Vom Fragment-Screening zu Leads für neue Alzheimer-Medikamente

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1 Diss. ETH Nr Vom Fragment-Screening zu Leads für neue Alzheimer-Medikamente A B H A N D L U N G zur Erlangung des Titels DOKTOR DER WISSENSCHAFTEN der ETH Zürich vorgelegt von Tobias Michael Bruno Kissling MSc in Chemistry, Universität Bern geboren am 12. September 1979 von Wolfwil (SO) angenommen auf Antrag von Prof. Dr. François Diederich, Referent Prof. Dr. Bernhard Jaun, Korreferent Zürich 2011

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3 Für meine Familie

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5 Danksagung Danksagung Als erstes bedanke ich mich herzlich bei Herrn Prof. Dr. François Diederich für die Möglichkeit, auf dem spannenden und herausfordernden Gebiet der Alzheimerforschung arbeiten zu können, insbesondere für die grosse Freiheit bei der Gestaltung des Projektes und die vielen wertvollen fachlichen Ratschläge. Herrn Prof. Dr. Bernhard Jaun danke ich herzlich, dass er sich bereit erklärt hat, das Korreferat zu übernehmen. Ein herzlicher Dank gilt Herrn Prof. Dr. Detlef Günther für seine wertvolle Unterstützung. Bei Bruno Bernet bedanke ich mich für die gründliche Korrektur meiner Dissertation. Michael Hennig, Martin Stahl und Hans Hilpert danke ich für die Möglichkeit einer spannenden Zusammenarbeit mit der Firma Hoffmann-La Roche. Ohne diese Zusammenarbeit wäre das vorliegende Projekt nicht möglich gewesen. Bei Walter Huber und Josianne Kohler bedanke ich mich für die aufwändigen Biacore-Messungen das schwierige Lösungsverhalten vieler Verbindungen war bei dieser Arbeit eine grosse Herausforderung. Bei Armin Ruf und David Banner bedanke ich mich für die kristallographischen Experimente sie sind ebenfalls ein elementarer Bestandteil dieses Projekts. David Wechsler und Daniel Zimmerli danke ich für ihre Expertise auf dem Gebiet der Chromatographie. Zusammen mit Martin Binder haben sie es möglich gemacht, den Stabilitätsproblemen der ersten Generation von Verbindungen auf die Spur zu kommen. Ein grosser Dank gilt auch Irma Näf, die alles Administrative bestens im Griff hat und immer sehr hilfsbereit ist. Prof. Dr. Carlo Thilgen danke ich für die Organisation der Praktika, die Betreuung von Studenten war eine lehrreiche und interessante Erfahrung. Bei Thomas Mäder bedanke ich mich für sein Engagement für die technischen Einrichtungen. Walter Amrein, Xiangyang Zhang, Louis Bertschi, Oswald Greter und Rolf Häfliger danke ich für das Messen der zahlreichen Massenspektren. Bei Prof. Dr. Bernhard Jaun, Marc-Olivier

6 Danksagung Ebert, Philipp Zumbrunnen, Rainer Frankenstein und René Arnold bedanke ich mich ausserdem für den kompetenten NMR-Service. Ein herzlicher Dank gilt auch Sandro Tonazzi, Laurent Morax, Caroline Heintz, Linus Becker, Kathrin Durrer, Yves Meur und Räff Schiess, die bei mir eine Projektarbeit oder ein OCP-2 gemacht haben, sowie den zahlreichen Studenten, welche das OCP-1 absolviert haben. Sie alle haben das Projekt synthetisch und das Labor menschlich bereichert. Ein herzlicher Dank geht auch an die Laborkolleginnen und -Kollegen aus dem G314. Es gab viele spannende Gespräche mit Bernhard Stump, Anna Vogt, Damien Polet, Shin-Ichiro Kato, Tony Wigglesworth, Wallace Wong, Fuyong Cheng, Benjamin Breiten und Andri Schütz. Andri möchte ich zusätzlich für seine Hilfsbereitschaft bei Computerfragen danken. Zudem bedanke ich mich bei zahlreichen weiteren Mitgliedern der Diederich-Gruppe für die vielen unterhaltsamen Mittagessen, Apéros, Skiwochenenden und Ausflüge. Ein ganz spezieller Dank gilt auch meiner Familie und meinen Freunden, die immer für mich da waren.

7 Poster-Präsentation Poster-Präsentation XXth International Symposium on Medicinal Chemisty, EFMC-ISMC 2008, Wien, Österreich, 31. August 4. September 2008: T. M. B. Kissling, W. Huber, A. Ruf, M. Stahl, M. Hennig, F. Diederich: From Fragments to Leads for New Alzheimer Medicines Structure-Based Design and Synthesis of Novel -Secretase Inhibitors.

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9 Inhaltsverzeichnis i Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis... i Zusammenfassung... iii Abstract... viii Abkürzungen... xiii 1. Einleitung Alzheimer Gesellschaftliche Bedeutung Biologischer und medizinischer Hintergrund Therapieansätze Sekretase Einleitung Das aktive Zentrum Flexibilität des Flaps und der S3-sub-Tasche Das Roche Needle-Screening Indolamine Einleitung und Modellierung des ersten Inhibitors Synthese des ersten Inhibitors Retrosynthese Synthese Biacore-Affinitätsmessungen und Diskussion Modellieren neuer Indolamin-Liganden Sekundäres Indolamin-Derivat Substituiertes sekundäres Indolamin-Derivat Synthese der Indolamin-Liganden Sekundäre Indolamine Substituierte sekundäre Indolamin-Derivate Biacore-Affinitätsmessungen Zusammenfassung und Ansatz für nächste Generation von Verbindungen Nächste Generation von Indolamin-Derivaten Synthese der nächsten Generation von Indolamin-Derivaten Retrosynthese verschiedener tertiärer Indolamin-Derivate... 64

10 ii Inhaltsverzeichnis Synthese Biacore-Affinitätsmessungen Zusammenfassung und Überleitung zu Tyramin-Derivaten Tyramine Einleitung Modellierung Verbindungen mit Substituenten für die S2-Tasche Verbindung mit Substituent für die S3-sub-Tasche Synthese Verbindungen mit Substituenten für die S2-Tasche Verbindung mit Substituent für die S3-sub-Tasche Biacore-Affinitätsmessungen Röntgenkristall-Struktur von 147 mit -Sekretase Aziridine und Azetidinol als neue Bindungsmotive für die katalytische Dyade Retrosynthese Synthese Biacore-Affinitätsmessungen Zusammenfassung und Ausblick Experimenteller Teil Allgemeine Bemerkungen Synthesevorschriften NMR-Daten zu Verbindungen (±)-142a und (±)-142b Literatur

11 Zusammenfassung iii Zusammenfassung Die Alzheimersche Krankheit ist eine schwere neurodegenerative Erkrankung und die häufigste Ursache für Demenz bei älteren Menschen. Bis heute gibt es kein Heilmittel gegen Alzheimer. Existierende Therapiemethoden weisen, wenn überhaupt, nur einen geringen therapeutischen Nutzen auf. Es besteht also ein grosses Bedürfnis für neue Alzheimer- Medikamente. Gemäss der Amyloid-Kaskaden-Hypothese für die Entstehung der Alzheimerschen Krankheit ist die Anhäufung von Amyloid- -peptid (A ) im Gehirn eine treibende Kraft bei der Pathogenese von Alzheimer. A entsteht beim proteolytischen Abbau von APP (amyloid precursor protein) durch -Sekretase (BACE1) und -Sekretase. Als Schlüssel-Enzym, das beim Abbau von APP die Entstehung von A einleitet, stellt BACE1 ein attraktives Ziel für die Entwicklung von neuen Wirkstoffen dar. BACE1 ist eine monomere Aspartylprotease. Die aktive Tasche liegt in der Furche zwischen dem N-terminalen und dem C-terminalen Lobus und wird bedeckt durch einen flexiblen Flap (Abb. 1). Abb. 1: Darstellung von BACE1. N-terminaler Lobus in blau, C-terminaler Lobus in rot, Ligand 8 und Flap in grün (PDB Code: 3BUH). Ein fragment screening, das von der Firma Hoffmann-La Roche durchgeführt wurde, zeigte, dass Tyramin 9 mit hoher Liganden-Effizienz in die aktive Tasche von BACE1 bindet (LE = 0.37, K D = 2000 M). Durch Oberflächenplasmonenresonanz-Messungen (Biacore)

12 iv Zusammenfassung konnten weitere Tyramin-Derivate wie beispielsweise 8, sowie ein Indolamin-Derivat (10) gefunden werden, die höhere Affinitäten zu BACE1 aufweisen. Röntgenkristallstrukturen von BACE1 im Komplex mit verschiedenen Tyramin-Fragmenten zeigten, dass das primäre Amin des Tyramins Wasserstoffbrücken zur katalytischen Dyade ausbildet und, dass Reste in ortho-position von der Phenolgruppe die S3-Tasche besetzen. Zusätzlich wurde in der S3- sub-tasche ein Thiophen-Derivat (7) gefunden (Abb. 2). Abb. 2: Wichtige Fragmente aus dem Needle Screening für den Entwurf von neuen potentiellen -Sekretase- Inhibitoren. Die Röntgenkristallstruktur mit der Tyramin-Nadel 8 diente als Ausgangspunkt für unsere Modellierungsstudien mit MOLOC. Als Grundstruktur für den Entwurf von neuen potentiellen -Sekretase-Inhibitoren verwendeten wir zunächst die Indolamin-Nadel 10, wobei wir die Annahme trafen, dass das Indolamin-Fragment einen analogen Bindungsmodus zu den Tyramin-Derivaten aufweist. Derivate mit verschiedenen Resten in 3-Position des Indols, welche einen Gewinn von Affinität in der S3-Tasche bringen sollten, sowie Derivate mit neuen Bindungsmotiven für die katalytische Dyade wurden von uns entworfen und synthetisiert, anschliessend wurden ihre Bindungseigenschaften in einem Biacore-Assay durch Roche untersucht (Abb. 3). In einer ersten Serie zeigte sich, dass das primäre Amin von 10 durch ein Azetidin ersetzt werden kann, ohne dass sich die Affinität bedeutend verändert (26). Zusätzlich wurde ein Vektor für die S3-Tasche eingeführt, dieser brachte aber nicht die erhoffte Verbesserung der Affinität. Mit den Derivaten 57 und 58 wurden weitere Substituenten für die S3-Tasche getestet, welche sich sehr eng an den Tyramin-Derivaten aus den Röntgenkristallstrukturen orientierten. Auch hier konnte jedoch keine Verbesserung der Affinität in Analogie zu den Tyraminen erzielt werden, was nahe legt, dass die Indolamine einen anderen Bindungsmodus, als die Tyramine aufweisen.

13 Zusammenfassung v Abb. 3: Biacore-K D -Werte für verschiedene Indolamin-Derivate. Im Rahmen der Synthese des entworfenen Indolamin-Zielmoleküls 38 wurde bei der Reduktion der Vorstufe 60 mit LiAlH 4 als Hauptprodukt überraschenderweise das Aziridin 61 gefunden (Abb. 4). Bei der Herstellung eines Analogons von 38 durch Alkylierung mit 2-Phenoxyethylbromid wurde hingegen kein Zyklisierungsprodukt gefunden. Es wäre spannend, zu untersuchen, wie weit sich diese Methode, welche im Rahmen dieser Arbeit auch zur Synthese von weiteren Aziridinen eingesetzt wurde, allgemein zur Synthese von Aziridinen optimieren und anwenden lässt. Verbindung 61 erwies sich als interessanteste Verbindung dieser Serie und gab den Anstoss zur Synthese des Azetidinols 89 und des Pyrrolidins 86, welche ebenfalls interessante Bindungseigenschaften aufweisen. Bei diesen zyklischen Aminen handelt es sich um interessante potentielle Bindungsmotive für Aspartylproteasen oder andere Enzyme. Abb. 4: a) LiAlH 4, THF, Rückfluss, 1.5 h.

14 vi Zusammenfassung Da, wie oben beschrieben, gewisse Zweifel am Bindungsmodus der Indolamine bestehen, wurden für weitere Zielmoleküle Tyramin 9 als Grundstruktur verwendet. Ein interessantes Teilprojekt war der Versuch, ein Tyramin-Fragment in der S1/S3-Tasche mit einem Thiophen-Fragment in der S3-sub-Tasche zu Verknüpfen. Dazu wurde auf Grundlage der Fragmente 7 und 8 das Zielmolekül (±)-146b entworfen (Abb. 5). Abb. 5: Biacore-K D -Werte für Zielmolekül 146b und diverse Derivate. Biacore-Messungen von Roche zeigten, dass das Zielmolekül (±)-146b nur wenig besser bindet, als das Diastereomer (±)-146a. Aufgrund von Modellierungsstudien legt dies nahe, dass nicht der modellierte Bindungsmodus vorliegt. Neben dem Zielmolekül (±)-146b, wurden auch noch Biacore-Messungen mit 147 und 139 durchgeführt. Beide Fragmente weisen gute Bindungseigenschaften für ihre Grösse auf. Bei einer idealen Verknüpfung könnte man für (±)-146b einen wesentlich tieferen K D -Wert als 12 M erwarten. Dies ist ein weiterer Hinweis dafür, dass (±)-146b einen anderen Bindungsmodus aufweist. Das Fragment 147 ist hingegen ein interessanter Ansatzpunkt für den Entwurf weiterer potentieller BACE1-Inhibitoren und auch eine kristallographische Untersuchung des Bindungsmodus von 139 könnte interessante neue Erkenntnisse bringen. Es gelang der Firma Hoffmann-La Roche sogar, von 147 eine Röntgenkristallstruktur in der aktiven Tasche von -Sekretase zu lösen, welche zeigt, dass der Bindungsmodus von 8 und 147 sehr ähnlich ist (Abb. 6).

15 Zusammenfassung vii Abb. 6: Überlagerung von 147 (grün) mit 8 (cyan) und Darstellung von 147 in der aktiven Tasche von -Sekretase. In einem weiteren Teilprojekt wurden, inspiriert durch die zyklischen Amine aus Abb. 3, verschiedene zyklische Amine ausgehend von 8 und 9 synthetisiert und von Roche auf ihre Bindungseigenschaften untersucht (Abb. 7). Abb. 7: Biacore- K D -Werte für verschiedene Tyramin-Derivate mit zyklischen Aminen. Während bei (±)-165 keine deutliche Veränderung des K D -Wertes im Vergleich zu 8 zu beobachten ist, weisen die anderen drei Verbindungen (160, (±)-164 und 168) sehr vielversprechende K D -Werte auf, welche eine nähergehende Untersuchung dieser Bindungsmotive interessant machen. Wie auch für andere Messserien, muss man hier jedoch noch darauf hinweisen, dass es teilweise deutliche Abweichungen bei den geschätzten K D - Werten aus verschiedenen Biacore-Messungen von Roche gab und, dass die Resultate deshalb mit einer gewissen Vorsicht zu betrachten sind. Dennoch wäre es auch hier wiederum äusserst spannend, die Bindungsmodi dieser Substanzen kristallographisch zu identifizieren. Die vorgestellten Bindungsmotive könnten sich auch für andere Aspartylproteasen oder für weitere Zwecke als vielversprechend erweisen.

16 viii Abstract Abstract Alzheimer s disease (AD) is a severe neurodegenerative disorder and the most common cause of dementia in elderly people. To this day, there is no cure for AD. Existing treatments offer if at all only small therapeutic benefits, therefore, there is an urgent need for new medicines. According to the amyloid hypothesis of AD, accumulation of amyloid -peptide (A ) is the primary influence driving AD pathogenesis. A is formed by the sequential processing of the amyloid precursor protein (APP) by -secretase (BACE1) and -secretase. Being the key enzyme that initiates the formation of A, BACE1 represents an attractive drug target. BACE1 is a monomeric aspartic protease. The active site is located in the cleft between the N-terminal and the C-terminal lobe and is covered by a flexible flap (Fig. 1). Fig. 1: Ribbon representation of BACE1. N-terminal lobe shown in blue, C-terminal lobe in red, flap and ligand 8 in green (PDB Code: 3BUH). A fragment screening, performed by F. Hoffmann-La Roche, revealed that tyramine 9 binds to the active site of BACE1 with a high ligand efficiency (LE = 0.37, K D = 2000 M). Further tyramine derivatives (e.g. 8) as well as an indolamine derivative (10) with improved binding affinities have been discovered by Roche, using surface plasmon resonance measurements (Biacore). X-ray crystal structures of BACE1 complexed with several of these compounds showed that the amine moiety of the tyramine fragments forms hydrogen bonds to the catalytic dyad and the residues located in ortho-position of the phenol moiety occupy the

17 Abstract ix S3 pocket. Additionally, a thiophene fragment (7) has been found in the S3 sub-pocket (Fig. 2). Fig. 2: Basic information for the design and synthesis of novel -secretase inhibitors. The X-ray crystal structure with tyramine needle 8 served as starting point for our modeling studies using MOLOC. Initially we used indolamine needle 10 as basic structure for the design of novel -secretase inhibitors, assuming the indolamine fragment having a binding mode analogous to the tyramine derivatives. Compounds with different residues in 3-position of the indole moiety intended to gain affinity in the S3 pocket as well as derivatives with novel binding motifs for the catalytic dyad have been designed and synthesized. The binding properties of these compounds have subsequently been studied in a Biacore assay by Roche (Fig. 3). Fig. 3: Biacore K D values for various indolamine derivatives. In a first series of compounds, it has been shown that the primary amine of 10 can be replaced by an azetidine moiety without considerably changing the affinity (26). Additionally, a vector for the S3 pocket has been introduced, however not bringing the anticipated increase of

18 x Abstract affinity. Compounds 57 and 58 served to investigate further residues for the S3 pocket in closer analogy to the tyramine fragments of the X-ray crystal structures. These vectors did not bring the gain in affinity hoped for in analogy to the tyramines either which suggests that the binding mode of the indolamines may be different from the one of the tyramines. In the course of the synthesis of the designed target molecule 38, during reduction of the precursor compound 60 using LiAlH 4, surprisingly aziridine 61 was observed as the main product (Fig. 4). However, synthesizing an analogue of 38 via alkylation of the precursor with 2-phenoxy ethyl bromide, no cyclization product was found. It would be interesting, to investigate, how far this method, which has been used for the synthesis of further aziridines in the course of this project, can be optimized and applied generally for the synthesis of aziridines. Compound 61 turned out to be the most promising of this series and gave impetus to the synthesis of azetidinol 89 and pyrrolidine 86 which also show interesting binding properties. These cyclic amines present interesting potential binding motifs for aspartic proteases and other enzymes. Fig. 4: a) LiAlH 4, THF, Reflux, 1.5 h. Since, as described above, there is some doubt about the binding mode of the indolamines, tyramine 9 was used as basic scaffold for further target molecules. An interesting subproject was the attempt to link a tyramine fragment in the S1/S3 pocket with a thiophene fragment in the S3 sub-pocket. For this purpose, target molecule (±)-146b has been designed on the basis of fragments 7 and 8 (Fig. 5).

19 Abstract xi Fig. 5: Biacore K D values for (±)-146b and various derivatives. Biacore measurements by Roche revealed that target molecule (±)-146b shows only somewhat stronger binding to -Secretase than diastereomer (±)-146a. This indicates that the binding mode of these compounds may not be in accordance with the proposed binding mode based on modeling studies. Alongside target molecule (±)-146b, compounds 147 and 139 have been tested in the Biacore assay as well. Both fragments show good binding properties for their size. In case of an ideal fragment linking, a substantially lower K D value than 12 M could be expected for (±)-146b. This is another evidence for a different binding mode of (±)-146b compared to the one proposed based on modeling. In contrast, fragment 147 is an interesting starting point for the design of prospective BACE1 inhibitors. Hoffmann- La Roche successfully solved an X-ray crystal structure of fragment 147 in the active site of -secretase which proves that the binding mode of 147 is very similar to the binding mode of 8 (Fig. 6). A crystallographic exploration of the binding mode of 139 could disclose further valuable insights. Fig. 6: Overlay of 8 (cyan) and 147 (green) as well as illustration of 147 in the active site of -secretase.

20 xii Abstract In a further subproject, inspired by the cyclic amines depicted in Fig. 3, several cyclic derivatives of 8 and 9 have been synthesized and their binding properties have been analyzed by Roche (Fig. 7). Fig. 7: Biacore K D values for various tyramine derivatives with cyclic amine moieties for the catalytic dyad. Whereas no significant improvement of the K D value of (±)-165 compared to the K D value of the primary amine analogue 8 is observable, the other three compounds 160, (±)-164, and 168 show very promising K D values which encourage a closer exploration of these binding motifs. However, it has to be pointed out that in this series of Biacore measurements as well as in other series in some cases significantly different K D values for the same compound have been obtained by Roche in different single measurements, wherefore the results have to be estimated with caution. Nevertheless, also for these molecules, it would be very interesting to identify the binding modes by crystallography. The presented binding motifs could prove to be valuable for different aspartic proteases as well as for other purposes.

21 Abkürzungen xiii Abkürzungen C Grad Celsius 9-BBN 9-Borabicyclo[3.3.1]nonan Å Angström (1 Å = m) A Amyloid- -Peptid Abb. Abbildung Ac Acetyl ACE-Cl -Chloroethylchloroformat APLP APP-like protein APP Amyloid-Vorläuferprotein (engl.: amyloid precursor protein) Äq. Äquivalent arom. aromatisch AS Aminosäure BACE -site APP-cleaving enzyme BC Blitzchromatographie ber. berechnet bzgl. bezüglich d Tag DMA N,N-Dimethylanilin DMF N,N-Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid dppf Diphenylphosphinoferrocen EA Elementaranalyse EI Electron Impact ESI Electro Spray Ionization Et Ethyl FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer gef. gefunden ges. gesättigt h Stunde HIV Human Immunodeficiency Virus HR High Resolution

22 xiv Abkürzungen IC 50 concentration of inhibitor producing 50% inhibition [1] IR Infrarotspektroskopie K i Inhibitionskostante [1] K D konz. LC Lit. LRP M M MALDI min MRI MS Ms NMR org. PDB PG Ph PrP C PrP Sc PSGL-1 Py RLBA RT RP RV SAR Smp. THF TMS wässr. Dissoziationskonstante konzentriert Liquid Chromatography Literaturstelle Low-density lipoprotein receptor-related protein Molar Molekül Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Minute Magnetic Resonance Imaging Massenspektroskopie Methansulfonyl Nuclear Magnetic Resonance organisch Protein Data Bank Schutzgruppe Phenyl zelluläres Prionprotein Scrapie Prionprotein P-selectin glycoprotein ligand-1 Pyridin Radio Ligand Binding Assay Raumtemperatur Reversed Phase Rotationsverdampfer Structure Activity Relationship Schmelzpunkt Tetrahydrofuran Tetramethylsilan wässrig

23 Alzheimer 1 1. Einleitung 1.1 Alzheimer In der Schweiz leiden über 100'000 Menschen an Demenz [2], weltweit sind etwa 37 Millionen Menschen betroffen [3]. Alzheimer ist die wichtigste Form von Demenzerkrankung, sie ist verantwortlich für rund 70% aller Demenzfälle [4]. Die Krankheit wurde 1907 von Alois Alzheimer ( ) in einer Fallstudie beschrieben [5] und bereits 1911 vom bekannten Psychiater Emil Kraepelin in einem Lehrbuch nach seinem Schüler Alois Alzheimer benannt [6]. Die Alzheimersche Krankheit ist eine grosse Belastung für die Patienten und ihre Angehörigen, sie führt auch zu erheblichen Pflegekosten. Bisher gibt es keine Therapien, die zu einer Heilung der Krankheit führen; bestenfalls ermöglichen die zur Verfügung stehenden Medikamente eine Verzögerung des Krankheitsverlaufs. Die Entwicklung von neuen Medikamenten, welche das Fortschreiten der Krankheit effizient stoppen können, ist deshalb von immenser Bedeutung Gesellschaftliche Bedeutung Die Alzheimersche Krankheit ist von zunehmender Bedeutung in unserer Gesellschaft. Dank der modernen Medizin erreichen die Menschen eine immer höhere Lebenserwartung. Dies hat aber in Verbindung mit tiefen Geburtenraten eine Veränderung der demographischen Verteilung zur Folge, die oft als Überalterung der Gesellschaft bezeichnet wird. Die Häufigkeit des Auftretens der alzheimerschen Krankheit nimmt mit steigendem Alter immer stärker zu (Tabelle 1.1) [4, 7], die Prävalenzrate verdoppelt sich etwa alle 5 Altersjahre. Die Alzheimersche Krankheit kann, in ihrer präsenilen Form, bereits im Alter von Jahren auftreten. Diese genetisch bedingte Form der Krankheit ist jedoch selten, sie ist nur für rund 1 2% der Fälle verantwortlich [8]. Ab einem Alter von Jahren steigen die jährliche Inzidenzrate, sowie die Prävalenz jedoch steil an. Man spricht in diesem Fall von der senilen Form von Alzheimer.

24 2 Alzheimer Altersgruppe [Jahre] Mittlere Prävalenzrate [%] Mittlere Inzidenzrate pro Jahr [%] Tabelle 1.1 Prävalenz und Inzidenz von Demenzen nach Altersgruppen, adaptiert aus [7]. Der massive Anstieg der Prävalenz von Demenz bei den älteren Patienten ist hauptsächlich auf die Alzheimersche Krankheit zurückzuführen [4], andere Formen der Demenz wie zum Beispiel vaskuläre Formen der Demenz oder die Parkinsonsche Krankheit spielen dabei eine untergeordnete Rolle. Demenzerkrankungen sind ein zentrales Problem des schweizerischen Gesundheits- und Sozialwesens [9]. Die Alzheimersche Krankheit stellt inzwischen die vierthäufigste Todesursache nach Herz-Kreislaufleiden, Krebs und Schlaganfall dar. Die bemerkbare Krankheitsdauer beträgt im Durchschnitt 7 9 Jahre. In der Schweiz leiden über 100'000 Menschen an Demenz [2]. Ungefähr 40% der Betroffenen leben in Alters- und Pflegeheimen und 60% leben zu Hause. Beide Gruppen sind auf Betreuung durch Angehörige und oder Pflegepersonal angewiesen. Neben dem Leid für die Betroffenen und ihre Angehörigen verursacht die Krankheit auch beträchtliche Kosten. Eine Studie [10] berechnete die Gesamtkosten für das Jahr 1998 auf über 3 Milliarden Franken. Die Kosten für das Jahr 2007 werden bereits auf 6.3 Milliarden Franken geschätzt [2]. Die grössten Kostenblöcke sind die von Angehörigen geleistete Pflege, sowie die Alters- und Pflegeheimaufenthalte Biologischer und medizinischer Hintergrund Die Alzheimerschen Krankheit ist eine neurodegenerative Hirnerkrankung, deren Ursachen noch nicht vollständig geklärt sind. Die Degeneration von Synapsen und der Tod von Neuronen führen zu einem Schrumpfen der betroffenen Hirnregionen [11]. Es handelt sich dabei speziell um Regionen, die in Lern- und Gedächtnisprozesse, sowie das emotionale

25 Alzheimer 3 Verhalten involviert sind. Das Gehirn von Alzheimer-Patienten enthält charakteristische Ablagerungen die so genannten amyloiden Plaques und neurofibrilläre Faserbündel, die auch Tangles genannt werden. Die amyloiden Plaques bestehen aus extrazellulären amorphen Aggregaten von Amyloid- -Peptid (A ) [12]. Gehirnregionen, in denen Plaques gefunden werden, weisen typischerweise eine reduzierte Zahl von Synapsen auf und Neuriten, die mit Plaques assoziiert sind, sind häufig geschädigt. Aufgrund dieser Erkenntnisse geht man davon aus, dass A die Synapsen und Neuriten schädigt. Gemäss der Amyloid-Hypothese [13] ist die Akkumulation von A im Gehirn die primäre treibende Kraft der Alzheimer- Pathogenese. Es wird vermutet, dass der weitere Krankheitsprozess, wie die Bildung der neurofibrillären Faserbündel, auf ein Ungleichgewicht zwischen Produktion und Abbau von A zurückzuführen ist [14]. Dies macht den Prozess der A -Entstehung zu einem interessanten Target für die Entwicklung neuer Therapien Amyloide Plaques A Bei den amyloiden Plaques handelt es sich um pathologische, amorphe Proteinablagerungen aus A im Gehirn. Ähnliche Ablagerung findet man in Gehirnen von Menschen, die an Prionen-Erkrankungen, wie zum Beispiel der Creutzfeld-Jakob-Krankheit, leiden [15]. Anstelle der Bildung von A durch proteolytische Spaltung des Membranproteins APP (amyloid precursor protein) bei der Alzheimerkrankheit, wird bei Prionen-Krankheiten das maligne Scrapie Prionenprotein PrP Sc aus dem zellulären Prionprotein PrP C gebildet. A ist zytotoxisch, dies konnte anhand von kultivierten Neuronen in vitro und in vivo bei Retinazellen nachgewiesen werden [16]. Durch vorangehende Behandlung der Zellen mit Vitamin E konnte die schädigende Wirkung reduziert werden, was dafür spricht, dass die zellschädigende Wirkung zumindest teilweise auf freie Radikale zurückzuführen ist. Neuere Erkenntnisse von Soscia et al. [17] zeigen, dass A antimikrobielle Eigenschaften aufweist, die Wissenschaftler schliessen daraus, dass A möglicherweise eine Funktion im natürlichen Immunsystem wahrnimmt. Forschern ist es gelungen, amyloide Plaques bei transgenen Mäusen mittels MRI (Magnetic Resonance Imaging) sowohl mit [18], als auch ohne [19] die Verwendung eines Kontrastmittels nachzuweisen. Letztere Methode könnte unter Anderem bei der Diagnose von Alzheimer eine Bedeutung erlangen.

26 4 Alzheimer Entdeckung der amyloiden Plaques Der Begriff Amyloid wurde im Jahre 1854 vom deutschen Wissenschaftler Rudolph Virchow ( ) eingeführt [20]. Virchow führte Iod-Färbungen an Gehirn-Präparaten mit abnormalem makroskopischem Erscheinungsbild durch. Er beobachtete dabei eine Blau- Färbung, die bei Zugabe von Schwefelsäure nach violett umschlug. Er schloss daraus, dass es sich bei der Substanz, die der makroskopischen Veränderung zugrunde liegt, um Zellulose handelt und gab ihr den Namen Amyloid nach dem griechischen amylon (Stärke). Im Jahre 1859 zeigten Nikolaus Friedreich und August Kekulé schliesslich, dass Amyloid nicht aus Kohlenhydraten, sondern aus Proteinen besteht. Im Verlaufe der Zeit wurden zahlreiche Krankheitsbilder entdeckt, die mit amyloiden Ablagerungen einhergehen. Darunter fallen unter anderem die A -Ablagerungen bei der Alzheimerschen Krankheit Entstehung von A proteolytischer Abbau von APP zu A Das Amyloid-Vorläuferprotein APP ist ein integrales Membranprotein mit einer Transmembran-Domäne, einem kurzen zytoplasmatischen C-Terminus und einem grossen extrazellulären, glykosylierten N-Terminus [11, 21]. APP wird in verschiedenen Isoformen mit Längen von 695 bis 770 Aminosäuren gebildet. Im Gehirn kommt APP695 am häufigsten vor, es unterscheidet sich von den längeren Formen darin, dass ihm in der Ektodomäne eine Protease-Inhibitor-Sequenz vom Kunitz-Typ fehlt. Die A -Sequenz liegt auf der Zelloberfläche, bzw. auf der lumenalen Seite der ER- und Golgi-Membran. Drei verschiedene Sekretasen sind in den proteolytischen Abbau von APP involviert -, - und -Sekretase. Die Identität der -Sekretase ist noch nicht vollständig geklärt, Kandidaten sind TACE (tumor necrosis factor- -converting enzyme), ADAM9 und ADAM10 (a disintegrin and metalloproteinase). Die -Sekretase, welche APP in der Transmembran-Region schneidet, ist ein Komplex aus den vier verschiedenen Proteinen Presenilin, Nicastrin, APH-1 (anterior pharynx-defective 1) und PEN-2 (presenilin enhancer 2). Die Aspartyl-Protease BACE1 ( -site APP-cleaving enzyme 1, Memapsin2, Asp2) wurde von verschiedenen Gruppen als -Sekretase identifiziert [22-26]. Meist wird APP sequentiell durch - und - Sekretase gespalten, dann entstehen das lösliche sapp und C83, woraus durch die -

27 Alzheimer 5 Sekretase das kleine p3-peptid abgespalten wird. Wenn jedoch APP erst durch -Sekretase prozessiert wird, entstehen sapp und C99 aus dem die -Sekretase A 40 oder A 42 freisetzt (Abbildung 1.1). Oligomerisierung und Ablagerung von A 42 führen gemäss der Amyloid- Kaskaden-Hypothese schliesslich zu den verheerenden Schädigungen im Gehirn von Alzheimerpatienten. Abbildung 1.1 Darstellung des Abbaus von APP, Bild nach [11] Die Amyloid-Kaskaden-Hypothese Bereits im Jahre 1992 wurde von Hardy und Higgins die Amyloid-Kaskaden-Hypothese [13] aufgestellt und mit der Zeit durch die Beiträge zahlreicher Forscher immer weiter verfeinert

28 6 Alzheimer (Abbildung 1.2) [14, 27, 28]. Die Hypothese geht davon aus, dass die Schädigungen im Gehirn und die daraus resultierende Demenz von Alzheimerpatienten letztlich auf Störungen im APP/A 42-Stoffwechsel zurückzuführen sind. Überproduktion, verminderter Abbau oder erhöhte Aggregation von A 42 können verschiedene Ursachen haben. Einige Fehlfunktionen sind auf Mutationen in den APP-, Presenilin 1- oder Presenilin 2-Genen zurückzuführen, dies kann zu der erblichen frühen Form der Alzheimerschen Krankheit führen. Andere Störungen sind nicht erblich bedingt, ihre Ursachen sind noch nicht vollständig geklärt. Diese führen zu der häufigeren senilen Form der Alzheimer-Krankheit. Überproduktion, verminderter Abbau oder erhöhte Aggregation von A 42 A 42 Oligomerisierung und Deposition als diffuse Plaques Erste Effekte von A 42-Oligomeren auf die Synapsen Mikrogliale und astrozytische Aktivierung Progressive Schädigung von Synapsen und Neuriten Veränderte neuronale ionische Homöostase, oxidative Schädigungen Veränderte Kinase/Phosphatase-Aktivitäten Tangles Verbreitete neuronale und neuritische Dysfunktion und Apoptose geschädigter Zellen Demenz Abbildung 1.2 Die Amyloid-Kaskaden-Hypothese, adaptiert aus.[14, 27, 28].

29 Alzheimer Therapieansätze Bisherige Medikamente Die bisherigen Medikamente können den Krankheitsverlauf nicht stoppen. Sie behandeln nicht die Ursache der Krankheit, sondern mildern nur die Symptome. Die Neuronen, welche Glutamat oder Acetylcholin als Neurotransmitter verwenden, scheinen besonders stark geschädigt zu werden. Serotonin- und Norepinephrin-abhängige Neuronen werden jedoch auch beeinträchtigt [11]. Die wichtigsten gegenwärtig vermarkteten Medikamente können in zwei Gruppen eingeteilt werden, dies sind die Cholinesterase-Inhibitoren und die N-Methyl- D-Aspartat-Rezeptor-Antagonisten (NMDA). Bereits in den 70er Jahren des zwanzigsten Jahrhunderts wurde entdeckt, dass Alzheimer- Erkrankte abnormale Neurotransmitter-Spiegel im Gehirn aufweisen [29]. Die Acetylcholin- Spiegel sind zu niedrig, deshalb soll durch Inhibition der Cholinesterase in cholinergen Neuronen der Abbau von Acetylcholin reduziert und damit seine Konzentration in den Synapsen erhöht werden. Der bekannteste NMDA-Rezeptorantagonist ist Memantin. Es ist ein spannungsabhängiger, nicht kompetitiver Antagonist mittlerer Affinität [30]. Memantin blockiert die Wirkung pathologisch erhöhter tonischer Konzentrationen von Glutamat. Normalerweise blockiert Mg 2+ den NMDA-Rezeptor-assoziierten Kalziumkanal. Die Bindung von Glutamat führt jedoch dazu, dass Mg 2+ den Kanal freigibt und Ca 2+ einströmen kann. Eine chronisch erhöhte Glutamat-Konzentration im synaptischen Spalt führt zu einem exzessiven Kalzium-Einstrom in die Zelle, was langfristig zellzerstörend wirkt. Man bezeichnet diesen Sachverhalt als Exitotoxizität. Der Nutzen dieser beiden Typen von Medikamenten ist umstritten. Gemäss einer 2004 publizierten Studie ist Donezepil ein Cholinesterase-Inhibitor nicht kosteneffektiv und bringt kaum Vorteile bezüglich des Gesundheitszustands der Patienten [31]. Auch für Memantin gibt es gemäss dem britischen NICE (National Institute for Health and Clinical Excellence) nicht genügend Hinweise auf eine gute Wirksamkeit [32]. Inzwischen gibt es Hinweise, dass eine Kombinationstherapie von Donepezil mit Memantin zu einer

30 8 Alzheimer Verbesserung führt bei Patienten mit mittelschwerer bis schwerer Alzheimer-Krankheit [33]. Bisher gibt es jedoch keine Therapien, welche die Ursachen und nicht nur die Symptome der Krankheit bekämpfen. Die erhältlichen Medikamente sind weder dazu in der Lage, bereits eingetretene Störungen zu mildern, noch das Fortschreiten der Krankheit zu stoppen. Neue, effizientere Behandlungsmethoden sind deshalb dringend erforderlich und Gegenstand intensiver Forschung [34] Strategien zur Entwicklung neuer Medikamente Eingriff in den Abbau von APP Sekretasen als Targets Gemäss der Amyloid-Kaskaden-Hypothese ist ein übermässiges Vorkommen von A 42 die hauptsächliche Ursache für die Entstehung von Demenz bei Alzheimerpatienten. Die drei Sekretasen, - - und -, sind in den Abbau von APP involviert und bieten sich deswegen als potentielle Targets für die Entwicklung neuer Medikamente an [35-37] Sekretase Eine Prozessierung von APP durch die -Sekretase schliesst die Bildung von A zum vornherein aus. Eine Stimulation des APP-Abbaus durch die -Sekretase könnte daher zu einer Reduktion des A -Spiegels führen. Die genaue Identität der -Sekretase ist aber noch unklar [11]. Zudem geht man davon aus, dass sie in den Abbau mehrerer Substrate involviert ist, was sie bezüglich Toxizität und Nebenwirkungen allfälliger Inhibitoren zu einem riskanten Target macht Sekretase Bei der -Sekretase [11, 35-37] handelt es sich um einen Komplex aus mindestens vier Membranproteinen. Sie besteht aus den Proteinen Presenilin, Nicastrin, APH1 und PEN2. Das aktive Zentrum scheint auf Presenilin zu liegen, das in einem Loop in 2 Fragmente

31 Alzheimer 9 geschnitten wird, welche anschliessend als Heterodimer assoziiert bleiben. Presenilin enthält zwei katalytische Aspartate im Transmembranbereich, von denen auf jedem der beiden Fragmente je eines zu finden ist. Man geht davon aus, dass Presenilin APP nach einem Aspartyl-Protease-Mechanismus schneidet. Die anderen 3 Proteine sind mit dem Presenilin- Heterodimer assoziiert und sind für die Protease-Aktivität erforderlich. Normalerweise schneidet -Sekretase rund 90% des APP zwischen Val40 und Ile41 (A - Nummerierung), dabei entsteht A 40. Rund 10% des APP wird zwischen Ala42 und Thr43 gespalten, wobei das gefährlichere A 42 entsteht. Es werden auch noch weitere A - Varianten wie zum Beispiel A 39 und A 43 gebildet, jedoch nur in sehr geringen Anteilen. Es wurden bereits dutzende Mutationen von Presenilin gefunden, die bei der frühen Alzheimer-Form relevant sind [35]. Alle bisher gefundenen Mutationen verursachen eine spezifische Steigerung der A 42-Produktion. Dies unterstreicht die Bedeutung einer Reduktion der A 42-Produktion für die Behandlung von Alzheimer. Nichtsteroidale Antirheumatika (NSAR) können die Spezifität der -Sekretase so modulieren, dass der A 42- Anteil reduziert wird [38] und stattdessen mehr von der kürzeren Isoform A (1-38) gebildet wird. Durch die Verabreichung von Ibuprofen konnte bei mutierten Mäusen der A 42- Spiegel in deren Gehirnen reduziert werden. Ein grosses Problem bei der Verwendung von -Sekretase als Target für Medikamente ist die Tatsache, dass die -Sekretase neben der Spaltung von APP zu A auch noch in andere Prozesse involviert ist [11]. Ein weiteres wichtiges Substrat der -Sekretase ist Notch-1, ein Zelloberflächen-Rezeptor, der unter anderem bei der Entwicklung von vielen Organsystemen von Bedeutung ist. Experimente mit Presenilin-Knockout-Mäusen haben gezeigt, dass diese schwere Defekte des Skeletts und des zentralen Nervensystems aufweisen [39]. Homozygote Knockout-Mutanten sind nicht überlebensfähig. Spätere Untersuchungen an konditionalen Knockout-Mäusen [40], bei denen Presenilin nur im postnatalen Vorderhirn inaktiviert ist, haben gezeigt, dass diese lebensfähig sind, die Tiere weisen allerdings gewisse kognitive Defizite beim räumlichen Langzeitgedächtnis auf. Ihre A -Produktion ist reduziert und das C-terminale Fragment von APP wird akkumuliert. Diese Mausmodelle stellen in Frage, ob eine Inhibition der -Sekretase ohne schwere Nebenwirkungen überhaupt möglich ist. Eine Modulation der Aktivität, wie sie bei NSAR beobachtet wurde, ist möglicherweise eher ein gehbarer Weg.

32 10 Alzheimer Inzwischen wurden verschiedene -Sekretase-Inhibitoren und -Sekretase-Modulatoren gefunden, welche gegenwärtig in klinischen Studien erforscht werden. Einige Verbindungen befinden sich gegenwärtig (Stand 20. Juni 2011) in Phase II [41], zum Beispiel der Inhibitor BMS [42, 43] und der Modulator CHF-5074 [44] BACE1 Im Jahre 1999 wurde die Transmembran-Aspartyl-Protease BACE1 (kurz: BACE), auch Memapsin2 oder Asp2 genannt, von verschiedenen Gruppen erstmals als -Sekretase identifiziert [22-26]. Die -Sekretase ist zusammen mit der -Sekretase für die Entstehung von A verantwortlich und folglich eines der Haupt-Targets zum Eingriff in die hypothetische Amyloid-Kaskade. Die -Sekretase spaltet APP auf der lumenalen Seite der Membran. Anschliessende Spaltung durch die -Sekretase führt zur Freisetzung von A. Eine Inhibition der -Sekretase würde folglich die Entstehung von A von vornherein unterbinden. Es gibt einige Begebenheiten, welche BACE1 zu einem attraktiven Target für die Entwicklung neuer Alzheimermedikamente machen [45]. Die Tatsache, dass über die Biologie der -Sekretase relativ viel bekannt ist, bietet eine solide Grundlage. Es gibt Knockout-Mausmodelle [46, 47], die zeigen, dass einerseits die -Sekretase für die Bildung von A essentiell ist, andererseits die Tiere dennoch gesund und fruchtbar sind. Diese Erkenntnisse geben Anlass zur Hoffnung, dass eine Inhibition der -Sekretase ohne mechanismus-inhärente Toxizität möglich sein dürfte und stellen eine erste Validierung von BACE1 als Target für die Entwicklung neuer Alzheimermedikamente dar. Weitere Studien mit transgenen Mäusen mit humaner -Sekretase sowie Knockout-Mäusen [48, 49] zeigten, dass beide Maus-Linien lebensfähig und fruchtbar sind. Die Tiere wiesen jedoch, verglichen mit normalen Mäusen, einige interessante Unterschiede in ihren Verhaltensmustern auf. Die transgenen Mäuse, welche BACE überexprimierten, wiesen einen erhöhten 5- Hydroxytryptamin-Turnover (Serotonin) auf, waren neugieriger und weniger ängstlich als normale Mäuse. Dies ist konsistent mit der bekannten Korrelation zwischen Ängstlichkeit und gesenktem 5-Hydroxytryptamin-Turnover [50]. -Sekretase-Knockout-Mäuse wiesen

33 Alzheimer 11 hingegen einen ängstlicheren, weniger neugierigen Phänotyp auf. Diese Erkenntnisse zeigen eine Verbindung zwischen BACE1, der serotonergen Neurotransmission und dem Verhalten auf. Aufgrund dieser Ergebnisse ist es möglich, dass auch beim Menschen bei einer Inhibition der -Sekretase Angststörungen auftreten könnten. Die Autoren weisen jedoch ausdrücklich darauf hin, dass bei den Versuchstieren die -Sekretase entweder komplett fehlte, oder aber eine starke Überexpression stattfand, bei einer Inhibitor-Therapie beim Menschen jedoch die Protein-Expressionslevel kaum verändert würden und die Enzymaktivität durch einen Inhibitor nicht unbedingt vollständig unterdrückt würde. Eine in vitro Studie hat gezeigt, dass BACE1 die primäre -Sekretase in Neuronen ist [51] und Studien mit Gehirn-Präparaten von frisch verstorbenen Alzheimer-Patienten brachten zum Vorschein, dass der A -Level mit der -Sekretase-Aktivität korreliert [52]. Diese Befunde stützen die Annahme, dass die hypothetische Amyloid-Kaskade durch Inhibition der - Sekretase unterbrochen werden kann. Neben APP wurden noch weitere Substrate von BACE1 gefunden. Bei den bisher identifizierten Substraten handelt es sich um die APP homologen APLP1 und 2 [53], eine membrangebundene Sialyltransferase [54-56], das Protein PSGL-1, welches bei Entzündungsreaktionen eine wichtige Rolle bei der Adhäsion von Leukozyten an Endothelzellen spielt und um das Membranprotein LRP [57]. Es ist noch unklar was für Implikationen diese BACE1-Substrate für die Anwendung von BACE1-Inhibitoren haben. Die Modelle mit den Knockout-Mäusen suggerieren jedoch, dass eine Inhibition ohne schwere Nebenwirkungen beim Menschen durchaus möglich sein kann. Die Tatsache, dass bereits für andere Aspartyl-Proteasen [58], wie die HIV-Protease oder Renin [59], erfolgreich Inhibitoren entwickelt werden konnten, ist ermutigend. Es gibt einige HIV-Protease-Hemmer, die heute im Handel erhältlich sind, so zum Beispiel Saquinavir, Ritonavir und Indinavir [60, 61]. Bei beiden oben genannten Proteasen hat das strukturbasierte Design mit Hilfe von Röntgenstrukturen eine wichtige Rolle gespielt. Auch von BACE1 wurden zahlreiche Kristallstrukturen gelöst, die erste wurde im Jahre 2000 publiziert [62], sie zeigt die -Sekretase im Komplex mit dem peptidischen Inhibitor OM99-2 (PDB: 1FKN). Zu Beginn dieser Doktorarbeit standen allein in der PDB [63] 9 Kristallstrukturen zur Verfügung (Stand: 7. April 2005), darunter 2 Apo-Strukturen und 7 Strukturen mit gebundenen Inhibitoren (Tabelle 1.2). Seither wurde eine grosse Zahl neuer Strukturen in der PDB zur Verfügung gestellt. Heute findet man in der PDB mit der

34 12 Alzheimer Suchanfrage beta secretase 167 Strukturen (Stand: 20. Juni 2011). Diese eindrückliche Zunahme von neuen Strukturen zeigt, welch grosse Bedeutung der Forschung nach neuen Alzheimermedikamenten beigemessen wird. Neben den publizierten Strukturen existieren noch zahlreiche Strukturen, die in der Pharma-Industrie gelöst wurden und nicht öffentlich zugänglich sind. PDB-Struktur Lit. Auflösung [Å] Inhibitor 1FKN [62] 1.90 Ja 1M4H [64] 2.10 Ja 1SGZ [65] 2.00 Nein 1W50 [66] 1.75 Nein 1W51 [66] 2.55 Ja 1TQF [67] 1.80 Ja 1XS7 [68] 2.80 Ja 1XN2 [69] 1.90 Ja 1XN3 [69] 2.00 Ja Tabelle 1.2 Röntgenstrukturen der -Sekretase in der PDB (Stand 7. April 2005) [63]. Mit Hilfe dieser strukturellen Informationen sollte es durch Analyse der aktiven Tasche und der Bindungsmodi der Liganden möglich sein, gezielt selektive, nicht-peptidische Inhibitoren der -Sekretase zu entwerfen. Da beim Menschen nur relativ wenige Aspartyl-Proteasen existieren, und da die aktive Tasche von BACE1 offener und weniger hydrophob ist, als die anderer Aspartyl-Proteasen, sollte auch das Problem der Selektivität lösbar sein. Zu Beginn dieses Projekts, sind bereits einige Inhibitoren der -Sekretase publiziert worden [62, 66-78], es handelt sich dabei jedoch vorwiegend um peptidomimetische Inhibitoren, die sich aufgrund ihrer pharmakologischen Eigenschaften nicht als Medikamente eignen würden. Mittels mit einem Trägerpeptid konjugierten peptidischen Inhibitoren, welche die Blut-Hirn- Schranke überwinden können, konnte an transgenen Mäusen in vivo gezeigt werden, dass die Inhibition von BACE zu einer Reduktion des A -Spiegels in Plasma und Gehirn führt [79-81]. Durch diese Beobachtungen konnte BACE auch in vivo als Target für die Reduktion von A validiert werden und es wurde gezeigt, dass transgene Mäuse für die Untersuchung der -Sekretase-Inhibition ein geeignetes Model sind. Für eine erfolgreiche Entwicklung von Inhibitoren, die als Medikamente brauchbar wären, ist es jedoch erforderlich, kleine, relativ

35 Alzheimer 13 lipophile Wirkstoffe zu finden, da diese oral verabreichbar sein sollten und die Blut-Hirn- Schranke überwinden können müssen. Inzwischen wurden zahlreiche Kristallstrukturen mit nichtpeptidischen BACE1-Inhibitoren in der PDB publiziert. Eine Auswahl von Verbindungen mit vielfältigen Grundgerüsten ist in Abbildung 1.3 abgebildet. Die meisten dieser Verbindungen, so verschieden sie auch sind, haben die Gemeinsamkeit, dass sie alle an die katalytische Dyade von BACE1 binden, so zum Beispiel das neuartige zyklische Sulfon-Hydroxyethylamin-Dipeptidisoster 1 aus 3PI5 [82], das 2-Aminobenzimidazol 2 aus 3MSL [83], das 2-Amino-3,4-dihydrochinazolin 3 aus 2Q15 [84], das Pyrrolyl-2-aminopyridin 4 aus 3L38 [85] und das Pyridinyl-aminohydantoin 5 aus 3LHG [86]. Das Aminopyrimidin 6 aus 3EXO [87] stellt hier eine grosse Ausnahme dar, indem es überhaupt nicht an die katalytischen Aspartate bindet. Stattdessen bindet es via das Sulfonamid an Gly230, welches ebenfalls Teil des aktiven Zentrums von BACE1 ist. Abbildung 1.3: Inhibitoren aus publizierten Röntgenkristallstrukturen mit vielfältigen Grundgerüsten.

36 14 Alzheimer Mit zwei -Sekretase-Inhibitoren wurden klinische Tests der Phase I durchgeführt [41]. Es handelt sich um CTS von CoMentis [88] und HPP854 von High Point Pharmaceuticals [89] BACE2 BACE2 [90, 91], auch Asp1 oder Memapsin1 genannt, ist ein Homologes von BACE1. Es ist jedoch nicht mit der -Sekretase zu verwechseln, welche im Gehirn für die proteolytische Spaltung von APP an der -Stelle verantwortlich ist! Das Expressionsmuster [92] von BACE2 unterscheidet sich wesentlich von demjenigen von BACE1. BACE2 mrna wird in den meisten peripheren Geweben des Menschen nur auf tiefem Niveau exprimiert, speziell auch im Gehirn wurden sehr niedrige oder nicht detektierbare mrna-konzentrationen gefunden, was darauf hindeutet, dass BACE2 nicht in den Abbau von APP zu A involviert ist. Höhere Expressions-Level wurden im Darm, den Nieren, der Bauchspeicheldrüse, der Plazenta, der Prostata, dem Magen und der Luftröhre gefunden. Eine Arbeit von Casas et al. legt nahe, dass BACE2 in den Insulinstoffwechsel in der Bauchspeicheldrüse involviert ist [93]. Ein möglicher Zusammenhang von Diabetes und Alzheimer wird von Akter et al. diskutiert [94]. In einer Studie von Ahmed et al. wurde die enzymatische Aktivität von BACE1 und BACE2 in Gehirnproben von Verstorbenen untersucht [95]. Die BACE2- Aktivität wies dabei im Gegensatz zu BACE1 keinen signifikanten Zusammenhang mit der A -Konzentration auf und es wurde kein signifikanter Unterschied von BACE2 in Alzheimer-Gehirnen im Vergleich zu normalen Gehirnen gefunden, während die BACE1- Aktivität in Alzheimergehirnen deutlich erhöht war. Sie schliessen daraus, dass BACE1 höchstwahrscheinlich hauptverantwortlich für die A -Produktion im Gehirn ist und dass ein Beitrag von BACE2 unwahrscheinlich sei. Zu Beginn dieser Arbeit war noch keine Röntgenstruktur von BACE2 in der PDB publiziert, die Struktur wurde jedoch modelliert [96]. Das Modell zeigt eine sehr grosse Ähnlichkeit der Topologie mit BACE1. Einer der Hauptunterschiede ist, dass im Modell bei BACE2 nur 2 Disulfidbrücken gefunden wurden, während bei BACE1 deren 3 existieren. Es wurden auch einige feine Unterschiede im Bereich der aktiven Tasche gefunden. Diese dürften es erlauben, Inhibitoren zu entwickeln, die eine gute Selektivität für BACE1 gegenüber BACE2 aufweisen, was für die Entwicklung von Medikamenten von Bedeutung ist. Ostermann et al.

37 Alzheimer 15 haben 2006 die bislang einzige (Stand 17. Mai 2011) Röntgenstruktur von BACE2 publiziert [97]. Tierversuche mit BACE1-Knockout-Mäusen [98] haben gezeigt, dass die Expression von BACE2 nicht kompensatorisch hochreguliert wird, daraus lässt sich schliessen, dass es nicht erforderlich ist, BACE2 zusätzlich zu BACE1 zu inhibieren. Versuche mit BACE1/BACE2-Doppelt-Knockout-Mäusen könnten erste Hinweise darüber geben, ob eine Inhibition beider -Sekretasen zu Nebenwirkungen führt. Solche Studien wurden bereits durchgeführt [99, 100]. Anscheinend sind die BACE1/BACE2-Doppelt-Knockout-Mäuse fruchtbar, rund die Hälfte der Tiere stirbt jedoch bereits in den ersten drei Lebenswochen, was möglicherweise auf eine besondere Anfälligkeit auf Infektionen zurückzuführen ist [100]. In Anbetracht dieser Resultate ist eine selektive Inhibition von BACE1 gegenüber BACE2 unter Umständen erforderlich. Experimente mit in vivo Inhibition von BACE1 und BACE2 mit selektiven und nicht selektiven Inhibitoren könnten weitere Erkenntnisse zu dieser Problematik bringen Weitere Therapieansätze Neben den bereits erwähnten Ansätzen existieren noch diverse andere [36, 37]. So haben epidemiologische Studien gezeigt, dass sich der langfristige regelmässige Konsum von NSAR günstig auf das Alzheimerrisiko auswirken kann [101]. Es wurde ebenfalls entdeckt, dass an Mikrotubuli bindende und diese stabilisierende Medikamente wie das Krebsmedikament Paclitaxel einen günstigen Einfluss auf neurodegenerative Krankheiten wie Alzheimer haben könnten [102]. Eine weitere Studie hat gezeigt, dass Gleevec die A -Produktion inhibiert [103]. Senkung der BACE-Genexpression mittels sinas [104] und Verhinderung der Aggregation von A 42 zu den pathogenen Fibrillen [105] sind weitere Strategien. Es gibt auch Studien mit diversen pflanzlichen Wirkstoffen, die einen günstigen Einfluss bei der Prävention oder Therapie von Alzheimer haben könnten. Dies sind zum Beispiel Gingko biloba-extrakte [106] oder Cannabinoide [107]. Eine französische Studie hat ein reduziertes Alzheimerrisiko bei Wein-Konsumenten aufgezeigt, die Ursache könnte im Gehalt von Flavonoiden und der antioxidativen Wirkung von Wein liegen [108]. Eine vielversprechende Verbindung ist zudem Epigallocatechingallat [41, 109], welche unter anderem in Grüntee zu finden ist. Mit diesem Catechin laufen zahlreiche klinische Studien für die mögliche Anwendung gegen verschiedenste Krankheiten. Unter anderem eine Phase II/III Studie zur