Regulation der Zellproliferation

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1 Tätigkeitsbericht 2003 Hengst, Ludger Regulation der Zellproliferation 1 Regulation der Zellproliferation Hengst, Ludger Max-Planck-Institut für Biochemie Selbständige Nachwuchsgruppe - Regulation der Zellproliferation (MPG/Roche) Forschungsgebiet: Entwicklungs- und Evolutionsbiologie/Genetik Korrespondierender Autor: Hengst, Ludger hengst@biochem.mpg.de Zusammenfassung Die Vermehrung von Zellen durch Zellteilungen ist eine Grundvoraussetzung für die Aufrechterhaltung allen Lebens. Die Entscheidung für eine Zellteilung hängt in einzelligen Organismen häufig von Umwelteinflüssen ab. Besonders in Vielzellern müssen Zellteilungen strikt kontrolliert werden, um aus einer Eizelle den komplexen Organismus zu bilden und ihn aufrecht zu erhalten. Dazu werden auch im Erwachsenen kontinuierlich geschädigte oder abgestoßene Zellen durch Zellteilungen ersetzt. Fehlerhafte Regulation der Zellteilung führt beim Menschen zu verschiedenen hyper- oder hypoproliferativen Erkrankungen. Diese können für das Entstehen auch lebensbedrohlicher Erkrankungen wie zum Beispiel Krebs mitverantwortlich sein. Wir untersuchen die molekularen Mechanismen, die den eukaryotischen Zellzyklus kontrollieren und darüber entscheiden, ob Zellen sich teilen dürfen oder nicht. Dabei interessiert uns zum Beispiel, über welche molekularen Mechanismen vielfältige mitogene Signale mit antiproliferativen Signalen verrechnet werden, und wie sie letztendlich zur unwiderruflichen Entscheidung führen können, eine Zellteilung durchzuführen. Bevor sich Zellen zu einer Teilung verpflichten, werden mitogene und antiproliferative Signale gegeneinander abgewogen. Nur wenn die mitogene Stimulation überwiegt, führt dies zur Aktivierung der Zellzyklus-Maschinerie, die im Kern aus Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs) besteht. Verschiedene mitogene oder antiproliferative Signale laufen auf Ebene der Regulation von CDK-inhibitorischen Proteinen zusammen. Diese Proteine binden und regulieren CDKs. Wir untersuchen momentan eine Anzahl unterschiedlicher molekularer Mechanismen, die die biologische Aktivität, die Translation oder die Stabilität dieser Proteine regulieren und damit über den Eintritt in den Zellzyklus oder den Ruhezustand entscheiden können. Das Wachsen und Verdoppeln von Zellen ist Grundlage allen Lebens vom Einzeller bis hin zum komplexen vielzelligen Organismus. Erwachsene Menschen setzen sich aus etwa (einhunderttausend Milliarden) verschiedenen Zellen zusammen, die über eine komplexe Abfolge von Zellteilungen und Differenzierungsprozessen von ursprünglich einer einzigen befruchteten Eizelle abstammen. Obwohl sich die meisten Zellen des ausgewachsenen Organismus nicht mehr teilen, bleibt eine Gruppe von Zellen bereit, auf Aufforderung zu proliferieren. Zum Beispiel kann bei speziellen Zellen ein Signal zur Zellteilung durch eine Hautverletzung entstehen, die zur Heilung die Neubildung von Hautgewebe und dazu eine bestimmte Anzahl von Zellteilungen erfordert. Sobald die Wunde geschlossen ist, veranlassen Haltesignale, dass die Zellteilungen aufhören. Auch zur Regeneration abgestoßener Zellen sind kontinuierliche Zellteilungen erforderlich: Allein um die roten Blutzellen zu ersetzen, sind im Erwachsenen mehr als drei Millionen Zellteilungen pro Sekunde erforderlich.

2 2 Hengst, Ludger Regulation der Zellproliferation Tätigkeitsbericht 2003 Für jede Teilung müssen Zellen ihre genetische Information einmal (und nur einmal) vollständig verdoppeln und auf die Tochterzellen verteilen. Um die Präzision dieser beiden zentralen Prozesse sicherzustellen, läuft der Zellzyklus in eukaryotischen Zellen nach einem festgelegten Schema ab, das in vier aufeinanderfolgende Phasen gegliedert werden kann: Die Verdopplung der DNA in der Syntheseoder S-Phase findet zeitlich getrennt von der Verteilung auf die beiden Tochterzellen statt, die in der Mitose während der M-Phase stattfindet (Abb. 1). Diese beiden Zellzyklus-Phasen werden durch dazwischen geschaltete Zwischenphasen oder so genannte Gap-Phasen getrennt (Abb. 1). Die Gap- Phasen G 1 und G 2 ermöglichen eine Kontrolle, ob eine vorhergehende Zellzyklus-Phase auch korrekt abgeschlossen wurde und keine Schädigung der genetischen Information vorliegt. In der ersten Gap- Phase G 1 entscheidet die Zelle zudem auch über den Beginn einer weiteren Zellteilung. Diese Entscheidung hängt von der Anwesenheit stimulierender (mitogener) Signale ab und kann durch hemmende (antiproliferative) Signale verhindert werden. Beim Überwiegen antiproliferativer Signale kann die Zelle den Zellzyklus verlassen und in einen Ruhezustand, die G 0 -Phase, eintreten. Bei mitogener Stimulation kann eine ruhende Zelle wieder in den Zellzyklus eintreten. Antiproliferative Signale können Zellen auch zur Differenzierung veranlassen und dazu führen, dass sie als hoch spezialisierte Zellen ihre Teilungen einstellen. Der Entschluss zu einer neuen Zellteilung ist eine unwiderrufliche Verpflichtung zum Durchlaufen eines kompletten Zellzyklus. Er wird durch einen Abschnitt in der G 1 -Phase markiert, der Restriktionspunkt genannt wird (Abb. 1). Kurz nach dieser Entscheidung beginnt die Zelle mit der Herstellung einer identischen Kopie ihrer Erbinformation und tritt damit in die zweite Zellzyklus-Phase, die S-Phase, ein. Abb. 1: Schematische Darstellung des Zellzyklus. Zellen können in der G 1 -Phase den Zellzyklus verlassen und in einen Ruhezustand (G 0 -Phase) übergehen. G 0 Zellen sind biochemisch aktiv, teilen sich aber nicht, bis sie stimuliert werden, in den Zellzyklus zurückzukehren. Durch den Übertritt des Restriktionspunktes verpflichten sich Zellen zu einer Zellteilung und können erst wieder in der nächsten G 1 -Phase in den G 0 -Zustand eintreten. Motor für die meisten Übergänge im Zellzyklus ist die oszillierende Aktivität von Proteinkinasen aus der Familie der Cyclin-abhängigen Kinasen (Cyclin-dependent kinases, CDKs; Abb. 2). Diese Enzyme

3 Tätigkeitsbericht 2003 Hengst, Ludger Regulation der Zellproliferation 3 phosphorylieren eine Reihe von Proteinen und beeinflussen damit deren Aktivität, Funktion, Lokalisation oder Stabilität. Ein Anstieg G 1 /S-spezifischer CDK-Aktivität erfolgt, wenn die Zellen den unwiderruflichen Entschluss zur Zellteilung treffen und in die S-Phase eintreten. Antiproliferative Signale können diese CDK-Aktivierung verhindern und damit den Zellzyklus anhalten. Abb. 2: Die Übergänge des Zellzyklus werden durch CDK-Komplexe reguliert, die aus einer katalytischen Untereinheit (CDK) und einem positiven Aktivator (Cyclin) aufgebaut sind. CDKinhibitorische Proteine (p21, p27 und p57) binden und inaktivieren CDKs. Interessanterweise können sie unter nicht vollständig verstandenen Bedingungen CDK4- und CDK6-Komplexe nicht nur inhibieren, sondern auch aktivieren. Die CDK-Aktivität kann über verschiedene Mechanismen reguliert werden. Dazu gehören die Synthese und der Abbau von Cyclinen, Phosphorylierungen und Dephosphorylierungen und das Binden CDKinhibitorischer Proteine (CKI, für CDK-Inhibitor). Besonders bei der Kontrolle des G 1 /S-Übergangs spielen bestimmte CDK-inhibitorische Proteine eine Schlüsselrolle. Diese Inhibitoren verhindern Zellteilungen, indem sie an bestimmte CDKs binden und sie dadurch katalytisch inaktivieren (Abb. 2). Interessanterweise können CDK-Inhibitoren nicht nur CDKs inaktivieren, sondern Cyclin D/CDK- Komplexe unter bestimmten Bedingungen auch aktivieren. Die Stärke der CDK-Inhibitor-Expression ist häufig an die An- oder Abwesenheit mitogener oder antiproliferativer Signale gekoppelt. Damit stehen die CDK-Inhibitoren am Ende von Signalketten, die über die Zellproliferation entscheiden. Einer dieser Inhibitoren, p27 Kip1, wurde von uns in G 1 -arretierten Zellen entdeckt. Das p27-protein wird in proliferierenden Zellen in der G 1 -Phase exprimiert und abgebaut, sobald die Zellen in die S-Phase eintreten. Erhöhte p27-mengen fanden wir in Zellen, die in der G 1 -Phase oder G 0 -Phase arretiert waren. p27 ist Mitglied einer Familie von drei verwandten CDK-Inhibitoren, denen eine CDK-inhibitorische Domäne gemeinsam ist. Die Proteine dieser Cip/Kip-Familie, p21, p27 und p57, unterscheiden sich außerhalb dieser aminoterminalen Domänen stark und binden mit ihrer carboxyterminalen Sequenz unterschiedliche Partner. Auch hinsichtlich ihrer Regulation unterscheiden sich die drei Mitglieder der Cip/Kip-Familie stark. So werden die Proteine durch unterschiedliche Signale reguliert. Zum Beispiel kann p21 durch Stress wie DNA-Schädigungen transkriptionell induziert werden und dann zum Zellzyklusarrest führen. p57 wird verstärkt in der Embryonalentwicklung exprimiert und findet sich nur

4 4 Hengst, Ludger Regulation der Zellproliferation Tätigkeitsbericht 2003 in speziellen Zellen des Erwachsenen. p27 wird dagegen in vielen Zelltypen exprimiert, und die Stärke des Inhibitors wird durch verschiedene zellautonome und exogene Signale gesteuert. In verschiedenen Projekten beschäftigen wir uns mit der Regulation von Cip/Kip-Proteinen. Während Änderungen von Proteinmengen in der Regel mit Änderungen der sie kodierenden mrnas einhergehen, wird p27 häufig nicht über die Menge der mrna reguliert. Unter vielen Bedingungen, bei denen sich die Level von p27 stark ändern, gehen diese Änderungen weder mit veränderter Transkription noch mit veränderter mrna-stabilität einher. So bleibt in HeLa-Zellen zum Beispiel die Menge des p27-transkripts während des Zellzyklus unverändert, obwohl die Proteinmengen hier stark schwanken. Eine posttranskriptionelle Regulation von p27 findet auch beim starken Anstieg von p27 in Zellen statt, die den Zellzyklus beenden und in den Ruhezustand (G 0 -Phase) übertreten. Verantwortlich für diese Schwankungen sind Änderungen der Proteinstabilität und der Translation. In einigen Zelltypen ändert sich dabei die Translationsrate, bevor sich die Stabilität von p27 ändert. Dies kann mit dem regulierten Abbauweg von p27 am G 1 /S-Übergang zusammenhängen: CDKs, die eigentlich von p27 inaktiviert werden, müssen p27 phosphorylieren, um seinen ubiquitin-abhängigen Abbau zu initiieren (Abb. 3A). Dies erfordert die Anwesenheit von aktiven CDK-Komplexen. Damit könnte sichergestellt werden, dass sich p27 nicht mehr anreichert, sobald Zellen sich entschlossen haben, einen neuen Zellteilungs-Zyklus zu durchlaufen. Antiproliferative Signale, die eigentlich zu einer verstärkten Expression von p27 führen können, könnten durch diesen Feedback-Loop dann irrelevant werden, wenn eine Entscheidung zur Zellteilung gefallen ist und CDKs aktiviert wurden (Abb. 3B). Abb. 3: A. p27 wird durch den Ubiquitin-Proteasom-Weg abgebaut: Phosphorylierung von Threonin 187 in p27 durch aktive Cyclin E/CDK2 initiiert die Ligation von Ubiquitin an p27. Ubiquitinmodifiziertes p27 wird durch das Proteasom abgebaut. B. Modell zur Regulation von p27 durch mitogene und antiproliferative Signale: ein Feedback Loop der Degradation von p27 wird dadurch gebildet, dass zur Degradation über SCF-Skp2 eine Phosphorylierung des Inhibitors durch aktive Cyclin E/CDK2- Kinase notwendig ist. Die Degradation von p27 führt dazu, das weiteres aktives Cyclin E/CDK2 entsteht. Dadurch wird verhindert, das nach Aktivierung von Cyclin E/CDK2 p27 akkumulieren kann. Oberhalb des Feedback-Loops könnte - wie in diesem Modell spekuliert - die Regulation der Translation von p27 mitbestimmen, ob eine kleine Menge aktive Cyclin E/CDK2-Kinase entsteht und damit der Feedback- Loop der p27-degradation initiiert wird.

5 Tätigkeitsbericht 2003 Hengst, Ludger Regulation der Zellproliferation 5 Da die Translation von p27 in der frühen Antwort von Zellen auf mitogene oder antiproliferative Signale eine zentrale Rolle spielen könnte, haben wir begonnen, die molekularen Mechanismen der Translationskontrolle zu untersuchen und Verbindungen zu Signalwegen zu identifizieren, die den CDK- Inhibitor regulieren. Wir haben eine vollständige p27-mrna kloniert und Domänen identifiziert, die zu einer Zellzyklusabhängigen Translation von p27 führen können oder für eine verstärkte Expression von p27 in nichtproliferierenden Zellen verantwortlich sind. Im Gegensatz zu den meisten zellulären mrna-molekülen besitzt das p27-transkript einen kurzen kodierenden Bereich (uorf) oberhalb der p27 kodierenden Sequenz. Diese kurze kodierende Region ist überraschend konserviert: Sie wird zum Beispiel in ähnlicher Position und Länge in der p27 mrna von Vögeln gefunden, und ihre Sequenz ist so stark konserviert wie die der p27 kodierenden Region (Abb. 4). Zusammen mit einer stark strukturierten Region am 5 -Ende der mrna ermöglicht diese Region eine unterschiedliche Translation von p27 in verschiedenen Zellzyklus-Phasen. Abb. 4: Die p27-mrna aus Mensch (unten) und Huhn (oben). Ein Großteil der Regulation der p27- Translation beruht auf der 5'-nichttranslatierten Region der mrna. Die Struktur der cdna und die Sequenz des uorf sind zwischen Säugern und Vögeln hoch konserviert (Identität der Nukleotidsequenz in Prozent). Unterhalb des uorfs befindet sich in der menschlichen p27-mrna eine modulare IRES- Domäne. Ob in der Sequenz des Huhns auch eine IRES-Aktivität vorhanden ist, wurde noch nicht untersucht. Unterhalb dieses Elements befindet sich auf der p27-mrna eine zweite Domäne, die eine interne Initiation der Translation von p27 ermöglicht. Während die Translation der meisten mrnas über eine Cap-abhängige Initiation stattfinden muss, kann die p27-translation auch unabhängig von dieser 5 -Cap- Struktur erfolgen. Dies wird von einer IRES (Internal Ribosomal Entry Site) ermöglicht, die sich oberhalb des p27-initiationskodons befindet (Abb. 4). In Zellen, die sich nicht teilen, ist die Proteinsynthese reduziert. Dies wird durch die Reduktion der Initiation der Cap-abhängigen Translation erreicht. Während die meisten Proteine vermindert exprimiert werden, wird p27 in nicht-proliferierenden Zellen verstärkt vorgefunden. Hierzu trägt möglicherweise das von uns identifizierte IRES-Element bei, indem es eine Cap-unabhängige Synthese von p27 ermöglicht. So erlaubt die modulare IRES eine effiziente Expression zum Beispiel auch nach pharmakologischer Inhibition der PI3-Kinase. Dies reduziert die generelle Capabhängige Translation und damit die generelle Proteinsyntheserate, hat aber keinen Einfluss auf die Syntheserate von p27 oder künstlichen mrnas, die die IRES von p27 besitzen. Als ersten wichtige Regulator der p27-ires haben wir die verwandten RNA-bindenden Proteine HuD und HuR identifiziert. Beide Proteine können die von IRES vermittelte Translation von p27 inhibieren. Wir haben reduzierte Mengen von HuR in nicht-proliferierenden quieszenten Fibroblasten gefunden. In diesen Zellen ist p27 erhöht. Experimentelle Reduktion von HuR-Protein über sirna führt ebenfalls zu einem Anstieg von p27-protein und auch zu einen Wachstumsarrest in der G 1 -Phase des Zellzyklus. Interessanterweise reguliert HuR den Zellzyklus mindestens über zwei unterschiedliche Mechanismen: Während das Protein die Translation von p27 inhibiert, indem es an die 5 -nichttranslatierte Region der

6 6 Hengst, Ludger Regulation der Zellproliferation Tätigkeitsbericht 2003 mrna bindet, erhöht es die Stabilität der Cyclin A- und Cyclin B-mRNAs, an deren 3 -Ende sich die HuR-Bindestellen befinden. Damit kann HuR den Zellzyklus stimulieren, indem es gleichzeitig die Expression von Cyclinen fördert und die Translation von p27 inhibiert (Abb. 5). Diese durch HuR vermittelte Regulation des Wachstumsarrests funktioniert selbst in Tumorzellen. HuR könnte damit ein interessantes therapeutisches Ziel sein, um das Wachstum von Tumorzellen zu begrenzen. Wir haben begonnen, die verschiedenen Ebenen der HuR-Regulation zu untersuchen. Abb. 5: Modell der Zellzyklus-Regulation durch HuR: Das Protein inhibiert die Translation von p27 und verstärkt die Expression von Cyclin A und Cyclin B über die Stabilisierung der mrna. Neben HuR haben wir andere Proteine identifiziert, die an die regulatorischen Elemente der p27-mrna binden können. Diese wurden zum Teil biochemisch gereinigt und über Massenspektroskopie und Sequenzierungen in Kooperation mit Friedrich Lottspeichs Arbeitsgruppe am Institut identifiziert. Ein zweiter Ansatz war die Identifikation der p27 5 UTR-bindenden Proteine über einen Proteinarray. Unter anderem konnten wir mit dieser Technik das HuD-Protein identifizieren. Bei vielen anderen isolierten Proteinen handelt es sich um RNA-bindende Proteine, von denen einige bereits bestätigte Funktionen in der Translationskontrolle anderer mrnas haben. Eine mögliche Funktion der identifizierten Proteine in der Regulation der p27-translation wird derzeit untersucht. Neben den Mechanismen der Translationskontrolle von p27 untersuchen wir alternative Mechanismen, die die Funktion von p27 regulieren können. Dazu haben wir biochemisch und mit einem Hefe- Interaktionsscreen Proteine identifiziert, die an p27 binden können. Neben CDKs und Cyclinen haben wir Proteine gefunden, von denen bekannt ist, dass sie den Abbau von Proteinen der Signaltransduktion regulieren. Andere Proteine können zu einer Modifikation von p27 durch Phosphorylierung führen. Dies kann die Funktion und Stabilität von p27 beeinflussen.

7 Tätigkeitsbericht 2003 Hengst, Ludger Regulation der Zellproliferation 7 Für p27 und den verwandten Inhibitor p21 haben wir daneben Mechanismen und Regulation des nucleozytoplasmatischen Transports untersucht. Die Lokalisation der Proteine scheint ihre Stabilität mit zu beeinflussen. Um den Mechanismus des nucleo-zytoplasmatischen Transports von p27 und p21 aufzuklären, haben wir unter anderem in Heterokaryon-Tests den nuklearen Export analysiert. Beide Proteine besitzen atypische Nukleare Export Sequenzen (NES). Im Gegensatz zu anderen bekannten NES-Sequenzen wird das Binden von p27 an das Exportin Crm1 nicht durch Leptomycin B inhibiert. Neben p21 und p27 beschäftigen wir uns mit dem dritten CDK-Inhibitor dieser Familie, dem Protein p57 Kip2. Wir konnten über einen Interaktionsscreen in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae Proteine identifizieren, die an p57 binden und seine Funktion als CDK-Inhibitor beeinflussen. Die Analyse der dafür verantwortlichen molekularen Mechanismen wird derzeit durchgeführt.