Virologie II, L02. Influenzavirus. Dr. Claudia Bachofen Bei Fragen und für Infos und Anmerkungen:

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1 Virologie II, L02 Influenzavirus Dr. Claudia Bachofen Bei Fragen und für Infos und Anmerkungen: 1

2 Inhalt Taxonomie, Struktur, Genom Replikation Wirte Strategie Geschichte / Epidemiologie Mensch Influenza beim Schwein Influenza beim Geflügel Influenza beim Pferd Bekämpfung Diagnostik 2

3 Taxonomie Familie Orthomyxoviridae 3 Genera: Influenzavirus Typ A, B Mensch, versch. Säuger, Vögel (Typ B: Mensch, Robben) Influenzavirus Typ C Mensch, ev. Schwein, Hund; ev. Rind!! Thogoto-artige Viren (Thogoto / Dhori) Zecken; gelegentlich Übertragung auf Mensch (Meningo-Enzephalitis), Schaf, Rind, andere? Gleich: Unterschiede: -ssrna, ähnl. Struktur Virion O segmentiert, antigenetische Vielfalt; Fusionsaktivität P unsegmentiert, antigen. rel. stabil; auch bei P oft Hämagglutination O immer H und N, P z.t. kein N oder HN+F; 3 meist respiratorische Krht. O Replikation im Nukleus, P im Zytopl.

4 Merkmale Orthomyxoviridae Struktur: pleomorph; helikales Nukelokapsid behüllt Durchmesser nm Hülle mit Spikes : Hämaglutinin HA Neuraminidase NA Nachträglich eingefärbtes TEM-Bild mit Membranproteinen (rot), Virusmembran (weiß), Lumen (braun) und Ribonucleoproteinen (violett) CDC/ Dr. Erskine. L. Palmer; Dr. M. L. Martin 4 dia/file:influenza_virus_particle_color.jpg

5 Merkmale Orthomyxoviridae Genom: negativ orientierte ssrna, segmentiert Typ A: Genom 8 Segmente Subtypen: 18 HA / 9 NA Typ B: Genom 8 Segmente keine Subtypen Typ C: Genom 7 Segmente keine Subtypen Thogoto: Genom 6 Segmente keine Subtypen 5

6 Morphologie Influenza A Verpackung : HA, NA Spikes, Membran, Matrix (M1) und Ionenkanal (M2) Inhalt : - RNA umgeben von Nukleoprotein ( Ribonukleoprotein, RNP) 6 - Necessaire : Replikase Komplex (PB1, PB2, PA), NEP

7 Segment Protein Funktion Morphologie Influenza A Lokalisation und Funktion der Proteine 1 PB2 Endonuklease, cap stehlen 2 PB1, PB1-F2 RNA Polymerase, Replikation Apoptose induzierendes NS-Protein 3 PA Teil des Replikationskomplexes 4 HA Hämagglutinin, wird in HA1/2 gespalten, bindet an Zelle, Fusion 5 NP Nukleoprotein, Schutz + Transport der RNA 6 NA Neuraminidase, Freisetzung der Partikel 7 M1 M2 8 NS1 NEP Matrixprotein, Kapsid Ionenkanal in Virusmembran Fördert Translation viraler mrna, IFN-Antagonist Nucelar export protein, fördert RNA Export aus Zellkern 8 Genomsegmente,11 Proteine Segment 2: alternatives Leseraster; Segmente 7 und 8: Spleissen 7

8 Replikation im Zellkern! Fig 8 Priciples of Viology I, Flint et al., s Receptor-mediated endocytosis 2. Tiefer ph (M2) Membran-Fusion RNP frei 3. Transport in den Zellkern 4. Cap stehlen (PB2) primer für RNA Replikation Produktion von viraler mrna (+ sense) 5. Virale mrnas gelangt ins Zytoplasma und.. 6. werden zt vorher gespleisst (NEP, M2) 7. mrna für Hüllenproteine (HA, NA, M2) ER PA, PB1+2, NP, PB1-F2: Translation an freien Ribosomen im Zytoplasma 10a 9. NEP, M1, NS1: Translation an freien Ribosomen im Zytoplasma 10b 10. a) Necessaire-Proteine zurück in Zellkern 11 b) M1 und NS1 Transport in Zellkern Replikation +sense Kopie 12. Produktion der Nachkommen-RNA (- sense) Nachkommen zt Vorlage für mrna 14. M1 + NEP Nachkommen-RNA Export HA, NA und M2 vom ER zum Golgi 16. HA, NA und M2 vom Golgi zur Zellmembran Nachkommen-RNA und assoziierte Proteine 18...gelangen zur Zellmembran, wo HA,NA, M1 sitzen 19. Abknospung des Partikels, NA verhindert kleben an Zell-Rezeptor 8

9 Replikation Abknospung hemagglutinin neuraminidase rezeptor Neuraminsäure Neuraminidase! 9 adaptiert aus Vorlesung Jovan Pavlovic Bio296

10 Antivirale Wirkstoffe Amantadine Oseltamivir (Tamiflu) blockiert M2 Ionenkanal blockiert aktive Stelle der NA verhindert Uncoating verhindert Ausschleusung Wirkung nur wenn rechtzeitig eingesetzt Tamiflu als Pro-drug Achtung Resistenzen! 10

11 Replikation Antivirale Wirkstoffe Film: Influenza (Flu) 11

12 Wirte es ist kompliziert! 12

13 Wirte Benjamin Mänz et al. J. Virol. 2013;87:

14 Reservoir Wasservögel = Virusträger; alle HA und NA Subtypen Virus i.d.r. apathogen Virus enteral! Ausscheidung in Kot -> Wasser Virus im Wasser rel. hohe Tenazität! Aufnahme durch empfängliche Wirte - Hausgeflügel, Schweine, Mensch... Adaptation an neuen Wirt 14

15 Strategie Hit-and-run Infektion Virusvermehrung und -ausscheidung Immunabwehr Eliminierung bereits im neuen Wirt etabliert Fitness des Wirtes spielt keine Rolle für das Virus Aber: Was machen wenn die Population durchseucht ist?? Neue Population suchen (z.b. via Zugvögel) Neuer antigenetischer Look durch Veränderung der Oberflächenproteine 15

16 Strategie Drift / Shift Drift : kleinere Veränderungen der Oberflächenantigene durch Anhäufung von Punktmutationen (HA, NA) Mutationsrate: 6,3x10-3 pro Jahr Shift : RNA Segment Reassortment ; allenfalls Transkapsidation Neue Influenza Subtypen können so entstehen Veränderte Antigenität / Eigenschaften Wirtswechsel 16

17 Strategie 17 van de Sandt CE, Kreijtz JH, Rimmelzwaan GF - Viruses (2012)

18 Strategie Schwein als Mischgefäss Zellulärer Rezeptor für HA: Sialinsäuren N-Acetylneuraminsäure- 2,3-Galactose N-Acetylneuraminsäure- 2,6-Galactose 18

19 Strategie Schwein als Mischgefäss 19

20 Strategie Schwein als Mischgefäss 2 1 Vogelspezifisch es ist etwas komplizierter 20

21 Geschichte / Epidemiologie Mensch Pandemien 1918 Spanische Grippe (H1N1): Mio Opfer 1957 Asiatische Grippe (H2N2): 1-2 Mio Opfer 1968 Hong Kong Grippe (H3N2): Opfer seither zirkulierend 1977 Russische Grippe (H1N1): Opfer seither zirkulierend (2009 Schweine Grippe (H1N1): Opfer) 21

22 Geschichte / Epidemiologie Die Spanische Grippe in der Schweiz: 22

23 Geschichte / Epidemiologie Die Spanische Grippe Wahrscheinlich in USA entstanden aus humanen und Vogel- Viren wahrscheinlich via Schwein, H1N1 Weltweite Verbreitung im Gefolge des 1. Weltkrieg 3 Wellen: Frühling 1918, Herbst 1918, Frühling 1919 Mehr Todesopfer als durch den Krieg! Hoch virulent, 2-4% Letalität (normalerweise <0.1%) Akute Symptome, hohes Fieber, zt akute Lungenhämorrhagien, Tod innert wenigen Tagen (Zytokine!) Vor allem junge Erwachsene betroffen (20-40 Jahre) Virus wurde 2005 rekonstruiert 23

24 Geschichte / Epidemiologie Die Spanische Grippe Sequenzierung des Virus aus Lungenmaterial von Lucy (Alaska, Permafrost) 24

25 Geschichte / Epidemiologie Die Spanische Grippe 25

26 Geschichte / Epidemiologie Die Schweinegrippe von 2009 Mexiko USA weltweite Pandemie Neues H1N1 Reassortment aus porzinen, aviären und humanen Viren (aber eigentlich kein klassisches Schweine- Influenza Virus!) Krankheitsfälle v.a. bei Kindern und jungen Erwachsenen Menschen >60 Jahre wahrsch. teil-immun durch frühere Infektion oder Impfung Keine erhöhte Letalität ( %) aber hohe Inzidenz und schnelle Ausbreitung Nachkommen dieses H1N1 Virus zirkulieren heute noch, lösen aber nur noch normale Grippe aus Heute in Impfstoffe integriert 26

27 Geschichte / Epidemiologie Die Vogelgrippe beim Menschen: H5N1 1997, 2003/2004 Ausbruch eines hochpathogenen H5N1 Virus bei Geflügel in China Übertagung auf Menschen Hohe Letalität beim Menschen (massive Pneumonien) aber kaum Übertagung Mensch - Mensch Direkte Übertragung von Geflügel auf Katzen (auch Grosskatzen), Hunde, Marder beobachtet Zug-/Wasservögel als Verschlepper des Virus Übertragung auf Hausgeflügel und Mensch möglich Massnahmen in der Schweiz: 2005/2006 Stallpflicht für Hausgeflügel während Vogelzug im Herbst und Frühling NICHT Bestandteil der Grippe-Impfung! 27

28 Geschichte / Epidemiologie Die Vogelgrippe beim Menschen: H5N1 Land Erkrankungen davon Todesfälle Ägypten Aserbaidschan 8 5 Bangladesh 7 1 China Dschibuti 1 0 Indonesien Irak 3 2 Kambodscha Kanada (ex China) 1 1 Laos 2 2 Myanmar 1 0 Nigeria 1 1 Pakistan 3 1 Thailand Türkei 12 4 Vietnam Gesamt ( seit 2003, Stand ) 28

29 Geschichte / Epidemiologie Die Vogelgrippe beim Menschen 29

30 Geschichte / Epidemiologie Die Vogelgrippe beim Menschen 30

31 Geschichte / Epidemiologie Die Vogelgrippe beim Menschen Enges Zusammenleben von Nutztieren und Menschen in Asien Zugvögel Import/Export Schmuggel 31

32 Geschichte / Epidemiologie Die Vogelgrippe beim Menschen Folgen Einführung von Massnahmen in Geflügelhaltung; z.t. impfen, Stallhaltungs-Vorschriften Regelmässige Überwachung von Wildvögeln (spez. Wasservögel) Einführung von Überwachungsprogrammen bei Tieren (v.a. Schwein) Überwachungsprogramm BLV/BAG: Viro ZH Etablierung von Pandemieplänen Etablierung von Medikamenten und Impfstofflagern 32

33 Geschichte / Epidemiologie Andere aviäre, zoonotische Influenzaviren H9N2: Hong Kong und einige andere chinesische Städte Einzelfälle, v.a. Kinder, 1998/9, 2003, 2008, 2009 H7N7: 2003 Niederlande; 83 Personen betroffen (1 gestorben: 57-jähriger Tierarzt ) Auffällig häufig: Konjunktivitis (NS2,3 Rezeptoren!) H7N9: Seit Frühjahr 2013, China -> Report 8. Mai 2013: 131 Personen, 37 gestorben; breitet sich weiter aus 33

34 Geschichte / Epidemiologie Grippesaison 2015/2016 (Mensch) 34

35 Geschichte / Epidemiologie Grippesaison 2015/2016 (Mensch) Aktuelle Woche Schweiz in Woche 7/2016 Anteil Influenza-positiver Proben (Anzahl untersuchte Proben) 55% (31) Kumulativ 36% (520) B 71% 54% A(H3N2) 0% 8% A(H1N1)pdm09 12% 36% A nicht subtypisiert 17% 2% Europa in Woche 6/2016 Anteil Influenza-positiver Proben (Anzahl untersuchte Proben) 44% (2923) 29% (27022) B 31% 28% A(H3N2) 6% 10% A(H1N1)pdm09 57% 59% 63% der untersuchten Influenzaviren werden durch den saisonalen trivalenten Grippeimpfstoff abgedeckt - bei den nicht abgedeckten handelt es sich um Influenza B Viren der Victoria-Linie. Durch den quadrivalenten Grippeimpfstoff werden hingegen alle untersuchten Influenza A und B Viren abgedeckt. A nicht subtypisiert 6% 3% 35

36 Geschichte / Epidemiologie Grippesaison 2015/2016 (Mensch) 36

37 Influenza beim Schwein 37

38 Influenza beim Schwein Pathogenese V.a. im Winterhalbjahr Aerogene Übertragung Tröpfchen: je kleiner (1µm) umso tiefer in Respirationstrakt Haftung an Mukoproteinen -> Schleimabbau durch Neuraminidase Zielzellen = respiratorische Epithelzellen Zellzerstörung Regeneration ev. enteral -> Durchfall Achtung: bakt. sekundäre Infektionen u.u. Virämie und Generalisierung -> Abort 38

39 Influenza beim Schwein Erreger Europa (Stand 2015) H1N1, H1N2, H3N2 Klinik Fieber C (sehr) schlechtes Allgemeinbefinden während 3-6 Tagen, Aborte; Todesfälle möglich (bis zu 2-3%) Husten, Niesen, Nasenausfluss IdR Genesung innert 1 Woche Hohe Durchseuchungsrate! Wie bei Mensch und Geflügel: Stärke der Symptome beeinflusst durch Umgebungsfaktoren, Virustyp, innates Immunsystem, 39 (Zytokine,Entzündungsmediatoren)

40 Influenza beim Schwein Übertragung Mensch Schwein H1N1pdm09 Schweinegrippe?? Erster Fall: Alberta Kanada Mensch Schwein: Ansteckung durch einen Betreuer Schweine / 450 erkrankt / alle ausgemerzt 2. Schwein Mensch: Infektion der Probenehmer Zweiter Fall: Argentinien (Provinz Buenos Aires) 2009 Mensch Schwein 2 Betreuer hatten Flu-ähnl. Symptome (o.diagn.) Schweine / erkrankt / alle erholt Experimentelle Infektion: wie normale Schweinegrippe 40

41 Influenza beim Schwein Prophylaxe / Therapie Kein Impfung in CH Impfungen erhältlich in DE und A (Schutz vor Abort und Masteinbussen) Keine spezifische Therapie, Verhinderung sekundärer Infektionen, Entzündungshemmer, Stallklima optimieren Diagnose Virusnachweis: RT-PCR Nasentupfer, BAL; nur akut erkrankte Tiere testen!!! Antikörper: ELISA, Hämagglutinationshemmtest HHT; nur gepaarte Serumproben aussagekräftig!!! 41

42 Influenza beim Geflügel 42

43 Influenza beim Geflügel = Hühnergrippe, Klassische Geflügelpest Atypische Geflügelpest=Newcastle Disease: Paramyxoviridae, Avulavirus Zwei Biotypen versch. Krankheitsbilder low pathogenic (LPAI) viele Subtypen (16 H, 9 N) Wasservögel (Reservoir!) Wildvögel high pathogenic (HPAI) H5 und H7 Subtypen (H9) v.a. Nutzgeflügel ev. Wildvögel Unterschied? HA Spaltstelle! Mutationen (Drift, Insertionen, Deletionen) können aus LPAI HPAI machen 43

44 Influenza beim Geflügel Hühnergrippe : Pathogenese Fusions peptid 44

45 Influenza beim Geflügel Hühnergrippe : Pathogenese HA2 HA1 Fusionspeptid Muss frei sein Virusmembran 45

46 Influenza beim Geflügel Hühnergrippe : Verlaufsformen Enteraler Verlauf: Kot, Wasser Inapparent Respiratorischer Verlauf: Husten, Niesen, Aerosol Krank, je nach Virulenz und Abwehrstatus (Immunität/Zytokinschock) Generalisierter Verlauf: Alle Sekrete, Exkrete und Organe (Fleisch) Tödlicher Verlauf LPAI HPAI 46

47 Influenza beim Geflügel Hühnergrippe : Verlaufsformen Klinik HPAI ( Geflügelpest ) Leitsymptome: Fieber, Rhinitis, Sinusitis, Oedeme, Zyanose Zusätzlich: ZNS-Störungen, Durchfall Auch möglich: Plötzlicher Tod, prakt. symptomlos da Tod zu rasch eintritt 47

48 Influenza beim Geflügel Hühnergrippe : Verlaufsformen Klinik HPAI ( Geflügelpest ) Leitsymptome: Fieber, Rhinitis, Sinusitis, Oedeme, Zyanose Zusätzlich: ZNS-Störungen, Durchfall Auch möglich: Plötzlicher Tod, prakt. symptomlos da Tod zu rasch eintritt 48

49 Influenza beim Geflügel Ausbruch der Geflügelpest (HPAI) H5N8 in Deutschland

50 Influenza beim Geflügel Weitere Ausbrüche in Europa 2014: Grossbritannien Holland Italien mehrere Tiere vernichtet NZZ.ch: Eier und Hühner landen auf der Müllkippe: Auf der Geflügelfarm in Hekendorp nahe Gouda sind Hühner 50 getötet worden, nachdem das gefährliche Virus H5N8 nachgewiesen wurde. (Bild: Reuters)

51 Influenza beim Geflügel Importverbot für lebendes Geflügel und rohes Fleisch aus betroffenen Gebieten! 51

52 Influenza beim Pferd Skalma, früher auch Pferdestaupe Viren: (Subtyp 1: Prototyp = A/equi 1/Prag/56 H7N7) Subtyp 2: Prototyp = A/equi 2/Miami/63 H3N8 Aktuell: H3N8 Stämme; eurasische Linie amerikanische Linie Antigenetisch relativ stabil Impfvirusstämme nicht jährlich angepasst Keine Übertragung auf Mensch Klinik: Respiratorische Symptome, Fieber, geschwollene Lymphknoten In der Schweiz jährliche Impfung vorgeschrieben für Turnierpferde, idr alle 2 Jahre kombiniert mit Tetanus (umstritten wegen antigenetischem Konkurrenzkampf!) 52

53 Influenza beim Pferd, Impfungen Stand Februar 2016 Duvaxyn IE Plus ad us. vet. Wirkstoffe Inaktiviertes Influenzavirus, Stamm A/equi-1/Prag/56 (H7N7) Inaktiviertes Influenzavirus, Stamm A/equi-2/Newmarket 1/93 (H3N8, American) Inaktiviertes Influenzavirus, Stamm A/equi-2/Suffolk/89 (H3N8, European) Equilis Resequin, ad us. vet. Wie Duvaxyn, + EHV-1+4 Equilis Prequenza ad us. vet. Wirkstoffe Inaktiviertes Influenzavirus, A/equi-2/South Africa/4/03, (H3N8, American) Inaktiviertes Influenzavirus, A/equi-2/Newmarket/2/93, (H3N8, European) Lebendimpfstoff: ProteqFlu ad us. vet. Wirkstoffe Influenza A/equi-2/Ohio/03 (H3N8, American)-Rekombinante des Kanarienpockenvirus (Stamm vcp2242) Influenza A/equi-2/Richmond/1/07 (H3N8, American)-Rekombinante des Kanarienpockenvirus (Stamm 53 vcp3011)

54 Influenza beim Pferd Pferdeinfluenza beim Hund 2004/5: H3N8 erstmals bei Windhunden (Rennbahn USA) festgestellt, wahrsch. bereits ab 1999 erste Übertagung Pferd Hund, danach Hund Hund, hohe Morbidität, rel. geringe Letalität. Bisher nur in den USA, dort gibt es auch Impfungen. 54

55 Bekämpfung/Überwachung Influenza Geflügel: Meldepflichtige Tierseuche, Ausmerzung Schwein: Symptombehandlung (keine Impfung in CH) Pferd: Impfung Mensch: Impfung; Antiviralia Aktive Überwachung beim Geflügel, passive Überwachung bei Schweinen und Wildvögeln 55

56 Influenza Diagnostik Virusnachweis: - Virusisolation: bebrütetes Hühnerei (aviäre Viren), spez. Zelllinien (Säuger Viren) - (real-time) RT-PCR Nature Protocols 9, (2014) doi: /nprot

57 Influenza Diagnostik Virustitration: Hämagglutinationstest Virus: Hämagglutination Kein (zu wenig) Virus: Keine Hämagglutination Virustiter (in HA Einheiten): Letzte Virus-Verdünnung mit vollständiger Hämagglutination Nature Protocols 9, (2014) doi: /nprot

58 Antikörpernachweis: Influenza Diagnostik ELISA (z.b. anti-np-antikörper, nicht-neutralisierend) Single radial diffusion (SRD) Test (ähnl. Coggins) Hämagglutinationshemmtest (Anti-HA-Antikörpern, neutralisierend) Hämagglutination (keine, zu wenige Ak) Keine Hämagglutination (viele Ak HA neutralisiert) Antikörper-Titer: Letzte Ak-Verdünnung ohne vollständiger Hämagglutination 58

59 Das Wichtigste in Kürze Ursprünglicher Hauptwirt: Wasservögel meist enteral, inapparent Klinische Infektionen v.a. bei Mensch, Schwein, Geflügel, Pferd; dort v.a. respiratorisch Wirtsspezifität und Lokalisation hängt von Rezeptor für HA ab (2,6 / 2,3) Schwein als mixing vessel da Rezeptoren für aviäre und humane Viren Binäres Einteilungssystem: H(ämagglutinin)/N(eruaminidase) Strategie: Antigenetische Veränderung durch Drift (Punktmutationen) und Shift (Reassortment = Mischung von Genom-Segmenten versch. Herkunft) Mensch: Mehrere grosse Pandemien durch Reassortanten, wichtigste: 1918 Spanische Grippe H1N1; Vogelgrippe (zb H5N1): Letalität hoch aber kaum Mensch Mensch Übertr. Schwein: respiratorisches Bestandesproblem, nicht anzeigepflichtig Geflügel: LPAI HPAI, je nach HA-Spaltung; klassische Geflügelpest anzeigepflichtig! Pferd: Keine Übertragung auf Mensch, aber zt auf Hund, Impfung in CH für Turnierpferde obligatorisch Diagnostik: Hämagglutination (Virusnachweis), HA-Hemmtest (Ak- Nachweis, RT-PCR, ELISA 59