Eignet sich PlGF in der Frühschwangerschaft als Marker für die Entwicklung einer Präeklampsie?

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1 fhg Zentrum für Gesundheitsberufe Tirol GmbH Lehrgang zur Weiterbildung Master of Biomedical Sciences Eignet sich PlGF in der Frühschwangerschaft als Marker für die Entwicklung einer Präeklampsie? Masterarbeit VerfasserIn: Sabine Legner, BSc BetreuerIn: Dr. Maria Elisabeth Mustafa-Korninger Innsbruck, im Juni 2014

2 Danksagung Wenn diese Masterarbeit auch meine Handschrift trägt, so ist sie gewiss nicht die Arbeit einer einzelnen Person, sondern ein Zusammenspiel eines für mich großartigen Teams. Allen voran gilt mein besonderer Dank Frau Dr. Maria Elisabeth Mustafa- Korninger, die mich mit sehr viel persönlichem Engagement, wissenschaftlichem Tiefgang und vielen Ideen durch meine Arbeit begleitet und mir diese Ausbildung ermöglicht hat. Für die Wertschätzung und das Schaffen der Rahmenbedingungen, diese Studie durchführen zu können, bedanke ich mich bei Herrn Dr. Hans Richter und Herrn Dr. Hans-Georg Mustafa. Wann immer es für mich erforderlich war aus dem laufenden Dienstbetrieb freigespielt werden zu müssen, wurde mir das stets von meinen Arbeitskolleginnen und kollegen ermöglicht. Auch dafür möchte ich mich bedanken. Für die Bereitstellung der Daten, sei es medizinisch durch Herrn Dr. Dietmar Moosburger und seinem Praxisteam oder auf die statistische Art und Weise durch Herrn Mag. Gerald Lirk, bedanke ich mich herzlich bei ihnen. Danke sage ich auch zu meiner Lehrgangsleiterin Mag. a Heidi Oberhauser, die mir stets mit Rat und Tat zur Seite stand. Abschließend gilt mein Dank auch meinen Studienkolleginnen, ganz besonders Doris Mayerl und Andrea Stampfli für die freundschaftliche Zusammenarbeit. 2

3 Inhaltsverzeichnis 1 Abstract Zusammenfassung Einleitung Allgemeine Grundlagen Angiogenetische Faktoren Weitere Biomarker Hypertensive Schwangerschaftserkrankungen Definitionen Pathogenese der Präeklampsie Plazentation bei der Präeklampsie VEGF-Familie bei der Präeklampsie Weitere Überlegungen Klinischer Verlauf Langzeitfolgen Risikofaktoren Material und Methoden PlGF (Roche Diagnostics, Mannheim) sflt1 (Roche Diagnostics, Mannheim) sflt1/plgf-ratio (Roche Diagnostics, Mannheim) PAPPA (Thermo Fisher Scientific, B R A H M S GmbH, Hennigsdorf) PAPPA (Roche Diagnostics, Mannheim) Statistik Ergebnisse

4 7 Diskussion Literaturverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Einverständniserklärung der Patientinnen Anhang

5 1 Abstract Is PlGF in early pregnancy a marker for the risk of preeclampsia? VerfasserIn: Sabine Legner, BSc BetreuerIn: Dr. Maria Elisabeth Mustafa-Korninger Studiengang: Master of Science of Biomedical Sciences Keywords: preeclampsia, plgf, sflt-1, pappa, trophoblast, biomarker, hypertension Preeclampsia is a hypertensive disorder in pregnancy. There are many studies with different statements to identify an elevated risk of preeclampsia. PlGF is one that implies our following questions: 1. Is it possible to predict the risk of preeclampsia by measuring a PlGF value only once in 7 9 weeks of gestation? 2. Is it possible to identify the risk of preeclampsia by measuring PlGF result in several weeks of gestation? 3. Is it possible to increase the predictive value of PlGF combinig with results of PAPPA and sflt1? 4. Is it possible to increase the detection of the risk of preeclampsia by combining PlGF with body mass index (BMI) and blood pressure? The aim of this study is to evaluate the collected data of pregnant women respective to our questions. We collect blood samples of 200 pregnant women in a prospecitve cohort study from to Following data were included: maternal age, BMI, blood pressure, PAPPA and PlGF in the weeks 7 9, PlGF in the weeks and and PlGF, sflt1 and sflt1/plgf-ratio in the weeks There was a significant correlation between PAPPA and PlGF at the first blood collection. Between all PlGF-measurements there was a significant association except between the first and the fourth time of blood collection. There was no significant correlation between sflt1 and PAPPA and PlGF at any time of blood collection. BMI and blood pressure showed no significant association. A baby of one of our patients was affected by IUGR. The date we obtained from our patients showed a big range of PlGF values. This observation leads us to the conclusion, that using PlGF testing to estimate the risk of developing preeclampsia needs several measurement in several weeks of gestation. 5

6 2 Zusammenfassung Eignet sich PlGF in der Frühschwangerschaft als Marker für die Entwicklung einer Präeklampsie? VerfasserIn: Sabine Legner, BSc BetreuerIn: Dr. Maria Elisabeth Mustafa-Korninger Studiengang: Master of Science of Biomedical Sciences Keywords: preeclampsia, plgf, sflt-1, pappa, trophoblast, biomarker, hypertension Bei der Präeklampsie handelt es sich um ein Syndrom, das nur in der Schwangerschaft vorkommt. Laut WHO gehört sie zu den hypertensiven Schwangerschaftserkrankungen. In vielen Studien finden sich kontroverse Aussagen, ob die Messung von placenta growth factor (PlGF, PGF) in der Frühschwangerschaft eine Risikostratifizierung für die Entwicklung einer Präeklampsie erlaubt. Daraus haben sich für uns folgende Fragen ergeben: 1. Ist der PlGF-Wert, der in der Frühschwangerschaft erhoben wird (Schwangerschafswoche (SSW) 7 9), aussagekräftig genug, um eine Präeklampsie vorhezusagen? 2. Kann durch die Bestimmung mehrerer PlGF-Werte im Verlauf der Schwangerschaft eine Aussage darüber getroffen werden, ob ein erhöhtes Risiko, eine Präeklampsie zu entwickeln, besteht? 3. Kann die Aussage der Bestimmung des PlGF-Wertes durch die Einbeziehung des pregnancy-associated plasma protein A (PAPPA) erhöht werden? 4. Kann durch die Einbeziehung physikalischer Messwerte wie body mass index (BMI) und Blutdruck die Abschätzung des Risikos für eine Präeklampsie weiter erhöht werden? Ziel dieser Studie ist, die erhobenen Werte von graviden Probandinnen bezüglich unserer Fragestellungen auszuwerten. In einer prospektiven Kohortenstudie wurden vom bis insgesamt 200 Probandinnen beobachtet. Folgende Parameter wurden erhoben und in die Berechnungen eingeschlossen: Alter, BMI, Blutdruck, PAPPA und PlGF in SSW 7 9, PlGF jeweils in SSW und 17 18, sowie PlGF, sflt1 und sflt1/plgf-ratio in SSW Es konnte eine signifikante Korrelation zwischen PAPPA und PlGF bei der ersten Blutabnahme gefunden werden. Zwischen den PlGF-Werten aller vier Blutabnahmen konnte ein signifikanter Zusammenhang gefunden werden außer zwischen der ersten und vierten Blutabnahme. Keine signifikante Korrelation wurden zwischen sflt1 und PAPPA und den PlGF-Werten gefunden werden. Zwischen BMI und Blutdruck konnte keine signigikante Assoziation gefunden werden. Im Probandinnenkollektiv fand sich eine Patientin mit einer IUGR. Durch die große Bandbreite der erhobenen Werte ist eine Abgrenzung des Normalkollektivs von Risikopatientinnen schwer möglich. Daher erscheint uns die Bestimmung eines einzigen PlGF-Wertes für die Risikostratifizierung einer Präeklampsie ungeeignet. 6

7 Einleitung 3 Einleitung Die Präeklampsie ist ein Syndrom, das nur in der Schwangerschaft vorkommt und gehört laut WHO zu den hypertensiven Schwangerschaftserkrankungen [1]. Die Erkrankung ist bis heute eine der Hauptursachen für maternale und fetale Morbidität und Mortalität [1 61]. Die Präeklampsie ist verantwortlich für bis maternale Todesfälle pro Jahr weltweit [6,62], sowie für bis zu 40 % der fetalen Todesfälle [37] und 15 % aller Frühgeburten [5,63]. 20 % der Kosten für die neonatale Versorgung auf einer Intensivstation werden durch die Präeklampsie verursacht [64]. Die Inzidenz wird unterschiedlich beschrieben und reicht von 0,4 bis 8 % [2 5,7,10,11,13,15,18 20,23 25,29,31 40,43,44,47,48,53,54,56 63,65 72], in einigen Arbeiten reichen die Zahlen bis zu 22 % [1,9,12,39,73]. Die hohen Prozentzahlen sind wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass in den Entwicklungsländern die Prävalenz der Präeklampsie deutlich höher ist oder diese nicht eindeutig von anderen Ursachen differenziert wird. Ein erhöhtes Risiko für eine Präeklampsie konnte auch bei Patientinnen mit Blasenmole beobachtet werden [34,74,75]. Die genaue Pathogenese ist bisher nicht geklärt, obwohl bisher sehr viel und in unterschiedlichste Richtungen geforscht wurde und wird. Bei der Auswertung der Daten finden sich viele kontroverse Aussagen. Aus diesem Grund haben wir uns folgende Fragen gestellt: 1. Ist der placenta growth factor (PlGF, PGF [76])-Wert, der in der Frühschwangerschaft erhoben wird (Schwangerschaftswochen (SSW) 7 9), aussagekräftig genug, um eine Präeklampsie vorherzusagen? 2. Kann durch die Bestimmung mehrerer PlGF-Werte im Verlauf der Schwangerschaft eine Aussage darüber getroffen werden, ob ein erhöhtes Risiko eine Präeklampsie zu entwickeln, besteht? 7

8 Einleitung 3. Kann die Aussage der Bestimmung des PlGF-Wertes durch die Einbeziehung des pregnancy-associated plasma protein A (PAPPA) [77] erhöht werden? 4. Kann durch die Einbeziehung physikalischer Messwerte wie body mass index (BMI) und Blutdruck die Abschätzung des Risikos für eine Präeklampsie weiter erhöht werden? Im Rahmen einer prospektiven Kohortenstudie wurden gravide Probandinnen beobachtet und die erhobenen Parameter ausgewertet. 8

9 Grundlagen 4 Allgemeine Grundlagen Die Angiogenese ist ein komplexer Prozess, der verschiedene Schritte beinhaltet, wie die Migration und Proliferation von Endothelzellen [78]. Während der Entwicklung des Embryos wird die Neubildung der Blutgefäße des Embryos und der Plazenta durch unterschiedliche Faktoren gesteuert. Involviert sind angiogenetische Faktoren, die das Gefäßwachstum entweder stimulieren oder inhibieren können. Zur am besten erforschten Gruppe gehört die vascular endothelial growth factor-(vegf)-familie. [79] 4.1 Angiogenetische Faktoren Die Angiogenese wird durch die VEGF-Familie [12,79,80], Angiopoietine und Erphine reguliert [81]. Die VEGF-Familie besteht aus verschiedenen Wachstumsfaktoren mit den entsprechenden Rezeptoren. Durch die Bindung des Faktors an den passenden membranständigen Rezeptor wird die intrazelluläre Signaltransduktion induziert. Die zelluläre Antwort je nach induziertem Signalweg ist die Proliferation, die Migration oder die Neubildung der Blutgefäße. Zu den angiogenetischen Wachstumsfaktoren gehören VEGF (auch VEGFA [79,82]), placenta growth factor (PGF, PlGF [76]), FMS-related tyrosine kinase 1 (FLT1, VEGFR1 [83]) und seine soluble Form (sflt1, svegfr1 [83]), Endoglin (ENG [84]), sowie dessen lösliche Form (seng [84]) und transforming growth factor-β (TGF-β, TGFB ) [10]. Die Schlüsselmoleküle VEGFA, PlGF, FLT1 und kinase insert domain receptor (KDR, VEGFR2 [85]) werden von der Plazenta während der Schwangerschaft gebildet [43,86]. PlGF, ein Mitglied der VEGF-Familie [87,88], wurde 1991 erstmals beschrieben [78,79]. Die Isoformen, die durch alternatives Splicing des Homodimers entstehen, wurden in den Jahren 1993 und 1997 beschrieben [79,87]. Damals entdeckte man die Isoformen PlGF1 (PlGF 131 ), PlGF2 (PlGF 152 ) [12,43,88] und PlGF3 (PlGF 203 ) [43,79,80]. Die Zahl steht für die Anzahl der Aminosäuren. Die genaue Funktion war damals nicht bekannt 9

10 Grundlagen [87]. Die Aminosäurensequenz von PlGF ist zu 42 % ident mit VEGFA [43,79,89]. Später wurde eine weitere Isoform entdeckt, nämlich PlGF4 (PlGF 224 ). Die Isoformen unterscheiden sich hinsichtlich ihren Sekretionseigenschaften und ihrer Bindungsaffinität [43]. In der weiteren Arbeit werden die einzelnen Isoformen nicht berücksichtigt. PlGF ist ein Homodimer [2] und wird hauptsächlich in der Plazenta gebildet [90]. Dies konnte durch immunhistochemische Untersuchungen gezeigt werden [87]. PlGF wird aber auch in Herz, Lunge [43], Gefäßmuskelzellen, inflammatorischen Zellen, Knochenmarkzellen, Neuronen und einigen Tumorzellen exprimiert [81]. VEGF und PlGF können auch Heterodimere bilden, die die Proliferation der Endothelzellen fördern [87,91]. Während der Schwangerschaft nimmt die Konzentration von PlGF im Blut normalerweise bis zum dritten Trimenon zu [3,92]. Der Zeitpunkt der Höchstwerte wird in den Arbeiten unterschiedlich dargestellt und wird unter anderem in den SSW 26 bis 30 [92] und SSW 29 bis 32 beschrieben, danach sinkt PlGF ab [12,93]. FLT1 (VEGFR1) wird in vielen Geweben, wie in vaskulären Endothelzellen [1] in Monozyten, in Makrophagen und im Trophoblast exprimiert [18,43]. Die Expression wird durch Hypoxie hochreguliert. Durch alternatives Splicing entsteht die lösliche Form des Rezeptors, dem die intrazelluläre Domäne fehlt, das sflt1 (svegfr1) [2,43,79,94]. Dieses wird von Endothelzellen, Monozyten und Zellen der Plazenta sezerniert [32,43] und steigt physiologischerweise am Ende der Schwangerschaft an [5,81]. Der Beginn des Anstiegs wird in den Arbeiten unterschiedlich dargestellt und reicht von SSW 10 bis 14 mit dem Höchstwert in SSW 37 [5] bis SSW 33 bis 36 bis zur Geburt [93]. Innerhalb von 48 Stunden [71] nach der Entbindung fällt sflt1 dramatisch ab [18,32]. VEGF und PlGF binden an FLT1 [80,86,95], welcher auch auf Trophoblastzellen exprimiert wird. sflt1 ist der Antagonist für VEGF und 10

11 Grundlagen PlGF [26,86,95], da die proangiogenetischen Faktoren VEGF und PlGF an die lösliche Form des FLT1 gebunden werden und somit nicht mehr an den membranständigen Rezeptor binden können [15,26,31,71,86,93,94,96,97]. Dieser antagonistische Effekt ist wahrscheinlich die signifikanteste biologische Funktion von sflt1 [86]. VEGF bindet an sflt1 mit einer höheren Affinität als PlGF [93]. Durch die vermehrte Produktion von PlGF bindet dieses an FLT1 und verdrängt dadurch VEGF, welches wiederum verstärkt an KDR bindet [2,71,89]. Wie in Abbildung 1 gezeigt, binden PlGF-Homodimere nur an FLT1 (VEGFR1) [2,43]. PlGF und sflt1 sind Schlüsselregulatoren bei der pathologischen Angiogenese [79]. PlGF/VEGFA-Heterodimere können an KDR (VEGFR2) und FLT1/KDR-(VEGFR1/VEGFR2)-Heterodimere binden [43,88,89,98]. Die Interaktionen und Funktionen sind in Abbildung 1 dargestellt. Proliferation Mikgration Survival Angiogenesis in endothelial cells Proliferation Migration Survival Angiogenesis in endothelial cells Proliferation Migration Survival Angiogensis mostly in lymphatic endothelial cells Abbildung 1: VEGF-Familie: angiogenetische Wachstumsfaktoren und Rezeptoren. Interaktionen und Funktionen. Modifiziert nach [43,98] 11

12 Grundlagen VEGF Familie und Genablationsstudien Bei Studien an Mäusen ist der FLK (fetal liver kinase) gleichzusetzen mit dem humanen KDR [43]. PlGF stimuliert die Sekretion von VEGFA durch Monozyten und erhöht die VEGFA mrna in den peripheren mononukleären Blutzellen. Eine Überexpression von PlGF führt zu Upregulation der FLT- und FLK- Transkription. Eine zu geringe Expression von PlGF beeinträchtigt die Endothelzell-Antwort auf VEGFA. [43] In einer Knockout-Studie wurde gezeigt, dass die Inaktivierung eines einzigen VEGF-Gens zum embryonalen Tod zwischen Tag 11 bis 12 führt [50] Weitere Biomarker Pregnancy-associated plasma protein A (PAPPA [77]) ist hauptsächlich bekannt durch das Screening auf Aneuploidien in Kombination mit der Bestimmung der beta-kette des human chorionic gonadotropin (CGB [99], β-hcg) [10,20,100,101]. PAPPA wird vom Synzytiotrophoblast gebildet [69] und ist in den lokalen Proliferationsprozess involviert [39]. In Zellkulturen konnte gezeigt werden, dass es durch ein niedriges PAPPA zu verminderter Zelladhäsion und Proliferation des Trophoblasten kommt [102]. Die Konzentration von PAPPA nimmt während der Schwangerschaft physiologischerweise zu [37,102]. Um das Risiko einer Präeklampsie zu erfassen, wurden noch viele andere Biomarker untersucht, auf die hier nicht näher eingegangen wird. Dazu gehören unter anderem: freies β-hcg [19,20,22,25,69,103], placental protein 13 (PP13) [22,36], a disintegrin and metalloproteinase domain 12 (ADAM12) [22,25], Pentraxin 3 (PTX3), P-Selektin [23,35], Neurokinin B, Homocystein, Tumornekrosefaktor (TNF, TNFA), Antiphospholipid- Antikörper, oxidierte Lipidprodukte [104], Zytokine [2], Kreatinin 12

13 Grundlagen [8,75,94,96], Thrombozytenanzahl [7,75,94], fetales Hämoglobin (HbF) [37,105] und zellfreie fetale Nukleinsäuren [101]. Mittels Proteomics, Metabolomics und Genetics [4,14] wurden Profile erstellt, die zur Risikoabschätzung bisher nur eingeschränkt aussagekräftig sind. 4.2 Hypertensive Schwangerschaftserkrankungen Die Präeklampsie ist eine der hypertensiven Schwangerschaftserkrankungen. Dazu zählen laut WHO auch die chronische Hypertonie, die Gestationshypertonie (GHT), die Propfpräeklampsie, das HELLP-Syndrom (hemolysis elevated liver enzymes low platelets) und die Eklampsie [1]. Die amerikanischen Richtlinien klassifizieren die Hypteronie in der Schwangerschaft in vier Kategorien: Präeklampsie-Eklampsie, chronische Hypertonie (jeder Ursache), chronische Hypertonie mit aufgelagerter Präeklampsie und GHT [106] Definitionen Chronische Hypertonie Eine Definition ist die Messung eines diastolischen Blutdrucks von 90 mmhg bei zwei Messungen im Abstand von über 4 Stunden [27,69] vor der SSW 20. Eine weitere Definition ist ein gemessener Blutdruck von 140/90 mmhg und negativem Harneiweiß [9,27,94] im Abstand von über 2 Stunden [27,33] oder mindestens 4 Stunden vor SSW 20 [8,37]. Gestationshypertonie (GHT) Hier finden sich die oben beschriebenen Definitionen mit dem Unterschied, dass die Hypertonie erst nach der 20. SSW auftritt [8,9,27,33,37,81,94]. Präeklampsie Die Diagnose, das Screening und Management, sowie die Klassifizierung des Schweregrades der Präeklampsie sind werden unterschiedlich definiert. 13

14 Grundlagen Laut WHO sind folgende Kriterien für die Identifikation einer Präeklampsie heranzuziehen: neu auftretende Hypertonie mit einer persistierenden Diastole von > 90 mmhg mit einer Proteinurie von > 0,3 g/24 h. [1] Laut den amerikanischen Richtlinien gibt es zwei Wege, um die Diagnose einer Präeklampsie zu stellen. Die beiden Wege sind abhängig vom Vorliegen einer Proteinurie und beziehen sich auf Parameter die nach der 20. SSW erhoben werden. Bei vorhandener Proteinurie sind die Kriterien für den Blutdruck bei einer vorher normotensiven Graviden wie folgt: Bei zwei Messungen im Abstand von mindestens vier Stunden wird ein systolischer Wert 140 mmhg oder ein diastolischer Wert 90 mmhg erhoben. Oder es wird innerhalb kurzer Zeit ein wiederholbarer Blutdruck von 160 mmhg systolisch oder 110 mmhg diastolisch gemessen. Die Proteinurie ist definiert durch 300 mg/24 h Protein oder eine Protein/Kreatinin-Ratio 0,3 (jeweils in mg/dl gemessen) oder ein 1+ positiver Harnstreifentest, wenn keine quantitativen Methoden verfügbar sind. Bei Abwesenheit einer Proteinurie wird die Diagnose der Präeklampsie durch die neu auftretende Hypertonie in Kombination mit einem oder mehrerer der folgenden Parametern gestellt: - Thrombozytopenie (< /µL) - erhöhte Lebertransaminasen (doppelt so hoch wie Normwerte) - eine neu entwickelte renale Insuffizienz (Serum-Kreatinin > 1,1 mg/dl oder Verdoppelung des Serum-Kreatinins ohne andere renale Erkrankung) - Lungenöden - neu aufgetretene cerebrale oder visuelle Beeinträchtigungen Tabelle 1 zeigt einige der verschiedenen Definitionen der Präeklampsie. 14

15 Grundlagen Tabelle 1: Verschiedene Definitionen der Präeklampsie RR 140/90 mmhg RR 120/90 mmhg RR > 110/90 mmhg RR Diastole > 90 mmhg Proteinurie 300 mg/24 h Harnstix Protein 1+ Harnstix Protein 2+ Protein 30 mg/dl Spontanharn Protein/Kreatinin Ratio 30 mg/mmol Protein/Kreatinin Ratio 0,2 Kreatinin im Serum > 1,5 mg/dl ASAT oder ALAT 80 U/L Hyperurikämie > Standardabweichung für GA [107] x x x x [96] x x x x [5] x x [7]* x x x [108]* x x [8]* x x x [94] x x x [65] x x [9] x x x [62]# x x [11]* x x [109] x x [13]* x x x [18] x x x [105]* x x x [19] x x [22]* x x x [69]* x x x [23]* x x x [26]* x+ x x x [27]* x x [32] x x x x x [110]* x x [34] x x [36]# x x x [72] x x [37]* x x x [111] x x x x x [63] x x [41]* x o 3+ [97]* x x * 2 Messungen im Abstand von 4 Stunden # 2 Messungen im Abstand von > 2 Stunden + 1 Messung o 2 g/24 h 15

16 Grundlagen Die Einteilung der Präeklampsie erfolgt entweder nach dem Zeitpunkt der auftretenden Symptome oder nach dem Schweregrad der Erkrankung. Aufgrund des Zeitpunktes wird die Präeklampsie in eine frühe und eine späte Präeklampsie unterteilt. Einige Arbeiten sprechen von einer frühen Präeklampsie bei Auftreten der Symptome < SSW 32 [41,112], andere < SSW 34 [5,10,14,19,29,36,65,69,101,107,113] oder < SSW 35 [30]. Ebenso verhält es sich bei der späten Form. Hier wird der Zeitpunkt der späten Präeklampsie mit 32. SSW [41], 34. SSW [5,10,14,19,29,69,113], 35. SSW [30], 37. SSW [107] oder 38. SSW [36] beschrieben. Laut WHO erfolgt die Einteilung für eine frühe Präeklampsie mit Eintreten der Symptome vor SSW 32 bis 34 [1], nicht definiert wird die späte Form. Von einer schweren Form spricht man, wenn eines oder mehrere der angeführten Symptome zutrifft: schwere Hypertonie [1] mit einem Blutdruck von > 160/110 mmhg [27,110] mit einer schweren Proteinurie [27,110] 2 g/dl oder 3+ Stix [41] oder erheblicher Organdysfunktion [1] wie Nierenfunktionseinschränkung, Leberbeteiligung, Lungenödem, Thrombozytopenie, Hämolyse, neurologische Symptome und IUGR < 5. Perzentile [114]. HELLP Ein HELLP-Syndrom ist durch folgende labordiagnostische Messwerte charakterisiert: Aspartataminotransferase (ASAT) > 70 U/L, Alaninaminotransferase (ALAT) > 70 U/L, Laktatdehydrogenase (LDH) > 600 U/L, Thrombozytenzahl < 100 x 10 9 /L mit Hämolyse [22]. Eklampsie Die Eklampsie ist eine schwere Komplikation der Präeklampsie und charakterisiert durch generalisierte tonisch-klonische Krämpfe, die auf keine andere Ursache zurückgeführt werden können [1,114]. Pfropfpräeklampsie Von einer Propfpräeklampsie spricht man bei einer chronischen Hypertonie und einer neu auftretenden Proteinurie oder einer sich verschlechternden 16

17 Grundlagen Proteinurie nach der SSW 20. Treten klinische oder labordiagnostische Marker der schweren Präeklampsie auf, handelt es sich ebenfalls um eine Pfropfpräeklampsie [114]. 4.3 Pathogenese der Präeklampsie Der Ursache der Präeklampsie liegt vermutlich in der Plazenta. Sie tritt familiär gehäuft auf [24,40] und ist nicht von einem einzelnen maternalen oder fetalen Gen abhängig [24]. In neueren Arbeiten wird zwischen einer plazentalen und der maternalen Form der Präeklampsie unterschieden [24]. Durch Vorerkrankungen der Mutter wie Hypertonie, Diabetes, arterielle Erkrankungen oder durch Adipositas ist das Risiko einer maternalen Präeklampsie begünstigt [24,115]. In diesem Fall wird von einer Pfropfpräeklampsie gesprochen. Die Präeklampsie entwickelt sich in zwei Stufen, nämlich die präklinische und die klinische [15,24,35,37,40,93,115]. Die erste Stufe ist gekennzeichnet von einer schlechten Entwicklung der Plazenta und ihrer Blutversorgung, das heißt, die Plazentation ist ungenügend [15,24,35,93,115]. Allerdings ist die inadäquate Plazentation nicht immer ausschließlich die Ursache einer Präeklampsie. Sie wurde aber auch mit Kindern assoziiert, die für ihr Gestationsalter zu klein sind (small for gestational age, SGA) [24,115]. Eine Hypoxie der Plazenta führt zur zweiten Stufe mit der Erkrankung der Mutter, die klinisch durch Hypertonie und Proteinurie, Gerinnungsstörungen und Leberdysfunktion gekennzeichnet ist. In schweren Fällen, besonders bei der frühen Form der Präeklampsie (Einsetzen der Symptome vor SSW 34) erleidet der Fetus vermehrt einen Nährstoffmangel und eine respiratorische Insuffizienz bis zu Asphyxie oder Tod. [24] Plazentation bei der Präeklampsie Der Trophoblast invadiert normalerweise die maternale Dezidua und das innere Drittel des Myometriums [35,40,116]. Bei der Präeklampsie ist der 17

18 Grundlagen Trophoblast nicht in der Lage, die Dezidua ausreichend zu infiltrieren [6,10,17,18,21,23,29,43,68,71] und die Spiralarterien suffizient umzubauen [2,10,17,23,34,38,43,68,70,113,116]. In der Abbildung 2 ist der Unterschied zwischen normaler und abnormaler Plazentation dargestellt. Die Präeklampsie ist also die Folge einer ungenügenden Gefäßentwicklung in der Plazenta [2,12,15,24,39,67,117]. Durch die Reduzierung von Grad und Tiefe des Spiralarterien-Remodeling kommt es zu einer verminderten Durchblutung und erhöhten Gefäßwiderstand [15,71,117]. Abbildung 2: Normale Plazentation und abnormale Plazentation in SSW 15 bis 16 [24] Aufgrund der schlechten uterinen und plazentalen Perfusion kommt es zu hypoxischen Bedingungen [2,10,12,23,96,111]. Die hypoxische Plazenta erleidet bei der Präeklampsie oxidativen Stress [2,10,15,39], das heißt, es kommt zu einem Ungleichgewicht zwischen der antioxidativen Abwehr und der Produktion von reaktiven Sauerstoffradikalen zugunsten letzterer. [24] 18

19 Grundlagen Durch den oxidativen Stress kann es zur Zerstörung der Blut-Plazenta- Schranke kommen, wodurch HbF in die maternale Zirkulation gelangt [105]. Freies Hämoglobin (Hb) und seine Metabolite Häm und Eisen bilden ebenfalls reaktive Sauerstoffradikale [105]. Weiters führen reaktive Sauerstoffradikale zur vermehrten Freisetzung von sogenanntem Trophoblast-Abfall infolge apoptotischer Prozesse und Nekrosen [24,39]. Dieser Trophoblast-Abfall umfasst Synzytiotrophoblast-Mikropartikel, Zytokeratin-Fragmente, lösliche RNA und DNA fetaler Herkunft und sogar Zytotrophoblast-Zellen. Dieser Abfall ist proinflammatorisch und gelangt ebenfalls in die maternale Zirkulation. [24] Das maternale vaskuläre System und das Immunsystem sind nicht in der Lage, mit den vermehrt anfallenden Abfallprodukten zurecht zu kommen [39] VEGF-Familie bei der Präeklampsie Induziert durch die Hypoxie und den zugrunde gegangenen Zellen kommt es zu vermehrter Freisetzung von antiangiogenetischen Faktoren wie sflt1 [2,5 8,15,17,18,20,31 33,43,45,62,71,86,93,94,96,104,110, ] und seng in die maternale Zirkulation [2,6,45,107,110,118,120]. Die Folge ist die Inhibierung der proangiogenetischen Faktoren PlGF [2,6,8,22,32,33,93,96,110,118,119] und VEGF [2,6,32,94,96]. Dadurch werden die Konzentrationen an freiem bioaktiven PlGF [9,75,104,111] und freiem VEGF erniedrigt [27,40,45,93,104,111]. Diese können nicht mehr mit dem membranständigen Rezeptor interagieren [25,31,97,111]. Die Konsequenz daraus ist eine systemische Endothelzelldysfunktion [11,15,18,23,25,39,44,45,65,81,86,93,94,97,111,116,120], die zur Mikroangiopathie führt und für das hypertensive Syndrom verantwortlich ist [2,117]. Zusätzlich konnte in vitro gezeigt werden, dass unter hypoxischen Bedingungen die Produktion von PlGF im Trophoblasten reduziert ist und die von VEGF [86,110] und seng erhöht wird [110]. Eine Studie zeigt, dass eine Überproduktion von sflt1 das niedrige PlGF nicht erklärt, sondern eventuell die reduzierte Plazentagröße für das niedrige PlGF verantwortlich ist [111]. Es wird beschrieben, dass sflt1 19

20 Grundlagen scheinbar direkt proportional zur Schwere der Proteinurie und umgekehrt proportional zur Anzahl der Thrombozyten, Gestationsalter und dem neonatalen Geburtsgewicht ist [93]. Veränderte Konzentrationen weiterer Biomarker finden sich unter anderem auch beim PAPPA, welches erniedrigt ist [19,23,29,55,69], da durch die fehlerhafte Trophblasteninvasion die Produktion vermindert ist [19]. Erhöhte Spiegel von seng kombiniert mit sflt1 induzieren eine schwere Präeklampsie mit Leberdysfunktion, intrauteriner Wachstumsretardierung (inteauterine growth restriction, IUGR), Gerinnungsstörungen und neurologische Symptome [2]. Bei schweren Formen der Präeklampsie finden sich in der Plazenta Infarkte [2,6,15,71], Thrombosen, Atherosen [2,6,71] und chronische Inflammation [2,71] Weitere Überlegungen Ein weiterer Ansatz ist, dass die Präeklampsie eine Form einer maternalen Immunreaktion auf den genetisch fremden Fetus ist. Wahrscheinlich kommt es zu keiner maternalen T-Zell-Antwort auf die fetopaternalen humanen Leukozyten Antigene (HLA), weil der Trophoblast die dafür notwendigen Antigene (HLA-A, -B, -D) nicht exprimiert. Der invasive Trophoblast infiltriert die Dezidua während der Plazentation und exprimiert eine spezifische Kombination von HLAs: HLA-C, -E, -G. Von denen stellt nur HLA-C ein polymorphes paternales Antigen dar [24]. In der Dezidua trifft der invadierende Trophoblast auf viele maternale Lymphozyten. Dabei handelt es sich nicht um die klassichen T-Zellen, sondern hauptsächlich um NK-Zellen mit unüblichem Phänotyp (dnk) im Vergleich zu zirkulierenden NK-Zellen (pnk) [24,117]. Diese dnk-zellen erkennen die exakte Kombination der HLAs, die vom invasiven Trophoblast exprimiert wird [24]. Die Plazentation ist anscheinend besser und die Präeklampsie weniger häufig, wenn der Trophoblast die dnk-zellen stärker stimuliert. Dies wurde in vitro noch nicht bestätigt. [24] 20

21 Grundlagen Die Präeklampsie ist auch mit einer systemischen inflammatorischen Antwort assoziiert [15,24]. In einem geringen Ausmaß ist dies normal. Es sind viele Teile des inflammatorischen Netzwerks involviert, wie Leukozyten, Thrombozyten, das Endothel, die Gerinnungskaskade und Akut-Phase-Proteine. Durch diese ergeben sich kleine systemische bis zu einem gewissen Grad normale Veränderungen. Im dritten Trimester werden diese Veränderungen intensiviert. Bei einer Präeklampsie gehen die Veränderungen über den normalen Grad hinaus. Sie sind für einige, wenn nicht alle, maternale Störungen verantwortlich. Die genauen Ursachen für die systemische Inflammation sind unklar. [24] Die inflammatorische Theorie besagt, dass oxidativer Stress durch exzessive Produktion von reaktiven Sauerstoffradikalen gekoppelt mit inadäquaten oder überforderten antioxidativen Abwehrmechanismen zur Präeklampsie führt. Zur Abwehr werden antioxidative Vitamine und enzymatische Systeme benötigt [15]. Freie Sauerstoff-Radikale fördern die maternale vaskuläre Dysfunktion [16] Klinischer Verlauf Der klinische Verlauf der Präeklampsie ist sehr variabel. Von einer frühen Präeklampsie spricht man, wenn die Symptome vor SSW 32 [1] bis SSW 34 einsetzen [10,101,113]. Durch das frühe Einsetzen der Symptome kommt es häufig zu einer akuten Exazerbation und der Notwendigkeit einer zeitnahen Entbindung. Nur die Geburt schützt die Mutter vor den Folgen der extremen Hypertonie, von Krampfanfällen und dem HELLP-Syndrom. [101] Der Verlauf von einem milden Beginn der Erkrankung zu einer schweren Form kann unerwartet und schnell sein [1]. In sehr schweren Fällen kann die Präeklampsie zum Tod der Mutter und auch des Kindes führen [1]. Die Komplikationen, die mit der Präeklampsie assoziiert sind, können durch Blutdruckmessung und Feststellung einer Proteinurie nicht vorhergesagt werden [101]. 21

22 Grundlagen Die späte Form der Präeklampsie tritt nach SSW 34 auf [113]. Sie ist nicht unbedingt mit einer plazentalen Dysfunktion vergesellschaftet und verläuft weniger dramatisch [113]. In einer anderen Arbeit ist beschrieben, dass die späte Präeklampsie mit einer normalen Plazentaentwicklung assoziiert ist [96]. Die Präeklampsie ist eine Multiorganerkrankung, die vor allem das Gehirn (Eklampsie), die Leber (HELLP), die Nieren (glomeruläre Endotheliose und Proteinurie) [93,117] und die Lunge (Pulmonalödem) betrifft [93]. Das am meisten betroffene Organ ist die Niere. Die Endothelzellen schwellen an, es kommt zum Verlust der endothelialen Fenster, zur glomerulären Endotheliose und Proteinurie [2,71]. Die Proteinurie steht in direktem Zusammenhang mit schlechter maternaler und fetaler Prognose und einem erhöhtem Risiko für Komplikationen wie Eklampsie und HELLP [2]. Marker für den renalen Endothelzellschaden ist die Mikroalbuminurie, das Resultat sind lokale oder systemische vaskuläre Schäden. Dadurch kommt es zu einem erhöhten Risiko für eine persistierende Mikroalbuminurie und nachfolgender Nierenerkrankung nach überstandener Präeklampsie [2]. Die Hypertonie entsteht durch den erhöhten peripheren vaskulären Widerstand. Die Präeklampsie verstärkt die Antwort auf Angiotensin II, Katecholamine und andere hypertensive Stimuli. Das totale Plasmavolumen nimmt ab. Nachweisbar sind ein niedriges Renin und Aldosteron, sowie ein hohes Arginin Vasopressin (AVP, anitdiuretisches Hormon, ADH). [2] Bei 57 % der Patientinnen, die an einer Präeklampsie erkranken, können in der Woche vor Krankheitsbeginn eine Hypertonie und eine Proteinurie nicht nachgewiesen werden [7]. Bei Beteiligung der Leber treten Symptome wie Bauchschmerzen, Übelkeit, Erbrechen, erhöhte Leberenzyme und in Extremfällen Blutungen und Nekrosen auf [71]. 22

23 Grundlagen Neurologische Symptome wie Kopfschmerzen, eingetrübtes Sehen und vorübergehender Sehverlust können durch eine unbehandelte Präeklampsie entstehen und sind Anzeichen der Eklampsie [2]. Die Eklampsie ist gekennzeichnet von generalisierten tonisch-klonischen Krämpfen [1] Langzeitfolgen Jahre nach einer Präeklampsie wird eine höhere Inzidenz an ischämischen Herzerkrankungen [24,35,38,71,96,109], Hypertonie [24,96], Schlaganfall [24] und metabolische Erkankungen beschrieben [64]. Diese Frauen haben ein zweifach erhöhtes Risiko für den Tod an kardio- und cerebrovaskulären Erkrankungen [38,71]. Auch Kinder, deren Mutter in der Schwangerschaft eine schwere Präeklampsie hatten, weisen ein erhöhtes Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen [2,38] und ischämischen Schlaganfall im Alter von 60 bis 70 Jahren. Ein Grund dafür könnte die cerebrale vaskuläre Dysfunktion sein, die durch Entwicklungsfehler während dem intrauterinen Leben entsteht. [2] Weiters können Kinder mit einer IUGR eine milde Lernschwäche bis zu schweren geistigen Einschränkungen entwickeln. Auch sie haben eine Prädisposition für kardiovaskuläre Erkrankungen [64] und Diabetes Typ 2 [121] im Erwachsenenalter Risikofaktoren In Tabelle 2 sind einige der in den Arbeiten angeführten Risikofaktoren für die Entwicklung einer Präeklampsie dargestellt. 23

24 Grundlagen Tabelle 2: Risikofaktoren [2] [5] [6,74] [93] [71] [122] [15] [24] [25] [29] [35] [82] [10] Adipositas x x x x x x x x x Alkoholkonsum Angstzustände Antiphospholipid-Antikörper-Syndrom x Arbeitsstress Asiatinnen x x Chronische Hypertonie x x x x x x x x x x x Depression Diabetes mellitus x x x x x x x Endotheliale Dysfunktion x Erhöhtes maternales Alter x x x Erstgebärend x x x Hyperlipidämie x x x x Insulinresistenz x x x x Konzeptionshemmer x Mehrlings-Schwangerschaft x Multiple Schwangerschaften x x Ovulationsauslösende Medikamente x x Positive Familienanamnese x x x x x x Präeklampsie in voriger SS x x x x x Renale Erkrankung x Schwarze Herkunft x x x Systemische Inflammation x x Systemischer Lupus erythemadodes x Thrombophilien x x x Thrombotische Gefäßerkrankung x x x x x x Risikofaktoren nach WHO sind Adipositas, chronische Hypertonie, Diabetes, Erstgebärend, jugendliches Alter der Mutter und Umstände, die zu einer Hyperplazentation führen, wie z. B. eine Zwillingsschwangerschaft [1]. 24

25 Material und Methoden 5 Material und Methoden Im Zeitraum vom bis wurden 200 gravide Probandinnen im Alter von 19 bis 44 Jahren in einer prospektiven Kohortenstudie beobachtet. Alle Patientinnen haben für die Teilnahme an dieser Studie eine Einwilligungserklärung unterschrieben (siehe Anhang). Die Probandinnen wurden unabhängig von BMI, ethnischer Herkunft, Anzahl der vorangegangenen Geburten, von Blutdruck- und Dopplerultraschallwerten in die Studie eingeschlossen. Ausgeschlossen wurde eine Patientin mit einer Mehrlingsschwangerschaft. Die Probandinnenakquise erfolgte durch einen niedergelassenen Gynäkologen, der auf Pränatalmedizin spezialisiert ist. Durch ihn erfolgte die Erhebung von Parametern wie Alter, BMI und Blutdruck. Für die Messung der Laborparameter wurde eine Blutprobe in einem Röhrchen ohne Gerinnungshemmer abgenommen. Nach 30 Minuten wurden die Proben bei 3500 rpm bei 20 C für 10 Minuten zentrifugiert. Innerhalb von maximal sechs Stunden wurde das Serum der Probandinnen in drei Röhrchen aliquotiert und bei -20 C eingefroren. Die Lagerung der Röhrchen erfolgt in zwei verschiedenen Tiefkühlern. Das erste Aliquot, aus dem auch die Laborparameter erhoben wurden, wurde separat eingefroren. Die beiden anderen Röhrchen dienten als Reserve, damit für eine eventuelle weitere Messung eine noch nicht aufgetaute Serumprobe zur Verfügung steht. Tabelle 3 zeigt in welchen SSW die Erhebung der verschiedenen Parameter geplant war. Tabelle 3: In den verschiedenen SSW durchgeführte Messungen PlGF PAPPA sflt1 sflt1/plgf-ratio SSW 7 9 x x SSW SSW x x SSW x x x 25

26 Material und Methoden Da die Probandinnen nicht immer in den geplanten SSW zur Blutabnahme gekommen sind, musste die Vorgehensweise für die Auswertung geändert werden. Zum Einen wurden die erhobenen Werte auf den Schwangerschaftstag bezogen, um den Verlauf des PlGFs beobachten zu können. Zum Anderen wurden je nach SSW bei der Blutabnahme Gruppen gebildet. Diese Gruppen wurden aufgrund der Referenzbereiche der Firma Roche erstellt (siehe Tabelle 4). Da die Referenzbereiche mit SSW10+0 beginnen, wurden eine eigene Gruppe mit den Probandinnen gebildet, die vor SSW 10+0 zur Blutabnahme kamen. Tabelle 4 zeigt die jeweilige Anzahl der durchgeführten Messungen bezogen auf die SSW. Tabelle 4: Anzahl der durchgeführten Bestimmungen je SSW SSW gesamt PlGF PAPPA sflt1 1* 1* * Indexpatientin inklusive Indexpatientin und 1 Abortus Die niedrige Anzahl der Messungen ab dem zweiten Trimester erklärt sich dadurch, dass die SSW noch nicht bei allen Probandinnen so weit fortgeschritten ist. Für die Berechnungen wurden daher 101 Patientinnen einbezogen. Für die Erstellung der Cluster wurden alle Werte verwendet. PlGF und sflt1 wurden mittels Elektrochemilumineszenz Immunoassay (ECLIA) bestimmt. Beide Methoden arbeiten mit dem Sandwich-Prinzip. [123,124] PAPPA wurde bis einschließlich mit Kryptor (Thermo Fisher Scientific, B R A H M S GmbH, Hennigsdorf) gemessen, danach erfolgte die Messung mittels ECLIA über cobas e601 (Roche Diagnostics, Mannheim). 26

27 Material und Methoden 5.1 PlGF (Roche Diagnostics, Mannheim) Bei der Bestimmung von PlGF kommen monoklonale Antikörper gegen humanes PlGF zur Anwendung. Der Messbereich liegt bei 3 bis pg/ml. Die Referenzbereiche für normale Schwangerschaften wurden durch die Untersuchung von 877 normotensiven Probandinnen durch 1685 Bestimmungen in einer Multicenterstudie ermittelt. [124] Diese sind in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5: Referenzbereiche PlGF in pg/ml [124] SSW Geburt 5. Perzentil 28,8 66, ,0 54,4 50. Perzentil 52, Perzentil N Abbildung 3 zeigt eine grafische Darstellung der oben gezeigten Referenzbereiche von PlGF. Abbildung 3: Referenzbereiche PlGF der Firma Roche Diagnostics (Mannheim) 27

28 Material und Methoden Für die Bestimmung von PlGF werden 50 µl (ohne Totvolumen) Serum benötigt. Während der ersten Inkubationszeit bilden biotinylierte monoklonale Antikörper (Maus), die spezifisch gegen PlGF gerichtet sind, und PlGF-spezifische mit einem Ruthenium-Komplex markierte monoklonale Antikörper einen Sandwich-Komplex. Nach Zugabe von Streptavidin-beschichteten paramagnetischen Mikropartikeln wird in der zweiten Inkubationsphase der Komplex über Biotin-Streptavidin- Wechselwirkung an die Festphase gebunden [124,125]. Die Bindung zwischen Streptavidin und Biotin ist eine der stärksten nicht-kovalenten Interaktionen. Sie ist gegenüber organischen Substanzen, Denaturierungsmitteln, Detergentien, proteolytischen Enzymen und extremer Temperatur und ph-werten resistent. [126] In der Abbildung 4 ist die Bildung des Sandwich-Komplexes dargestellt. Abbildung 4: Messprinzip ECLIA. Modifiziert nach [126] In der Messzelle werden diese Mikropartikel durch magnetische Wirkung auf der Oberfläche der Messelektrode fixiert. Die ungebundenen Substanzen werden durch Waschzyklen entfernt. [124] Durch die Waschlösung wird auch das für die Elektrochemilumineszenz-Reaktion notwendige Tripropylamin (TPA) bereit gestellt. Um diese Reaktion auszulösen, wird eine Spannung zwischen der Arbeits- und der Zählelektrode angelegt. Die elektrochemisch aktiven Substanzen TPA und der Ruthenium-Komplex führen zur Lichtemission. Durch die zyklische Amplifikation des Signals (siehe Abbildung 5) entsteht ein Peak der Chemilumineszenzemission. [126] 28

29 Material und Methoden Abbildung 5: Zyklische Signalamplifikation und Anregung der Chemilumineszenz [126] Die entstandene Emission wird mit einem Photomultiplier erfasst. Anhand einer Kalibrationskurve werden die Ergebnisse in pg/ml berechnet. Die Gesamtdauer beläuft sich auf 18 Minuten. [124] 5.2 sflt1 (Roche Diagnostics, Mannheim) Der Messbereich von sflt1 reicht von 10 bis pg/ml. Die Referenzbereiche für normotensive Patientinnen mit normalen Schwangerschaften wurden in der selben Multicenterstudie wie für PlGF ermittelt. [123] Tabelle 6 zeigt diese Referenzwerte. Tabelle 6: Referenzbereiche sflt1 in pg/ml [123] SSW Geburt 5. Perzentil Perzentil Perzentil N Die grafische Darstellung der Referenzbereiche für sflt1 ist in Abbildung 6 dargestellt. 29

30 Material und Methoden Abbildung 6: Referenzbereiche sflt1 der Firma Roche Diagnostics (Mannheim) Für die Bestimmung von sflt1 werden ohne Totvolumen 20 µl Serum benötigt. Biotinylierte monoklonale sflt1-spezifische Antikörper (Maus) und spezifische Antikörper, die mit einem Ruthenium-Komplex markiert sind, bilden in der ersten Inkubationsphase einen Sandwichkomplex. Während der zweiten Inkubation werden Mikropartikel hinzugegeben, die mit Streptavidin beschichtet sind. Über die Biotin-Streptavidin- Wechselwirkung bindet der Komplex an die feste Phase. Danach werden in der Messzelle die Partikel durch magnetische Wirkung auf der Elektrodenoberfläche fixiert. Ungebundene Substanzen werden mit Hilfe von Waschzyklen entfernt. Die Messung der Chemilumineszenz und die Ermittlung des Ergebnisses erfolgen wie bei der Bestimmung des PlGF. [123] 30

31 Material und Methoden 5.3 sflt1/plgf-ratio (Roche Diagnostics, Mannheim) Über eine prospektive Multicenterstudie wurden die in Tabelle 7 dargestellten Cutoffs evaluiert. Tabelle 7: Empfohlene Cutoffs von Roche Diagnostics. Modifiziert nach [123] Frühe Gestationsphase SSW sflt1/plgf-quotient Sensitivität Spezifität Rule out Cutoff 33 95,0 % 94,0 % Rule in Cutoff 85 88,0 % 99,5 % Späte Gestationsphase SSW 34+0 bis Geburt Rule out Cutoff 33 89,6 % 73,1 % Rule in Cutoff ,2 % 95,5 % 5.4 PAPPA (Thermo Fisher Scientific, B R A H M S GmbH, Hennigsdorf) Für die Bestimmung von PAPPA werden 50 µl (ohne Totvoumen) benötigt. Die Ergebnise liegen nach cirka 20 Minuten vor. Das Detektionslimit liegt 0,004 bis 6 IU/L. Die Referenzbereiche für das Screening auf Chromosomenanomlien wurden durch eine Studie mit 5000 Probandinnen ermittelt. [127] Die Bestimmung von PAPPA am Kryptor (B R A H M S, Hennigsdorf) erfolgt mittels Time Resolved Amplified Cryptate Emission (TRACE). Diese Technologie beruht auf einem strahlungslosen Energietransfer. Der Energietransfer erfolgt von einem Donator-Molekül zu einem Akzeptor- Molekül als Ergebnis der abgeschlossenen Immunreaktion. [128] Abbildung 7 zeigt das Prinzip der TRACE-Technologie. 31

32 Material und Methoden Abbildung 7: Messprinzip Kryptor [128] 5.5 PAPPA (Roche Diagnostics, Mannheim) Der Messbereich für PAPPA liegt bei miu/l. Die Referenzbereiche wurden mit Proben von 500 gesunden, nicht graviden Probandinnen durchgeführt. Aus diesen Ergebnissen wurde eine 95. Perzentile von < 7,15 miu/l errechnet. Die Referenzbereiche für die verschiedenen SSW wurden durch Erhebung der PAPPA-Werte von 4841 graviden Probandinnen ermittelt. [129] Für die Bestimmung von PAPPA werden 15 µl Serum (ohne Totvolumen) benötigt. Ein PAPPA-spezifischer biotinylierter monoklonaler Antikörper (Maus) bildet in der ersten Inkubationsphase mit einem mit einem Ruthenium-Komplex markiertem monoklonalen PAPPA-spezifischen Antikörper einen Komplex. Danach werden mit Streptavidin beschichtete Mikropartikel dazu gegeben. Über Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung bindet der vorher entstandene Komplex an die Mikropartikel. Durch magnetische Wirkung werden die Partikel an der Oberfläche der Elektrode in der Messzelle fixiert. Die Emissionsmessung und Auswertung erfolgt wie bei der Messung von PlGF. Die Testdauer beträgt 18 Minuten. [129] 32

33 Material und Methoden 5.6 Statistik Für die Berechnungen und Erstellung der Grafiken wurden SPSS, Version 21, Numbers, Version 3.2 (1861) und Excel 2008 für Mac, Version (130206) verwendet. Die Zusammenhänge der Ergebnisse wurden mit der Korrelation nach Pearson errechnet. Zur Verringerung des Alpha-Fehlers wurde die Bonferroni-Korrektur angewandt. 33

34 Ergebnisse 6 Ergebnisse Insgesamt wurden 200 Probandinnen in dieser Studie beobachtet. Bei den Patientinnen wurde bei vier verschiedenen Terminen eine Blutabnahme durchgeführt. Die SSW wurde bei jeder Blutabnahme auf den Tag genau erhoben. Vom Gesamtkollektiv wurde eine Gravide aufgrund einer Zwillingsschwangerschaft ausgeschlossen. Bei den verbleibenden 199 Probandinnen konnten bei der ersten Untersuchung die Parameter Alter, SSW und PAPPA vollständig erhoben werden. Der Blutdruck wurde bei 146 Probandinnen und der BMI bei 130 erfasst. Die Konzentration von PlGF wurde bei 196 Probandinnen gemessen. Bei der zweiten Blutabnahme wurden PlGF-Werte bei 181 und bei der dritten bei 150 Graviden erhoben. Bei 107 Probandinnen konnten bei der vierten Untersuchung die Werte von PlGF und sflt1 erhoben und daraus die sflt1/plgf-ratio berechnet werden. Insgesamt hatten 10 Patientinnen einen Abortus oder eine Fehlgeburt. Davon wurde bei einem Kind eine Trisomie 18 festgestellt, ein Kind hatte das Penar-Shokeir-Syndrom (Pseudo-Trisomie 18) und bei den anderen Kindern ist der Grund bisher nicht bekannt. Die Rate der Aborte und Fehlgeburten bei allen Probandinnen mit einer SSW > 12+0 (n= 183) beläuft sich auf 5,46 %. Die Berechnung der Korrelationen bei allen Probandinnen (n = 199) zwischen Alter, BMI und Blutdruck bei der Erstuntersuchung ergab nach der Bonferroni-Korrektur einen signifikanten Zusammenhang zwischen systolischem und diastolischem Blutdruck (p = 0,000000). Zwischen Alter und BMI, Alter und Blutdruck sowie BMI und Blutdruck gab es keine signifikante Assoziation. Die Ergebnisse von PlGF und PAPPA (siehe Abbildung 8) der ersten Blutabnahme zeigten bei einem Signifikanzniveau nach Bonferroni- Korrektur von 0,025 einen signifikanten Zusammenhang mit einem p-wert von 0,

35 Ergebnisse Abbildung 8: PlGF_1 in pg/ml, PAPPA in miu/ml (n = 199) Für die weiteren Berechnungen der Korrelationen (siehe Abbildungen 9 und 10) zwischen den im Labor erhobenen Parametern wurden alle Probandinnen eingeschlossen, die sich allen vier Blutabnahmen unterzogen haben und keinen Abortus oder eine Fehlgeburt, sowie keine sflt1/plgf-ratio im Graubereich hatten (n = 107). Diese Probandinnen wurden in eine Gruppe mit normalem SS-Verlauf zusammengefasst (Normalkollektiv). 35

36 Ergebnisse Abbildung 9: Streudiagramme der Werte von PAPPA und PlGF der verschiedenen Blutabnahmen im Vergleich (n = 107) 36

37 Ergebnisse Abbildung 10: Streudiagramme der sflt1-werte im Vergleich zu PAPPA und den PlGF-Werten der verschiedenen Blutabnahmen (n = 107) 37

38 Ergebnisse Es konnte keine Korrelation zwischen den PlGF-Werten bei der ersten und der dritten, sowie der ersten und vierten Blutabnahme gefunden werden. Kein Zusammenhang wurde zwischen den Werten von PlGF und sflt1 sowie zwischen PAPPA und sflt1 gefunden werden. In Tabelle 8 sind die p-werte dargestellt. Tabelle 8: Ergebnisse der Korrelationen bei Probandinnen normaler SS (n = 107) Verglichene Werte p-wert PlGF_1 PAPPA 0,000031* PlGF_1 PlGF_2 0,000000* PlGF_1 PlGF_3 0,000093* PlGF_1 PlGF_4 0, PlGF_2 PlGF_3 0,000000* PlGF_2 PlGF_4 0,000002* PlGF_3 PlGF_4 0,000000* sflt1 PAPPA 0, sflt1 PlGF_1 0, sflt1 PlGF_2 0, sflt1 PlGF_3 0, sflt1 PlGF_4 0, * Signifikantes Ergebnis nach Bonferroni-Korrektur Signifikanzniveau nach Bonferroni-Korrektur = 0,

39 Ergebnisse Der Anstieg von PlGF wurde auf den Schwangerschaftstag genau berechnet. Hierfür wurden die Differenzen der PlGF-Werte auf den Schwangerschaftstag der ersten Blutabnahme bezogen. Abbildung 11 zeigt den fast linearen Anstieg der PlGF-Werte bei den Patientinnen des Normalkollektivs. Abbildung 11: Anstieg der PlGF-Werte bezogen auf den Schwangerschaftstag der ersten Blutabnahme 39

40 Ergebnisse In unserer Studie konnte bei einer Patientin kein Anstieg der PlGF-Werte festegestellt werden. Bei dieser Patientin lag der Verdacht auf das Vorliegen einer Präeklamspsie vor, daher wurde sie als Indexpatientin festgelegt. Die Indexpatientin wurde aus den Korrelationsmessungen ausgeschlossen. Die erste Messung des PlGFs der Indexpatientin erfolgte in der SSW 10+1 mit 7,15 pg/ml. In der SSW 13+5 lag das PlGF bei 5,48 pg/ml, in der SSW 17+0 war es 9,47 pg/ml. Die Messung in der SSW 23+5 ergab 23,07 pg/ml. Der Verlauf der erhobenen PlGF-Werte im Vergleich zu den Referenzbereichen wird in Abbildung 12 gezeigt. Abbildung 12: PlGF-Werte der Indexpatientin im Vergleich zum Normalkollektiv und den Referenzwerten 40

41 Ergebnisse Die sflt1/plgf-ratio der Indexpatientin wurde in SSW 23+5 mit 104,5 gemessen. Der Cutoff für eine Präeklampsie liegt in den SSW 20+0 bis 33+6 bei 85. Post partum wurde bei dieser Patientin nur eine einzige Nabelschnurarterie beschrieben, sodass das massiv verringerte Wachstum des Kindes während der Gravidität auf das Vorliegen einer Plazentainsuffizienz zurückzuführen ist. Bei der Indexpatientin wurde aus den eingefrorenen, noch nie aufgetauten Serumproben zu den jeweiligen Zeitpunkten der SS sflt1 gemessen. Der Verlauf im Verlgeich zu den Referenzbereichen von sflt1 wird in Abbildung 13 dargestellt. Abbildung 13: sflt1-werte der Indexpatientin 41