenetik Institut für Molekulare Immunologie 1 Aktuelle Themen Michael Hölzel, Michaela Rohrmoser, Thomas Grimm, Thomas Harasim, Anastassia Malamoussi, Anita Gruber-Eber, Georg W. Bornkamm, Elisabeth Kremmer 1, Dirk Eick Die deregulierte Expression des c-myc Gens ist für die Entwicklung einer Vielzahl von Tumoren ausschlaggebend. Das c-myc-gen kodiert den Transkriptionsfaktor Myc, der verschiedene Klassen von Zielgenen aktiviert und reprimiert. Eine prominente Klasse von Zielgenen besteht aus 64 Genen mit nukleolärer Funktion, von denen viele für die Biogenese der Ribosomen benötigt werden. Wir sind der Frage nachgegangen, wie die nukleolären Zielgene des c-myc Gens die Ribosomenproduktion an die Kontrolle des Zellzyklus koppeln, und beschreiben einen neuen Komplex aus drei Proteinen, die durch die Myc-Zielgene pes1, bop1 und wdr12 kodiert werden. Dieser Komplex, den wir PeBoW-Komplex genannt haben, spielt eine zentrale Rolle bei der korrekten Prozessierung der ribosomalen 28S-RNA. Die konditionale Expression von dominant-negativen pes1-, bop1- und wdr12-mutanten, aber auch der Knockdown der Gene durch sirna-technologie induziert das Tumorsuppressor-Protein p53 und blockiert reversibel die Zellproliferation. Die Ergebnisse zeigen, dass eine funktionierende Ribosomenbiogenese für die Inaktivierung von p53 und das Fortschreiten des Zellzyklus notwendig ist. Deregulated expression of the c-myc gene is critical for the development of a large variety of tumours. The c-myc gene encodes the transcription factor Myc that induces and represses various classes of target genes. One prominent class of target genes comprises 64 genes with a nucleolar function, many of which are required for ribosomal biogenesis. We investigated the question of how nucleolar Myc target genes link the production of ribosomes to activation and progression of the cell cycle. We describe a novel complex of three proteins encoded by the Myc target genes pes1, bop1, and wdr12. This complex, named PeBoW-complex, plays an essential role in the proper processing of the 28S ribosomal RNA precursor. Conditional expression of dominant-negative mutants of pes1, bop1, and wdr12, or knockdown of these genes by sirna technology, induces the tumour suppressor protein p53 and blocks cell proliferation in a reversible manner. The results indicate that proper ribosome biogenesis is required for inactivation of p53 and cell cycle progression. GSF 59

2 Das Proto-Onkogen c-myc wurde erstmals vor über 25 Jahren als das zelluläre Homolog eines retroviralen Onkogens beschrieben. Mittlerweile sind mehr als Forschungsarbeiten zu c-myc erschienen. Das große wissenschaftliche Interesse spiegelt die zentrale Rolle dieses Gens bei der Entstehung vieler Tumoren wieder. Das c-myc Gen kodiert ein im Zellkern lokalisiertes Protein, Myc, das als Transkriptionsfaktor fungiert. In ruhenden Zellen ist die Expression von c-myc in der Regel nicht nachweisbar. Durch Expression von c-myc kann in ruhenden Zellen der Zellzyklus und das Zellwachstum induziert werden. Normalerweise steht das c-myc Gen unter der Kontrolle von Wachstumsfaktoren, die die Expression des Gens stimulieren. In vielen Forschungsarbeiten konnte in den vergangenen Jahren bestätigt werden, dass Myc ein zentraler intrazellulärer Sensor für Wachstumssignale ist. Das onkogene Potential von c-myc kommt zum Tragen, wenn das Gen zum falschen Zeitpunkt durch exogene Faktoren oder durch genetische Veränderungen aktiviert wird. Die stetige (konstitutive) Aktivität des c-myc Gens verhindert den Austritt einer Zelle aus dem Zellzyklus. Im Tierexperiment führt eine solche konstitutive c-myc Aktivität regelmäßig zur Entstehung von Tumoren. Seit der Erstbeschreibung von c-myc steht daher die Frage im Raum, wie die Aktivität dieses Gens zur Tumorentstehung beiträgt. Myc-Zielgene Die Antwort liegt offensichtlich in der Fähigkeit des Myc-Proteins, die Aktivität anderer Gene zu steuern. Seit Anfang des Jahres 2000 wurden weltweit große Anstrengungen unternommen, die durch Myc regulierten Zielgene zu identifizieren. Dazu wurden verschiedene zelluläre Testsysteme entwickelt, in denen die Expression des c-myc- Gens beziehungsweise die Aktivität des Myc- Proteins gezielt an- und abgestellt werden kann. Man spricht hier von konditionalen Zellsystemen für Myc. In unserem Institut haben wir Zellsysteme hergestellt, in denen die Transkription des c-myc Gens durch das Antibiotikum Tetrazyklin beziehungsweise die Aktivität des Myc-Proteins durch das Hormon Östrogen regulierbar ist. Nach Anschalten der Myc-Aktivität kann die veränderte Expression anderer zellulärer Gene gemessen werden. Um eine solche Messung genomweit für alle menschlichen Gene durchführen zu können, haben wir im Rahmen einer Kooperation mit der Firma Roche, Penzberg, zirka Genproben mit Hilfe von Affymetrix DNA-Microchips untersucht. Hierbei zeigte sich, dass Myc die Aktivität sehr vieler Gene reguliert. Die bisher von uns und anderen Arbeitsgruppen gefundenen Myc-Zielgene sind im Internet unter aufgelistet. Nicht jedes der beschriebenen Gene wurde in allen verwendeten Systemen als Myc-reguliert identifiziert manche von ihnen werden möglicherweise gewebespezifisch durch Myc gesteuert. Insgesamt wurden mehr als 1000 Myc-regulierte Gene gefunden. Bei dieser großen Anzahl stellt sich natürlich die Frage, ob die Myc-Regulation all dieser Gene für die Tumorentstehung bedeutsam ist, oder ob nur bestimmten Zielgenen eine besondere Bedeutung zukommt. Mit Hilfe eines Gene ontology - Programms lassen sich die Zielgene von Myc in bestimmte funktionelle Gruppen einordnen. Die Anzahl der gefundenen funktionellen Gruppen ist groß und beinhaltet fast alle metabolischen Prozesse der Zelle, angefangen vom Nukleotid-, Aminosäure-, Protein-, Lipid-, Eisen- und Proteinstoffwechsel bis hin zur Ribosomenbiogenese. Es scheint, als ob Myc eine ruhende Zelle umprogrammieren und nahezu alle wesentlichen Funktionen für Zellwachstum und Zellvermehrung stimulieren kann. Funktionen, die die Zellvermehrung hemmen, werden dagegen durch Myc inhibiert. Eine Gruppe von Genen hat unsere besondere Aufmerksamkeit erweckt: Es handelt sich um 64 Myc-regulierte Gene, die für Faktoren des Nukleolus kodieren. Der Nukleolus ist ein Organell im Zellkern, in dem vor allem die Biogenese der Ribosomen stattfindet. Myc-Zielgene mit nukleolärer Funktion Ein großer Teil der nukleolären Proteine wird für die Ribosomenbiogenese benötigt und ist evolutionär zwischen Mensch und 60 GSF

3 IP IP IP Input (5%) α-wdr12 α-pes1 α-bop1 α-cytohesin Input (5%) α-wdr12 α-pes1 α-bop1 Abb. 1: Die nukleolären Proteine Pes1, Bop1 und WDR12 bilden einen stabilen Komplex (PeBoW). A: Aus proliferierenden menschlichen U2OS-Zellen wurden Zell-Lysate hergestellt und Immunpräzipitationen mit monoklonalen Antikörpern gegen WDR12, Pes1, Bop1 und Cytohesin (Kontrolle) durchgeführt. Die Präzipitate wurden in Immunoblots mit Pes1-, Bop1- und WDR12-spezifischen Antikörpern analysiert. Die Bandenmuster zeigen, dass jeder der drei monoklonalen Antikörper das komplette Set an Pes1-, Bop1- und WDR12-Proteinen immunpräzipitiert, diese Proteine also einen stabilen Komplex bilden. *, unspezifische Bande; **, IgG schwere Kette. α-cytohesin ** ** * Pos1- Bop1- WDR12- Input (5%) α-wdr12 α-pes1 α-bop1 α-cytohesin ** Aktuelle Themen Hefe hoch konserviert. Wenn die Expression vieler dieser Faktoren unter der Kontrolle von Myc steht, kann dann daraus geschlossen werden, dass Myc die Ribosomenbiogenese steuert? Tatsächlich werden die reifen Formen von ribosomaler RNA in einem von uns untersuchten B-Zellsystem in Abwesenheit von Myc nur gering, nach Aktivierung von Myc dagegen sehr effizient produziert. Im Rahmen eines von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) geförderten Projekts haben wir vor zwei Jahren begonnen, die Funktionen der nukleolären Myc- Zielgene genauer zu untersuchen. Unser Hauptaugenmerk haben wir dabei zunächst auf die Gene pes1, bop1 und wdr12 gelegt. Diese drei Gene sind in der Hefe besonders hoch konserviert und ihre Produkte formen einen Proteinkomplex. Wir konnten jetzt zeigen, dass die entsprechenden Genprodukte Pes1, Bop1 und Wdr12 in Säugetierzellen ebenfalls einen stabilen Komplex bilden (Abb. 1). Wesentliche Eigenschaften dieses Komplexes, den wir PeBoW genannt haben, wurden kürzlich von uns veröffentlicht. Multifunktioneller PeBoW-Komplex Es ist uns gelungen, für jede Untereinheit von PeBoW dominant-negative Mutanten herzustellen und konditional in Tetrazyklinregulierten Vektoren zu exprimieren. Alle Mutanten verursachen in Rattenfibroblasten wie auch in menschlichen Osteosarcoma- Zellen reversibel eine Blockade des Zellzyklus und hemmen die Prozessierung der ribosomalen 32S-Vorläufer-RNA zur reifen 28S-RNA. In proliferierenden Zellen führt die Expression der Mutanten immer zu einer α-p53 α-p53 (p-ser15) α-tubulin HCT116 p53 +/+ IR + 4 Gy sirna control WDR12 Pes1 Bop1 sirna control WDR12 Pes1 Bop1 Abb. 2: Die Hemmung der Ribosomenbiogenese durch Inhibition von Pes1, Bop1 und WDR12 führt zur Stabilisierung, nicht aber zur Serin-15-Phosphorylierung von p53. HCT116-Zellen wurden mit sirna für WDR12, Pes1, Bop1 oder einer Kontroll-siRNA behandelt und anschließend ohne (-IR) oder mit 4 Gray bestrahlt. Zell-Lysate wurden dann mit einem anti-p53 beziehungsweise anti-p53-ser-15 spezifischen Antikörper in Immunoblots untersucht. Tubulin diente als Gel-Ladekontrolle. GSF 61

4 starken Akkumulation von p53, die in ruhenden Zellen nicht beobachtet wird. p53 ist ein Tumorsuppressor-Protein, das normalerweise durch genotoxischen Stress induziert wird und den Zellzyklus in der G1- und G2-Phase hemmen kann. Die beobachtete Akkumulation von p53 nach Expression der dominant-negativen PeBoW-Mutanten war vergleichbar stark wie sie auch nach γ-bestrahlung beobachtet wird. Ein wesentlicher Unterschied ist aber, dass die nach γ-bestrahlung üblicherweise auftretende Phosphorylierung der Aminosäure Serin-15 von p53 durch die dominant-negativen Mutanten des PeBoW-Komplexes nicht induziert wird (Abb. 2). Die Phosphorylierung von Serin-15 stört die Interaktion von p53 mit Mdm2, einer Ubiquitin E3-Ligase, die für den schnellen Abbau von p53 essentiell ist. Wenn die Phosphorylierung von Serin-15 bei der Stabilisierung von p53 nach der Expression der dominant-negativen PeBoW-Mutanten keine Rolle spielt, wie kommt es dann zu einer Akkumulation des p53-proteins? Das Tumorsuppressor-Gen p53 Während c-myc zu den bestuntersuchten Onkogenen zählt, ist das p53-gen das mit Abstand am besten erforschte Tumorsuppressor-Gen. Bis heute sind mehr als in der Pubmed-Literaturdatenbank zitierte wissenschaftliche Publikationen zu p53 erschienen. Seit seiner Erstbeschreibung Ende der 1970er-Jahre als Bindungspartner des viralen Onkoproteins large T-Antigen von Simian Virus 40 hat p53 das Interesse von immer mehr Forschern geweckt. Die wichtigste Beobachtung dabei war, dass in Tumorzellen kein anderes Gen so häufig in seiner Funktion und Integrität verändert ist wie p53. Das p53-gen kodiert wie c-myc einen Transkriptionsfaktor, der eine große Zahl vor allem Zellzyklus-relevanter Gene reguliert. Schon früh wurde beschrieben, dass die Aktivierung von p53 durch genotoxischen Stress erfolgt und in der Zelle, abhängig vom Kontext, entweder eine Arretierung des Zellzyklus oder den programmierten Zelltod (Apoptose) induziert. Kontext bedeutet hierbei, dass unterschiedliche Signale p53 aktivieren und sowohl zu Abb. 3: Modell für die Aktivierungsmechanismen des p53-tumorsuppressors. Nach DNA-Schädigung führen verschiedene Signalwege zu Phosphorylierung von p53 an unterschiedlichen Positionen. Einige dieser Signale (zum Beispiel die Ser-15-Phosphorylierung) blockieren die Funktion von Mdm2 und hemmen den Abbau von p53. Alternativ kann die Funktion von Mdm2 auch gehemmt werden, indem ribosomale Proteine direkt an Mdm2 binden. Erhöhte Mengen an freien ribosomalen Proteinen werden durch eine Hemmung der Ribosomenbiogenese erreicht. einer Stabilisierung als auch zu einer komplexen Modifikation des Proteins führen (Abb. 3). Signale für die Aktivierung von p53 können vor allem durch energiereiche Strahlung und genotoxische Substanzen, aber auch durch die Aktivierung bestimmter zellulärer Gene (Onkogene) erzeugt werden. Bis vor kurzem wurde daher allgemein angenommen, dass es sich bei p53 um einen Guardian of the Genome (Wächter des Erbguts) handelt, der durch Veränderun- 62 GSF

5 gen in der DNA (wie Mutationen, Quervernetzungen oder Brüche) aktiviert wird, um dann entweder die Zellen reversibel oder irreversibel im Zellzyklus zu inhibieren oder den programmierten Zelltod einzuleiten. Der Nukleolus als Stress-Sensor Heute ist klar, dass diese Sichtweise die Funktionen von p53 nur unzureichend beschreibt. In einem bemerkenswerten Experiment konnte kürzlich gezeigt werden, dass DNA-Mutationen im Nukleoplasma selbst schwerste Schädigungen nach UV- Bestrahlung nicht zu einer Stabilisierung des p53-proteins führen (Rubbi und Milner, EMBO J. 22:6068, 2003). Dagegen wird eine schnelle und starke Akkumulation von p53- Protein beobachtet, wenn Mutationen im Nukleolus induziert werden. Was unterscheidet Mutationen im Nukleoplasma von Mutationen im Nukleolus? Im Nukleoplasma werden die RNA Polymerase II- und RNA Polymerase III-spezifischen Gene transkribiert, im Nukleolus die für die Ribosomenbiogenese spezifischen RNA Polymerase I- abhängig transkribierten Gene. Schon lange ist bekannt, dass der Nukleolus ein wesentlich empfindlicherer Sensor für DNA-Schäden ist als das Nukleoplasma. So kann ein Inhibitor der Transkription, zum Beispiel Actinomycin D, schon bei einer Konzentration 0.1 µm die Aktivität von RNA Polymerase I weitgehend hemmen, während die gleiche Konzentration auf die Aktivität von RNA Polymerase II und III noch keinen inhibierenden Einfluss hat. Die Konzentration von 0.1 µm Actinomycin D reicht bereits ebenfalls aus, um in Zellen p53 zu stabilisieren. Aufgrund dieser Beobachtung stellen sich wichtige weitergehende Fragen: Was ist der Sensor im Nukleolus, der zur Stabilisierung von p53 führt? Ist es die blockierte ribosomale Transkription und geht das Signal zur p53-stabilisierung unmittelbar von den ribosomalen Genen aus? Oder ist der Sensor für die p53-stabilisierung der Transkription der ribosomalen Gene nachgeschaltet? Ist zum Beispiel das Ausbleiben der Ribosomenbiogenese in aktivierten Zellen das Signal für die Stabilisierung von p53? Mdm2, Regulator der p53-stabilität Ein wichtiger Regulator der p53-stabilität ist Mdm2, eine E3-Ligase, die die Ubiquitinylierung und den Proteasom-vermittelten Abbau von p53 stimuliert. Das p53-protein wird zwar kontinuierlich in der Zelle produziert, hat aber in Gegenwart von aktivem Mdm2 nur eine Halbwertszeit von wenigen Minuten. Mdm2-Knockout-Mäuse sind embryonal letal aufgrund eines frühen Defekts während der Implantation des Embryos. Dieser Defekt beruht offensichtlich auf der fehlenden Inaktivierung von p53, da mdm2 /, p53 / Doppel-Knockout-Mäuse sich weitgehend normal entwickeln. Diese bemerkenswerte Beobachtung impliziert zwei wichtige Annahmen: (i) Mdm2 ist der zentrale Regulator von p53 und (ii) Mdm2 scheint neben der Inaktivierung von p53 keine weiteren essentiellen Aufgaben zu haben. Damit liegt der Fokus der p53-regulation auf Mdm2. Neben Mdm2 wurden zwar noch drei weitere E3-Ligasen beschrieben, die p53 ubiquitinylieren können, keine ist jedoch in der Lage, die Funktion von Mdm2 in der Embryonalentwicklung zu ersetzen. Daher nimmt man an, dass die Funktion von Mdm2 möglicherweise nicht nur in der p53-ubiquitinylierung liegt, sondern vor allem auch darin, direkt an das Proteasom binden zu können und so unmittelbar eine Rekrutierung von p53 an das Proteasom zu bewerkstelligen. Mdm2 ist somit der zentrale Regulator des Abbaus von p53-protein. Wie aber wird Mdm2 selbst in der Zelle reguliert? Die Regulation von Mdm2 In den letzten Jahren wurden verschiedene Mdm2-Interaktionspartner mit inhibitorischer Funktion beschrieben. Neben ARF und dem Tumorsuppressor prb binden nach neuen Berichten auch mehrere ribosomale Proteine der 60S-Untereinheit die Proteine L5, L11 und L23 spezifisch an Mdm2. Eine Arbeitshypothese ist zurzeit, dass die nicht in Ribosomen eingebauten ribosomalen Proteine die Funktion von Mdm2 hemmen und damit den Abbau von p53 blockieren können. Führt man diesen Gedanken weiter, Aktuelle Themen GSF 63

6 ist die Schlussfolgerung, dass die Funktion von p53 durch die Ribosomenbiogenese kontrolliert wird: Mdm2 kann p53 erst dann inaktivieren, wenn die Menge an freien L5-, L11- und L23-Proteinen durch ihren Einbau in die Ribosomen abgenommen hat. Über diesen derzeit noch nicht im Detail verstandenen Regelkreis könnten Zellwachstum und Zellzyklus miteinander gekoppelt sein: Die durch Wachstumsfaktoren zu Beginn des Zellzyklus erhöhten p53- Mengen arretieren die Zellen in der G1- Phase bis genügend Wachstum (Verdopplung der Ribosomen) stattgefunden hat. Der Übergang der Zelle in die S-Phase wird dann durch Inaktivierung (Abbau) von p53 und, wie schon lange bekannt, Inaktivierung (Phosphorylierung) von prb ermöglicht. In diesem Szenario spielt p53 bei der physiologischen Wachstumskontrolle von Zellen eine wesentlich wichtigere Rolle als bisher angenommen. Diese Hypothese konnte jetzt durch konditionale mdm2-knockout-mäuse bestätigt werden. Die Funktion von Mdm2 wird in allen Phasen der Embryonalentwicklung benötigt. Dies bedeutet, dass der Zellzyklus auch in Abwesenheit von Stress- Signalen immer der p53-kontrolle unterliegt. Ausblick Viele der heute in der Tumortherapie verwendeten Chemotherapeutika hemmen die Ribosomenbiogenese, induzieren p53 und tragen so maßgeblich zur Eliminierung von Tumorzellen durch Apoptose bei. Da fast alle Substanzen genotoxisch wirken, sind sie mit beträchtlichen Nebenwirkungen und Spätfolgen behaftet. Daher ist es wichtig, die molekularen Wirkmechanismen der Chemotherapeutika möglichst genau zu verstehen. Am Ende dieser Forschung könnten neue, verbesserte Substanzen stehen, die die Ribosomenbiogenese auch ohne genotoxische Wirkung effektiv inhibieren und damit wesentlich verträglicher wären. Ausgewählte Veröffentlichungen Hölzel, M., Rohrmoser, M., Schlee, M., Grimm, M., Harasim, T., Malamoussi, A., Gruber-Eber, A., Kremmer, E., Hiddemann, W., Bornkamm, G. W., Eick, D.: Mammalian WDR12 is a novel member of the Pes1-Bop1 complex and required for ribosome biogenesis and cell proliferation. J. Cell Biol. 170, (2005) Schlosser, I., Hölzel, M., Hoffmann, R., Burtscher, H., Kohlhuber, F., Schuhmacher, M., Chapman, R., Weidle, U. H., Eick, D.: Dissection of transcriptional programmes in response to serum and c-myc in a human B cell line. Oncogene 24, (2005) Schlosser, I., Hölzel, M., Mürnseer, M., Burtscher, H., Weidle, U. H., Eick, D.: A role of c-myc in the regulation of ribosomal RNA processing. Nucleic Acids Res. 31, (2003) Hölzel, M., Kohlhuber, F., Schlosser, I., Hölzel, D., Lüscher, B., Eick, D.: Myc/Max/Mad regulate the frequency but not the duration of productive cell cycles. EMBO Reports, 2, (2001) Schuhmacher, M., Kohlhuber, F., Hölzel, M., Kaiser, C., Burtscher, H., Jarsch, M., Bornkamm, G. W., Laux, G., Polack, A., Weidle, U. H., Eick, D.: The transcriptional program of a human B cell line in response to Myc. Nucleic Acids Res. 29, (2001) 64 GSF