Bericht über die beim Internationalen Angelman-Treffen in Paris 2014 vorgestellten Arbeiten
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- Rüdiger Lorentz
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1 Bericht über die beim Internationalen Angelman-Treffen in Paris 2014 vorgestellten Arbeiten Die Monoamin-Transporter als Ziel für CaMK2alpha: Auswirkungen auf das Angelman- Syndrom Monoamine transporters as targets of CaMK2alpha: Implications for Angelman Syndrome Harald H. Sitte, Ph.D. (Österreich) Das Nervensystem ist das wichtigste Organ für die Manifestationen (Ausprägungen) des Angelman- Syndroms. Wir haben kürzlich beobachtet, dass der Mangel an Ube3A die Aktivität des Dopamin- Transporters in den dopaminergen Neuronen verändert (Steingellner et al., J.Biol. Chem., 2012). Dann sind wir dazu übergegangen, einen anderen Aspekt zu prüfen, nämlich dasjenige Phänomen, derentwegen das Angelman-Syndrom oft von Kollateraleffekten (Nebeneffekten) auf das serotoninerge System begleitet wird und welches die prinzipiellen Faktoren sind, die eine autistische Symptomatik verursachen. So wie für das dopaminerge System, haben wir untersucht, ob der Serotonin-Transporter, der oft in die Ausprägung der autistischen Symptomatik mit einbezogen ist, und das serotoninerge System an sich ein Target (Ziel) für die klinische Medikation darstellen könnten. Der Serotonin-Transporter ist bekannt als Target (Ziel) für eine Gruppe unterschiedlicher Medikamente bei verschiedenen Krankheitsbildern (wie z.b. bei der Depression). Im Verlauf des Vortrages wurde kurz der aktuelle Stand der Untersuchung zusammen mit einem Überblick über die Möglichkeiten basierend auf der Einbeziehung des serotoninergen Systems bei Angelman-Syndrom vorgestellt. Modelle, um die Funktion des UBE3A/E6AP zu studieren Model systems to study UBE3A/E6AP Function Ben Distel, Ph.D. (Niederlande9 Das Gen UBE3A codiert das E6AP für die Ubiquitinligase, weswegen die mangelnde Funktionstüchtigkeit des Ubiquitinierung-Prozesses (= Übertragung von Ubiquitin auf ein anderes Molekül), welcher von E6AP an die Targets vermittelt wird, als Ursache des Angelman-Syndroms betrachtet wird. Obwohl einige potentielle Targets für E6AP bekannt sind, ist es nötig zu zeigen, ob eines (und welches) dieser Target zur Ausprägung des Angelman-Syndroms beiträgt. Deswegen ist die Identifikation des/der kritischen (entscheidenden) Target/s des E6AP und die Kenntnis ihres mechanistischen (fast automatisch) Beitrags zur Pathologie der erste Schritt in Richtung der Entwicklung einer Therapie für des Angelman-Syndrom. Mittels eines Screening- Systems auf Basis des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems (Yeast Two-Hybrid System) haben wir kürzlich verschiedene Proteine, die mit E6AP interagieren (sich gegenseitig beeinflussen), identifiziert (UB3EA) (UIPs), einschließlich eines Proteins, welches bekanntermaßen eine Intelligenzminderung, die der bei Angelman-Syndrom ähnelt, verursacht sowie ein Protein, welches am Transport in den Gehirnvesikeln (Gehirnbläschen) beteiligt ist. Um zu bestätigen, ob diese Proteine tatsächlich das Target der E6AP sind, haben wir exakte Instrumente, die uns erlauben: 1) die direkte physische Interaktion dieser Proteine mit E6AP zu bewerten; 2) festzulegen, wie ihre Ubiquitinierung und Stabilität von der Aktivität des E6AP abhängt. Es wurde die Validierung dieser Instrumente und die anfängliche Charakterisierung der mit E6AP interagierenden Proteine, welche kürzlich identifiziert worden sind, vorgestellt. Zusätzlich wurde diskutiert, wie diese Instrumente eingesetzt werden können, um innovative zielgerichtete Ansätze zu entwickeln, damit neue neuronale Substrate und Aktivatoren des E6AP identifiziert werden können.
2 Eine entscheidende Rolle des UBE3A in der Entwicklung des Gehirns A critical role for UBE3A in brain development Ype Elgersma, Ph.D. (Niederlande) Ype hat in seiner Präsentation eine Aktualisierung über die Forschungslinien bezüglich des Angelman-Syndroms geliefert. Er hat sich insbesondere auf die Daten des Mausmodells mit Angelman-Syndrom konzentriert, in welchem es nämlich möglich ist, das Gen UBE3A jederzeit zu aktivieren. Seine Experimente legen nahe, dass einige Phänotypen (Erscheinungsbild eines Organismus ), wenn auch nicht alle, der Angelman-Maus reversibel (wieder umkehrbar) sind, wenn das Gen des Tiers im postnatalen (direkt nach der Geburt) Alter aktiviert wird. Dies zielt darauf hin, dass es ein kritisches (spezielles) Fenster gibt, in dem man die Reversibilität erreichen kann und dass das kritische Fenster nicht für alle Phänotypen das gleiche ist. Imprinting-Mechanismen des UBE3A-Gens Mechanisms of UBE3A imprinting Angela Mabb, Ph.D. (USA) Das Angelman-Syndrom wird durch genetische Deletionen oder Mutationen in der mütterlichen Kopie des UBE3A-Gens hervorgerufen. In den Neuronen wird die mütterliche Kopie exprimiert (genetische Expression = Form, wie die genetische Information eines Gens zum Ausdruck kommt), die väterliche ist stumm. Eine mögliche Therapie für Patienten mit Angelman-Syndrom besteht darin, die Expression der väterlichen Kopie des UBE3A wieder herzustellen und zwar durch pharmakologische Mittel. Dank leistungsstarker Imaging-Tests (bildgebendes Verfahren) haben wir einige Pharmazeutika Topoisomerase-Hemmer - identifiziert (bereits von der FDA anerkannt/food and Drug Administration), die die väterliche Kopie des UBE3A-Gens bei Mäusen aktiviert. Dies geht davon aus, die Expression des UBE3A-Gens bei Patienten mit Angelman-Syndrom normalisieren zu können. Dies bietet eine einzigartige therapeutische Gelegenheit. Wir haben versucht, die Reaktivierung des UBE3A-Gens mittels direkter Manipulationen der Topoisomerase zu erforschen, sowie mittels Topoisomerase-Hemmer, viraler Transduktion und Linien von transgenen Mäusen. Die Ausarbeitung dieser Studien hat uns ein klareres Bild davon gegeben, wie die Topoisomerase die Aktivität des UBE3A-Gens regelt und hat uns erlaubt, die Wirkung der Manipulationen der Topoisomerase während der Gehirnentwicklung besser zu verstehen. Unsere Entdeckungen zielen darauf ab festzulegen, ob die Topoisomerase-Hemmer geeignete Kandidaten für klinische Studien bei Angelman-Syndrom sind. Charakterisierung der Mutationen des UBE3A-Gens in Patienten mit Angelman-Syndrom Characterization of UBE3A Mutations in Angelman Patients Silvia Russo, Ph.D. (Italien) Mutationen und offensichtliche Deletionen im UBE3A-Gen umfassen ca. 10% der Defekte des Angelman-Syndroms - charakterisiert durch ein mentale Störung, ein spezielles EEG, fehlende Sprache, Ataxie (Koordinationsstörung der Bewegungen) und glückliches Wesen. Das Gen kodiert für die Ubiquitinligase das E6AP und ist Subjekt für das genetische Imprinting mit einer mütterlichen spezifischen Expression im Gehirn, genauer gesagt in den Nerven. Davon abgesehen verursachen die mütterlichen interstitiellen Duplikationen des Chromosoms 15q11-13 Autismus. Bei einer Gruppe von 163 Patienten mit einer genetisch gesicherten Diagnose des Angelman-Syndroms haben wir 41 verschiedene Mutationen des UBE3A im Gen identifiziert. Der größere Teil der Sequenz-Alterationen sind Abbrüche, eine ist ein Defekt im Spleißen (Weiterverarbeitung der RNA), 3 sind Frame-Shift-Mutationen (Verschiebung des Leserasters von Genen auf der DNA) und 6
3 Variationen an Missense-Mutationen (den Sinn verändernde Punktmutation). Mit dem Ziel, das Verhältnis Genotyp-Phänotyp (Genotyp = gentische Ausstattung eines Organismus ) zu identifizieren, ist der Nonsense-mediated mrna decay in den Abbruchmutationen analysiert worden. Dieser wird von einer Nonsense-RNA verursacht und führt zu Abbruchmutationen (Nonsense-RNA = Punktmutation, die zum Abbruch der Proteinsynthese führt // Decay = Untergang, Zerfall). Die Planungen und Modellbildung der Missense-Mutationen wird in Zukunft diskutiert. Die Missense-Mutationen zu beschreiben, kann helfen, den ausschlaggebenden Punkt des Proteins Ube3a zu entdecken. Die Rolle des UBE3A in den Modellen des Angelman-Syndroms: Die Regulierung der Homöostase des Proteins UBE3A in model systems of Angelman-Syndrome: Regulation of protein homeostasis Ugo Mayer, Ph.D (Spanien) Das Niveau der Ubiquitinligase E3 (UBE3A) ist entscheidend für die richtige Entwicklung und das Funktionieren des Gehirns. Das Angelman-Syndrom entsteht durch einen Mangel dieses Proteins im Gehirn. Die Forschung ist dabei zu vertiefen, welche Proteine im Gehirn durch das UBE3A reguliert werden. Indem wir eine für die Isolierung, die Identifikation und die Validation der Substrate der Ubiquitinierung in einem Modell der Drosophila-Fliege eine innovative Technik einsetzen, haben wir die unmittelbare Ubiquitinierung der Rpn10 durch das Ube3a identifiziert, ein Shuttle-Faktor des Protosomen und drei andere Proteine. Nur das Rpn10 ist gegen die Degradation nach der Ubiquitinierung durch das UBE3A gerichtet und so nimmt man an, dass die Degradation nicht der einzige Effekt des Ube3a auf seine Substrate sein kann. Zusätzlich haben wir die genetische in vivo- Interaktion (in vivo = im lebendigen Organismus) zwischen dem Ube3a und dem C-Ende des Rpn10 identifiziert. Die übermäßige Expression dieser Proteine führt zu einer Anhäufung dieser Ubiquitin- Proteine, was letztendlich die Interaktion auf dem biochemischen Niveau, welche man in den Nervenzellen erhalten hat, ausmacht. Mittels unserer Maus bioub, die kürzlich entwickelt und hier eingesetzt wurde, um die Targets der Ubiquitinierung für ein spezifische E3-Ligase im Kontext des internen Organismus zu charakterisieren, sind wir aktuell an einem Projekt dran, die molekularen Mechanismen, welche beim Angelman-Syndrom unterbrochen sind, zu charakterisieren. Der Einsatz menschlicher, pluripotenter induzierter Stammzellen, um ein Modell für das Angelman-Syndrom zu schaffen Using human induced pluripotent stem cells to model Angelman Syndrome Stormy J. Chamberlain (USA) Während man von den Mausmodellen mit Angelman-Syndrom viel lernen kann und auch schon gelernt hat, kann es Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen geben, die nicht berücksichtigt werden, wenn man sich ausschließlich auf die Mausmodelle konzentriert. Wir haben pluripotente menschliche Stammzellen (ipsc = Stammzellen, die sich zu vielen unterschiedlichen Zellen weiter entwickeln können) von Personen mit Angelman-Syndrom erhalten. Die ipsc, die sich auf dem funktionalen Niveau befinden, welches dem embryonalen menschlichen Stammzell-Niveau entspricht, können in Neuronen umgewandelt werden. So können wir das Angelman-Syndrom in menschlichen, lebenden Nervenzellen studieren, die in vitro ( im Reagenzglas ) auf einer Platte wachsen. Wir nutzen diese Nervenzellen mit Angelman-Syndrom für drei prinzipielle Ziele: 1.) Um zu verstehen, wie sich das Imprinting des Ube3a in den Nerven stabilisiert. 2.) Die Veränderungen in der Expression des neuronalen Gens, welches das Angelman-Syndrom begleitet, zu verstehen. 3.) Mögliche Therapien für das Angelman-Syndrom zu testen.
4 In Richtung einer Therapie für das Angelman-Syndrom mittels des Knockdowns einer repressiven, nicht verschlüsselten RNA Arthur L. Beaudet, M.D. (USA) Das Angelman-Syndrom ist eine schwere Pathologie der Gehirnentwicklung, verursacht durch einen Mangel an Imprinting des UBE3A-Gens. Obwohl die molekularen Mechanismen des mütterlichen Genmangels verschiedene sind, haben alle Patienten mit Angelman-Syndrom mindestens eine Kopie des väterlichen UBE3A-Gens, welches stumm, aber intakt ist. Unser Ziel ist es, die Expression des UBE3A-Gens zu korrigieren, indem man das väterliche Allel (Zustandsform eines Gens) als Therapie für das Angelman-Syndrom aktiviert. Das UBE3A-ATS ist das Antisense -Transcript des UBE3A-Gens, welches die Expression des UBE3A-Gens in die negative Richtung regelt. Indem wir diese Antisense-RNA bei Mäusen gekappt haben, konnten wir zeigen, dass die Elimination des Ube3a-ATS ausreichend ist, um die Expression des väterlichen Ube3a zu aktivieren und die Defekte im Phänotyp des AS-Mausmodells wiederherzustellen, einschließlich der motorischen Probleme, der kognitiven Schwierigkeiten und des langfristig reduzierten Ausbaus in den Neuronen. Um das UBE3A beim Angelman-Syndrom wiederherzustellen, haben wir versucht, das väterliche UBE3A mittels eines Knockdowns des UBE3A-ATS mit Antisense-Oligonukleotiden (ASO) zu aktivieren. Mittels eines Screenings von in vitro kultivierten Neuronen haben wir mit Erfolg einige ASO, welche vollständig das väterliche UBE3A bei Mäusen aktivieren können, identifiziert. Im Unterschied zu der Behandlung mit Topoisomerase-Hemmern sind die ASO spezifisch und haben nur einen minimalen Effekt auf die väterlichen Gene, die sich in der Nachbarschaft von SNRPN, SNORD115 und SNORD116 befinden. Wir haben dann die Effekte der ASO in vivo (in lebenden Organismen) mittels intracerebroventricolärer Injektionen (= Injektionen in den Gehirnventrikel) untersucht. Im Vergleich zu Tieren, die mit PBS behandelt worden waren, zeigten die Mäuse, welche mit den ASO behandelt worden waren, 4 Wochen nach der Injektion ein bedeutendes Knockdown der UBE3A-ATS und eine Aktivierung des väterlichen UBE3A-Gens im Cortex und in anderen Gehirnregionen. Dies legt nahe, dass die ASO in vivo funktionieren. Die aktuellen Studien zielen daraufhin ab, letzte Details in der mechanistischen Sichtweise der repressiven Funktion der UBE3A-ATS zu liefern, um eine phänotypische Verbesserung im Maus- Modell mit Angelman-Syndrom zu erreichen, indem man dem zentralen Nervensystem die ASO verabreicht und spezifische ASO identifiziert, die für den Menschen in der Behandlung des Angelman-Syndroms angewandt werden können. Selektive Reaktionen des UBE3A-Gens in einem Maus-Modell mit Angelman-Syndrom Targeted Reaction of UBE3A in a Mouse model of Angelman Syndrome David Segal (USA) Das Angelman-Syndrom wird verursacht durch einen Verlust der Expression des mütterlichen UBE3A in den Neuronen des Zentralnervensystems. Unser Thema ist es, das väterliche UBE3A, welches wegen der Expression des Transcripts eines Antisense-UBE3A-AT stumm ist, zu reaktivieren. Wir setzen die künstlichen Transkriptionsfaktoren (ATF) vom Typ Zinkfinger ein, die so programmiert werden können, dass sie eine spezifische Stelle der DNA anbinden können. An einem Regler der Aktivierung oder der Repression anhaftend können die ATF die Aktivität der Transkription erhöhen oder unterdrücken. Es wurde ein ATF-Repressor entwickelt, um das UBE3A- ATS zum Verstummen zu bringen. Dies dahingehend, dass dieser ATF-Repressor als gereinigtes Protein mittels intraperitonealer Injektionen injiziert wird, er die Blut-Hirn-Schranke überwindet und die Expression des UBE3A in den Neuronen eines Mausmodells mit Angelman-Syndrom aktiviert. Unser aktueller Fortschritt und unsere Projekte für die zukünftige Entwicklung dieses Ansatzes werden weiterhin diskutiert.
5 Klinische Tests mit Levodopa appliziert bei Angelman-Syndrom: Ziele, Methodik, Bewertungskriterien und Follow-up (nachträgliches Prüfen bezüglich der Wirksamkeit) Clinical trial of levodopa applied to Angelman Syndrome: Objectives, methodology, assessment criterials and follow-up issues Perrine Charles, M.D., Ph.D. (Frankreich) Das Angelman-Syndrom ist eine genetische Pathologie der Gehirnentwicklung, welches charakterisiert ist durch gravierende Lern-Probleme, Ataxie, epileptische Anfälle (mit einem charakteristischem EEG) und einem glücklichen Verhalten, für welches im Moment noch keine spezifische Behandlung existiert. Die Tiermodelle erlauben uns, die Pathophysiologie der Krankheit besser zu verstehen. In heterozygoten (mischerbig) Mäusen mit einer Mutation des UBE3A-Gens mütterlicherseits vererbt kann die menschliche Pathologie wirklichkeitstreu reproduziert werden: Die motorischen Defizite können der Dysfunktion der Substantia Nigra zugeschrieben werden (Mulherkar et al., 2010) Die Probleme im Verhalten korrelieren mit der gestörten Aktivität des Dopamin-Systems (Verminderung der Freilassung von Dopamin in der Substantia Nigra und Erhöhung der Freilassung an Dopamin im Mesolimbischen System) (Riday et al., 2012) Die falsche Regulierung der CaMK2 ( Ca2+/Calmodulin-abhängige Proteinkinase II ) ist eine der molekularen Ursachen für das Defizit im neurologischen Verhalten (Weeber et al., 2003) Die neurologischen Defizite können durch eine Reduktion der inhibitorischen (hemmenden) Phosphorilation des alpha CaMK2 verringert werden Die Behandlung auf der Basis des Levodopa ist auch imstande, die Autophosphorilation des alphacamkii zu normalisieren (Picconi et al., 2004) Zusätzlich hat Harbord 2001 berichtet, dass die Parkinsonsymptomatik in 2 Erwachsenen mit Angelman-Syndrom auf Levodopa reagierte. Die extrapyramidalen (Bewegungssteuerung außerhalb des pyramidalen Systems) Symptome waren nicht den Pharmazeutika zuzuordnen und haben sich durch die Therapie auf der Basis von Levodopa drastisch verbessert. Diese Entdeckungen können zur Entwicklung neuer therapeutischer Ausblicke für das Angelman- Syndrom hinführen. Treviso im Oktober 2014 Tommaso Prisco/Präsident des OR.S.A. ORGANIZZAZIONE SINDROME DI ANGELMAN (Übersetzt von Christel Kannegießer-Leitner: Wegen der besseren Lesbarkeit wurden nicht alle Begriffe ins Deutsche übersetzt und wegen des besseren Verständnisses wurde versucht, deren Übersetzung in kursiv in Klammern anzufügen)
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