Holz ein natürlicher Werkstoff mit antibakteriellen Eigenschaften?

Transkript

1 Holz ein natürlicher Werkstoff mit antibakteriellen Eigenschaften? Vergleichende Untersuchungen zum Überleben von Bakterien auf Holz und Kunststoff mit mikrobiologischen und molekularen Methoden Annett Milling

2 Roh- und Werkstoff Holz Phloem Rinde Kambium Splint Aufbau des Stammes Kernholz Holzverwendung: Baustoff (Fundamentpfähle, Bauteile) Bauhilfsstoff (Schalungen, Gerüste) Fenster, Türen, Treppen, Fußböden, Möbel Werkstoff (Sperrholz, Spanplatten) Chemierohstoff Energieträger Schneidunterlagen, Küchengeräte Verpackungs- und Transportmittel (Kisten, Fässer, Paletten)

3 Hygienestatus Holz ist unhygienisch stets höhere Keimgehalte auf Holzflächen im Vergleich zu Kunststoff und Metall vor und nach Einsatz von Reinigungs- und Desinfektionsmitteln Problem: Holz ist porös und hygroskopisch weitgehendes Verbot von Holz im Lebensmittelsektor Fleischhygiene-Verordnung (FlHV) Geflügelfleischmindestanforderungen- Verordnung (GFlMindV) Fleischerzeugnis-Richtlinie 92/5/EWG vom Februar 1992

4 Hygienestatus Holz ist hygienisch Studie von Ak et al. (1994) Food Research Inst., University of Wisconsin Madison Geringere Keimbelastung von Holz- im Vergleich zu Kunststoffbrettchen Keimreduktion an Holzoberflächen bereits nach wenigen Minuten Gute Reinigung von Holzbrettchen

5 Fragestellungen 1. Überleben Testbakterien auf und im Holz, und von welchen Parametern ist ihr Überleben auf dem Holz abhängig? 2. Sind die Bakterien auf und im Holz abgestorben oder nur inaktiviert bzw. in ihren Lebensfunktionen eingeschränkt? 3. Wie wird das Überleben bakterieller Gemeinschaften durch Holz beeinflusst? 4. Sind die Laborergebnisse in die Praxis übertragbar?

6 Experimentelle Herangehensweise Umfassende systematische Analyse der Interaktionen zwischen Bakterien und Holz durch völlig neue experimentelle Herangehensweise: Analyse: Material: Materialzustand: Bakterien: kultivierungsabhängig kultivierungsunabhängig Holz (Pinus silvestris L., Picea abies Karst., Larix decidua Mill., Acer pseudoplatanus L., Fagus silvatica L., Quercus robur L., Populus nigra L.) Kunststoff (Polyethylen (PE)) Sägespäne, Sägemehl Brettchen Escherichia coli pie639 (sat3) Enterococcus faecium (vana) Hühnergülle (bakterielle Gemeinschaft)

7 Inokulation mit E. coli oder E. faecium Inkubation Experimentelle Herangehensweise Ablösung der Bakterien durch Behandlung im Stomacher- Blender Kultivierungsabhängige Analyse Kultivierungsunabhängige Analyse Plattierung auf Plate Count Agar mit Antibiotika Extraktion der Gesamt-DNA aus einem Bakterienpellet (und Aufreinigung) Bestimmung der Keimzahl PCR-Amplifikation Agarose-Gelelektrophorese Southern Blot Hybridisierung

8 Bakterienverteilung nach Inokulation Kiefer nach 2 h Polyethylen nach 2 h CLSM-Aufnahmen: Dr. Monika Götz

9 Überleben von E. coli pie639 auf Holz und Kunststoff 9 8 Titer (log 10 CFU/g) h 24 h 48 h 96 h 216 h 1 0 Kiefer Fichte Lärche Ahorn Buche Eiche Pappel PE

10 Überleben von E. coli pie639 Kiefer Fichte Lärche Pappel Polyethylen M 0 h 24 h 48 h 96 h 216 h 0 h 24 h 48 h 96 h 216 h 0 h 24 h 48 h 96 h 216 h M M 0 h 24 h 48 h 96 h 216 h 0 h 24 h 48 h 96 h 216 h M E.coli a) b) c) a) Agarosegel der Roh-DNA b) Southern Blot der Roh-DNA nach Hybridisierung mit sat3 c) Southern Blot der PCR-Produkte nach Hybridisierung mit sat3

11 Überleben von E. coli pie639 auf Kiefernholz Titer (log10 CFU/g) Ausgangsholzfeuchte (%) 0 h 4 h 7 h 12 h 24 h 48 h Holzfeuchte (%) h 4 h 7 h 12 h 24 h 48 h Ausgangsholzfeuchte (%)

12 Überleben von E. coli und E. faecium auf Kiefernholz und Kunststoff Titer (log 10 CFU/g) h 4 h 8 h 11 h 24 h 48 h 168 h 0 Kiefer Kiefer PE PE E. coli E. faecium E. coli E. faecium

13 Inokulation mit Hühnergülle Inkubation Experimentelle Herangehensweise Ablösung der Bakterien durch Behandlung im Stomacher- Blender Kultivierungsabhängige Analyse Kultivierungsunabhängige Analyse Plattierung auf Universal- und Selektivnährmedien Extraktion der Gesamt-DNA aus einem Bakterienpellet und Aufreinigung Bestimmung der Keimzahl PCR-DGGE mit universellen und gruppenspezifischen Primern Bandenextraktion, Klonierung, Sequenzierung

14 Inokulation verschiedener Hölzer und Kunststoff mit Hühnergülle 6 5 Titer (log 10 CFU/g) h 1 h 24 h 72 h 144 h 192 h 0 Kiefer Lärche Ahorn PE

15 Inokulation verschiedener Hölzer und Kunststoff mit Hühnergülle 6 5 Kiefer Titer (log 10 CFU/g) h 1 h 24 h 72 h 144 h 192 h 1 0 total CFU Enterobakterien Streptokokken Enterokokken 6 5 Polyethylen Titer (log 10 CFU/g) h 1 h 24 h 72 h 144 h 192 h 1 0 total CFU Enterobakterien Streptokokken Enterokokken

16 Inokulation verschiedener Hölzer und Kunststoff mit Hühnergülle Kiefer Lärche Ahorn Polyethylen M 1 h 1 h 72 h 72 h 216 h 216 h 1 h 1 h 72 h 72 h 216 h 216 h 1 h 1 h 72 h 72 h 216 h 216 h 1 h 1 h 72 h 72 h 216 h 216 h Gülle M A-- C-- B-- DGGE von 16S rdna-fragmenten für Bakterien (E.coli: ) A: nicht-kult. Gram-pos. Bakterium aus dem Hühnerdarm (98,9%) B: Brachybacterium tyrofermentas (99,7%) C: Moraxella sp. (100 %)

17 Inokulation verschiedener Hölzer und Kunststoff mit Hühnergülle Lärche 1 1 h PE 1 1 h Lärche 1 72 h Ahorn 2-1 h Kiefer h Kiefer h Kiefer 2 72 h Kiefer 1 72 h Lärche h Lärche h Lärche 2 1 h Lärche 2 72 h Kiefer 1 1 h Gülle Ahorn 2 72 h PE 2 1 h Ahorn 1 72 h Ahorn 1 1 h Ahorn h Ahorn h Kiefer 2 1 h PE h PE h PE 1 72 h PE 2 72 h

18 Charakterisierung der antibakteriellen Wirkung von Holz Physikalische und chemische Erklärungsansätze: Bakterien werden nur durch rein physikalische Kräfte in den Holzporen festgehalten. Ein scheinbarer Keimabbau findet durch eine Verlagerung der Bakterien von der Oberfläche in tiefere Holzschichten statt. Das poröse und hygroskopische Holz entzieht den Bakterien das für ihre Lebensaktivität und Vermehrung benötigte Wasser und tötet diese dadurch ab. Holzinhaltsstoffe wirken antibakteriell.

19 Überleben von E. coli pie639 auf Holz und Kunststoff 9 8 Titer (log 10 CFU/g) h 24 h 48 h 96 h 216 h 1 0 Kiefer Fichte Lärche Ahorn Buche Eiche Pappel PE

20 Charakterisierung der antibakteriellen Wirkung von Holz Physikalische und chemische Erklärungsansätze: Das poröse und hygroskopische Holz entzieht den Bakterien das für ihre Lebensaktivität und Vermehrung benötigte Wasser und tötet diese dadurch ab. Holzinhaltsstoffe wirken antibakteriell.

21 Charakterisierung der antibakteriellen Wirkung von Holz Holzart Alkohol- Benzol- Extrakte [%] Ether- Extrakte [%] Holzart Ethanol- Extrakt [%] Europ. Fichte 2,34 0,78 Tanne 2 Kiefer 3,32 1,92 Fichte 2,5 Kiefer-Splint 3,47 - Lärche 4,5 Kiefer-Kern 5,88 - Kiefer 9 Hainbuche 1,99 - Rotbuche 1,5 Gemeine Buche 1,20 0,31 Esche 3 Spitzahorn 2,02 0,45 Ahorn 3 Bergahorn 2,45 - Pappel 3,5 Eiche - 0,72 Birke 3,5 Eiche-Splint 2,4 - Erle 5 Eiche-Kern 4,4 - Nussbaum 5 Linde 10 Robinie 11 Eiche 12 Extraktstoffgehalte einiger Laub- und Nadelholzarten (Fengel und Grosser 1975, Dix und Marutzky 1987, Kubel et al. 1988, Lange et al. 1989, Lange 1995)

22 Charakterisierung der antibakteriellen Wirkung von Holz ÜN Kultur + Extrakt Holzspäne + Wasser Inkubation, ÜN, 37 C + Tetrazoliumchlorid Inkubation, 30 min, 37 C Heißwasserextraktion (2 h, 80 C) K F L B P E OD-Messung TA W CFU/ml 10 8 CFU/ml

23 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Wirkung von Heißwasserextrakten auf E. coli pie639 Lärche Buche Pappel Wasser 5 % Tanninsäure 10 % Tanninsäure Kiefer Kiefer-Kernholz Fichte Inokulation: 10 9 CFU/ml OD595nm

24 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 Wirkung von Heißwasserextrakten auf E. faecium Lärche Buche Pappel Wasser 5 % Tanninsäure 10 % Tanninsäure Kiefer Kiefer-Kernholz Fichte Inokulation: 10 6 CFU/ml OD595nm

25 Charakterisierung der antibakteriellen Wirkung Titer (log 10 CFU/g) h 24 h 48 h 72 h 0 Kiefer Kiefer nach Leaching Buche Buche nach Leaching

26 Zusammenfassung Die hygienischen Eigenschaften von Holz können nicht universell eingeschätzt, sondern müssen differenziert beurteilt werden. Die hygienischen Eigenschaften von Holz hängen hauptsächlich von der Holzart selbst ab, aber auch von anderen Faktoren wie der Art und Konzentration der Bakterien, der Holzfeuchte, den Umgebungstemperaturen und der relativen Luftfeuchte. Für Kiefern- und Eichenholz konnten eindeutig antibakterielle Eigenschaften nachgewiesen werden hygienischer Vorteil gegenüber anderen Holzarten und Kunststoff. Die Entwicklung der DNA-Gehalte auf den Holz- und Kunststoffspänen korrelierte mit den ermittelten Keimzahlen. Die antibakterielle Wirkung von Kiefernholz wurde kultivierungsunabhängig bestätigt.

27 Zusammenfassung Die DGGE-Profile machten eine Dynamik in der Struktur der bakteriellen Gemeinschaft der Hühnergülle besonders auf Kiefernholz- und Kunststoffspänen während der Inkubation deutlich. Die Ergebnisse, die in den Untersuchungen zum Überleben von Bakterien auf Holzspänen gewonnen wurden, waren tendenziell auf das Überleben von Bakterien auf kompakten Flächen übertragbar. Neben der hygroskopischen Wirkung von Holz konnte auch die Beteiligung von Holzinhaltsstoffen an der antibakteriellen Wirkung nachgewiesen werden.

28 Auch in der Praxis konnten die guten hygienischen Eigenschaften von Produkten aus Kiefernholz bestätigt werden. Ausblick

29 Danksagung Heinrich Wilms Fa. Gustav Wilms Holzverpackungen, Bad Essen-Barkhausen Dr. Helmut Steinkamp Deutsches Institut für Lebensmitteltechnik e.v., Quakenbrück PD Dr. Kornelia Smalla, BBA, Braunschweig Dr. Rolf Kehr, BBA, Braunschweig Arbeitsgruppe Smalla

30 Pinus sylvestris L. (Gemeine Kiefer)