PakPlus Test GEBRAUCHSANLEITUNG INHALTSVERZEICHNIS

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1 GEBRAUCHSANLEITUNG PakPlus Test REF PAKPLUS IVD INHALTSVERZEICHNIS GEBRAUCHSANLEITUNG... 2 ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNGEN... 2 TESTPRINZIP... 2 REAGENZIEN... 2 VORSICHTSMAßNAHMEN... 3 WARNHINWEIS... 3 PROBENGEWINNUNG... 3 DURCHFÜHRUNG... 3 Mitgelieferte Materialien... 3 Zusätzlich benötigte Materialien... 4 Testdurchführung... 4 QUALITÄTSKONTROLLE... 6 INTERPRETATION DER ERGEBNISSE... 6 EINSCHRÄNKUNGEN... 7 SPEZIFISCHE CHARAKTERISTIKA DER DURCHFÜHRUNG... 7 REFERENZLITERATUR ÜBERSETZUNG DER SYMBOLE PakPlus Test IFUDE REV G

2 GEBRAUCHSANLEITUNG Der PakPlus Test ist ein qualitativer Festphasenenzymimmunoassay (ELISA) zum Screening auf Antikörper gegen HLA Klasse I und Thrombozytenglykoprotein (GP) IV Antigene und gegen polymorphe Epitope auf den Thrombozytenglykoproteinen IIb/IIIa, Ib/IX und Ia/IIa. ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNGEN Die Existenz von Thrombozyten spezifischen Antigenen auf verschiedenen Thrombozytenglykoproteinen wurde in vielen Untersuchungen beschrieben. 1-5 Antikörper gegen Thrombozten spezifische oder HLA Klasse I Antigene nach Schwangerschaft oder Transfusion können zur immunen Zerstörung transfundierter Thrombozyten führen Die Bestätigung der Anwesenheit dieser Antikörper in Patientenproben hilft bei der Suche nach geeigneten Blutprodukten. Die Vertiefungen des PakPlus ELISA sind mit Thrombozytenglykoproteinen IIb/IIIa und Ia/IIa von Spendern der Blutgruppe 0 mit bekannten Thrombozyten-Phänotypen beschichtet und werden mit Hilfe monoklonaler Antikörpern an die feste Phase gebunden. Die HLA Klasse I Antigene und Thrombozytenglykopoteine Ib/IX und IV liegen als affinitätsgereinigte Glykoproteine vor und werden direkt beschichtet. Der Test dient dem Nachweis und der Differenzierung von Antikörpern gegen HLA Klasse I und Thrombozyten spezifische Antigene. Entnehmen Sie die Beschichtung der Vertiefungen dem Protokollbogen/Recording Sheet. TESTPRINZIP Patientenserum wird in die Vertiefungen, die mit Thrombozyten- und HLA Glykoproteinen beschichtet sind, pipettiert. Vorhandene Antikörper binden an die Glykoproteine. Nach einem Waschschritt, bei dem nicht gebundene Antikörper entfernt werden, wird ein mit alkalischer Phosphatase markiertes Anti-Human IgG/A/M zugefügt und inkubiert. In einem weiteren Waschvorgang wird überschüssiges Konjugat entfernt und das PNPP-Substrat zugefügt. Nach 30 Minuten Inkubtion wird die Reaktion mit Stopplösung abgestoppt. Die optische Dichte (OD) des Farbumschlags wird in einem ELISA-Reader photometrisch ausgewertet. REAGENZIEN Maximale Anzahl an Bestimmungen pro Testpackung: PAKPLUS: 5 Tests pro Testpackung Lagern Sie die Reagenzien wie auf dem Label angegeben. REF MS TCW SD SB ESS Mikrowell Strips: die Flachbodenvertiefungen der Teststreifen sind beschichtet mit immobilisierten Thrombozyten- und HLA Glykoproteinen. Die Teststreifen sind in einem wieder verschließbaren Beutel.. Gebrauchsfertig Waschlösungskonzentrat (10 X konzentriert): TRIS Aminomethan gepufferte Lösung mit Na- Cl 2 und TWEEN 20; enthält 1% Natrium-Azid. Vor Gebrauch mit deionisiertem oder destilliertem Wasser verdünnen. Diese Waschlösung kann bis zu 48 Stunden bei Raumtemperatur oder bis zu 7 Tagen bei 2-8 C gelagert werden Probenverdünnungspuffer: Phosphat gepufferte saline Lösung mit Rinderalbumin und Mausserum; enhält 0,1% Natrium-Azid. Gebrauchsfertig Substratpuffer: enthält Diethanolamin, MgCl 2 und 0,02% Natrium- Azid. Gebrauchsfertig. Dunkel aufbewahren Stopplösung: Gebrauchsfertig. AH PN PC Anti-Human IgG/A/M Konjugat: ein mit alkalischer Phosphatase markierter gereinigter Antikörper von der Ziege, gerichtet gegen humanes (IgG/A/M); enthält 0,1% Natrium-Azid. Vor Gebrauch mit Probenverdünnungspuffer verdünnen PNPP Substrat: (p-nitrophenylphosphat) kristallines Pulver. In deionisiertem oder destilliertem Wasser auflösen und vor Gebrauch mit Substratpuffer verdünnen. Dunkel aufbewahren, Positives Kontrollserum: humanes Serum; enthält 0,1% Natrium-Azid. Vor Gebrauch mit Probenverdünnungspuffer verdünnen. PakPlus Test IFUDE REV G

3 NC PS Negatives Kontrollserum: humanes Serum; enthält 0,1% Natrium-Azid. Vor Gebrauch mit Probenverdünnungspuffer verdünnen Abklebefolien. VORSICHTSMAßNAHMEN Verwenden Sie keine trüben oder kontaminierten Reagenzien. Vermeiden Sie jede Kontaminationen des Verdünnungspuffers und des Konjugats. Kontamination dieser Reagenzien mit humanem Serum führt zur Neutralisation des Konjugats und damit zum Testausfall. Verwenden Sie keine Reagenzien nach ihrem Verfallsdatum. Verwenden Sie weder die Teststreifen noch die Reagenzien aus der Testpackung in Verbindung mit einem anderen Test. Verwenden Sie nur die Reagenzien aus der Testpackung bzw. tauschen Sie keine Reagenzien aus, um falsche Ergebnisse auszuschließen. Verwerfen Sie nach jedem Testansatz die verdünnten Konjugate, Kontrollen und Substrate. Öffnen Sie bei Verwendung eines Inkubators für die Inkubationsschritte die Tür so selten wie möglich, um interne Temperaturschwankungen zu vermeiden. Verwenden Sie für die Herstellung der Verdünnungen ausschließlich kalibriertes Material in der entsprechenden Technik. Die enzymatische Substratreaktion im letzten Inkubationsschritt ist Temperatur abhängig und sollte bei C durchgeführt werden. WARNHINWEIS Alle Kontrollen humanen Ursprungs werden auf die Abwesenheit von HIV/HCV/HB s-ag mit FDA zugelassenen Testsystemen untersucht. Dennoch sollten alle Materialien als potentiell infektiös behandelt und entsprechend entsorgt werden, da keine Methode eine 100% Sicherheit bietet. Einigen Reagenzien ist Natrium-Azid als Konservierungmittel zugesetzt. Warnung; Natrium-Azid reagiert mit Blei- und Kupferverbindungen und es können sich hochexplosive Metallsäuren bilden. Spülen Sie alle Kontaktflächen wie z.b. das Spülbecken mit reichlich Wasser, um dieses zu verhindern. Natrium-Azid ist ein Gift und wirkt im Körper toxisch. Entsorgen Sie alle restlichen Packungsbestandteile fachgerecht. PROBENGEWINNUNG Entnehmen Sie das Blut ohne Zusatz von Antikoagulantien (Serum) unter den üblichen aseptischen Bedingungen und verwenden Sie es möglichst frisch, um falsch positive oder negative Ergebnisse durch zu lange Lagerung oder Kontamination der Probe auszuschließen. Trennen Sie das Serum für die Lagerung oder den Versand von den übrigen Blutbestandteilen. Proben, die nicht sofort abgearbeitet werden können, sollten bei 2-8 C bis zu 48 Std. aufbewahrt werden. Bei -80 C eingefrorene Proben können bis zu 3 Jahren aufgehoben werden. Um jedoch den Ausfalleffekt von wiederholten Auftau / Einfrierzyklen zu verhindern, sollten Sie die Proben aliquotieren und einfrieren. Lagern Sie die Proben nicht in No-Frost Gefrierschränken. Partikel oder Ausflockungen in der Probe können zu falsch positiven Ergebnissen oder zu schlechten Doppelbestimmungen führen. Zentrifugieren Sie diese Proben vor ihrer Austestung ab. DURCHFÜHRUNG Mitgelieferte Materialien Die Vials enthalten z.t. mehr Reagenz, als auf dem Label angegeben. Entnehmen Sie deshalb immer die benötigten Mengen für die Verdünnungen mit kalibrierten Pipetten x 8 Teststreifen 2. 1 x 50 ml Waschlösungskonzentrat (10X) 3. 1 x 14 ml Probenverdünnungspuffer 4. 1 x 14 ml Substratpuffer 5. 1 x 14 ml Stopplösung 6. 1 x 80 µl Anti-Human IgG/A/M Konjugat 7. 3 x 50 mg PNPP Substrat 8. 1 x 0.3 ml positives Kontrollserum 9. 1 x 0.7 ml negatives Kontrollserum Abklebefolien PakPlus Test IFUDE REV G

4 Zusätzlich benötigte Materialien 1. Polypropylenröhrchen für die Verdünnungen der Proben, Kontrollen und Reagenzien 2. Transferpipetten 3. Variable Pipetten: µl und µl und Einwegspitzen 4. Timer 5. ELISA- Reader mit einer Wellenlänge von 405 oder 410 nm und einer Referenzwellenlänge von 490 nm 6. Deionisiertes oder destilliertes Wasser 7. Papiertücher 8. Washer oder Handwaschgerät 9. Zentrifuge zur Trennung des Serum von der Patientenprobe 10. Wasserbad oder Inkubator Temperaturbereich 37 o C + 1 o C 11. Den chargenspezifischen Protokollbogen finden Sie auf unserer Webseite: ( 12. Laborfeuchttücher Testdurchführung 1. Bringen Sie alle Reagenzien auf Raumtemperatur. 2. Stellen Sie die benötigte Waschlösung her, indem Sie das Waschlösungskonzentrat 1:10 mit deionisiertem oder destilliertem Wasser verdünnen (1 Teil Waschlösungskonzentrat + 9 Teile dest. Wasser) und gut mischen. 3. Legen Sie die Anzahl der zu testenden Proben fest. Weisen Sie mit Hilfe des Protokollbogen/Recording Sheet jeder Probe ihre Positionen (2 Teststreifen je Probe) zu. Dokumentieren Sie die ID jeder Probe auf dem Protokollbogen. Vorbereitung der Proben und Kontrollen 4. Verdünnen Sie die Proben und Kontrollen mit Probenverdünnungspuffer (SD) wie in der folgenden Tabelle angegeben. Gut mischen. Volumen Probenverdünnungspuffer (SD) Volumen Probe PC 150 µl 50 µl NC 600 µl 200 µl Patientenprobe 600 µl 200 µl 5. Entnehmen Sie die benötigte Anzahl von Teststreifen aus der Verpackung und verschließen Sie den Beutel mit den nicht benötigten Streifen nach Entnahme. Jede Testpackung enthält nur einen Halterahmen. Heben Sie den Rahmen für weitere Tests auf. Positionieren Sie den Rahmen so, dass die Vertiefung A1 oben links ist. Kontrollieren Sie den richtigen Sitz und das Einrasten der Streifen im Rahmen. Beschriften Sie die Streifen, um Verwechselungen auszuschließen. Behalten Sie diese Positionierung während der Testdurchführung bei. 6. Geben Sie 300 µl Waschlösung in jede Vertiefung und lassen Sie alles bei Raumtemperatur für 5-10 Minuten stehen. 7. Verwerfen Sie den Inhalt und klopfen Sie den Rahmen auf einem saugfähigen Papiertuch aus, um alle Flüssigkeitsreste zu entfernen. 8. Pipettieren Sie 50 µl der verdünten Kontrollen und Proben in die entsprechenden Vertiefungen (siehe Protokollbogen). Entfernen Sie vorsichtig evt. auftretende Luftblasen in den Vertiefungen. Verhindern Sie ein carry over zwischen den Vertiefungen. Die Blank-Vertiefungen bleiben leer. Pro Ansatz sind die Kontrollen nur einmal erforderlich. Werden pro Testansatz mehrere Proben ausgetestet, sollten Sie die Streifen beschriften, um Verwechselungen auszuschließen. 9. Versiegeln Sie die Vertiefungen mit Abklebefolie und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 C im Wasserbad oder 40 Minuten bei 37 C im Inkubator. PakPlus Test IFUDE REV G

5 10. Verdünnen Sie wie in der folgenden Tabelle angegeben das Konjugat (AH) 1:100 mit dem Probenverdünnungspuffer (SD) in einem Polypropylenröhrchen. Teststreifen # Konjugat (AH) Probenvedünnungspuffer (SD) 2 2 x 8 20 µl 2,0 ml 6 2 x 8 60 µl 6,0 ml Das Konjugat ist viskos. Ziehen Sie es deshalb 2-3 Mal vorsichtig auf und vermischen Sie es gut mit dem Probenverdünnungspuffer. 11. Waschschritte a) Verwerfen Sie den Inhalt aller Vertiefungen und klopfen Sie den Rahmen auf einem saugfähigen Papiertuch aus. b) Pipettieren Sie 300 µl Waschlösung in jede Vertiefung. c) Verwerfen Sie den Inhalt aller Vertiefungen. d) Waschen Sie die Vertiefungen 4 x wie unter b) und c) beschrieben. e) Verwerfen Sie abschließend den Inhalt aller Vertiefungen und klopfen Sie den Rahmen auf einem saugfähigen Papiertuch aus, um alle Flüssigkeitsreste zu entfernen. 12. Geben Sie 50 µl des verdünnten Konjugats in alle Vertiefungen mit Ausnahme der Blanks. Entfernen Sie evt. auftretende Luftblasen in den Vertiefungen. 13. Versiegeln Sie die Vertiefungen mit Abklebefolie und inkubieren. 30 Minuten bei 37 C im Wasserbad oder 40 Minuten bei 37 C im Inkubator. 14. Lösen Sie das kristalline PNPP-Substrat in 0.5 ml deionisiertem oder destilliertem Wasser und mischen Sie es gut durch, indem Sie den Verschluß wieder einsetzen und das Vial gut schütteln. Bis zur weiteren Verwendung vor Licht schützen. 15. Verdünnen Sie wie in der folgenden Tabelle angegeben das PNPP (PN) 1:100 mit dem Substratpuffer (SB). Teststreifen # PNPP Substrat (PN) 2 2 x 8 40 µl 4,0 ml 6 2 x µl 12,0 ml Gut mischen! Vor Licht schützen. Substratpuffer (SB) Achtung: Vermeiden Sie eine Kontamination der Substratarbeitslösung mit dem Konjugat aus den Schritten zuvor. 16. Waschschritte a) Verwerfen Sie den Inhalt aller Vertiefungen und klopfen Sie den Rahmen auf einem saugfähigen Papiertuch aus. b) Pipettieren Sie 300 µl Waschlösung in jede Vertiefung. c) Verwerfen Sie den Inhalt aller Vertiefungen. d) Waschen Sie die Vertiefungen 4 x wie unter b) und c) beschrieben. e) Verwerfen Sie abschließend den Inhalt aller Vertiefungen und klopfen Sie den Rahmen auf einem saugfähigen Papiertuch aus, um alle Flüssigkeitsreste zu entfernen. 17. Entfernen Sie evt. auftretende Luftblasen in den Vertiefungen. Wischen Sie die Unterseite der Teststreifen mit einem feuchten Labortuch ab. Gehen Sie zügig durch die nächsten 3 Schritte. 18. Geben Sie 100 µl der verdünnten PNPP-Lösung in jede Vertiefung mit Ausnahme der Blanks. 19. Die Reaktionsansätze im Dunkeln exakt 30 Minuten bei Raumtemperatur (22-25 C) inkubieren. Die Inkubationszeit bzw. -temperatur nach Zugabe des PNNP ist kritisch. Halten Sie sie genau ein und starten Sie die Zeit mit der Zugabe des PNPP in die erste Vertiefung µl Stopplösung in gleicher Abfolge wie das Substrat in alle Vertiefungen geben. Geben Sie in die Blanks 200 µl Stopplösung. PakPlus Test IFUDE REV G

6 21. Die Reaktionen werden nach dem Stoppen im ELISA-Reader bei 405 oder 410 nm und einer Referenzwellenlänge von 490 nm ausgewertet. Lassen Sie die Streifen im Dunkeln bis zu max. 30 Minuten stehen, wenn die Auswertung nicht sofort nach dem Abstoppen gemacht werden kann. 22. Ziehen Sie die Blank OD-Werte von den Proben und Kontrollen ab. Bei vielen ELISA-Readern läßt sich dieses programmieren. 23. Übertragen Sie Ihre Ergebnisse auf den chargenspezifischen Protokollbogen. Spenderphenotypen für GPIIb/IIIa (Reihe A und B) können von Charge zu Charge wechsel wie Sie dem chargenspezifischen Protokollbogen entnehmen können. QUALITÄTSKONTROLLE Die Qualitätskontrolle des PakPlus wird durch den Einbau einer positiven und negativen Serumkontrolle ins Testsystem festgelegt. Diese sollten in jedem Testansatz.eingeschlossen sein, um technische Fehler oder Reagenzienausfälle auszuschließen. Kriterien für einen validen Test: Negative Kontrolle (IIb/IIIa Reihen) OD-Mittelwert Negative Kontrolle (alle Reihen) innerhalb + 35% des OD MW der Reihe Positive Kontrolle (HLA) OD-Mittelwert > Die OD-Werte der Doppelbestimmungen der positiven Testergebnisse (Proben und positive Kontrolle) sollten nicht mehr als 20% vom Mittelwert beider Werte abweichen. Proben außerhalb dieses Bereichs müssen wiederholt werden. Eine positive Kontrolle außerhalb dieses Bereichs ist invalide und der Test sollte wiederholt werden. Die OD-Werte der Doppelbestimmungen der negativen Proben müssen nicht in diesen Bereich von 20% Abweichung vom Mittelwert beider Werte fallen. Jedoch sollten die OD-Werte der cutoff-bestimmungen für das Antigen nicht außerhalb des Bereichs liegen, sonst sind die Ergebnisse invalide und müssen wiederholt werden. Die OD-Werte der Doppelbestimmungen der negativen Kontrolle sollten nicht mehr als 35% vom Mittelwert abweichen. Messungen mit mehr als 35% Abweichung vom Mittelwert sind invalide und der Test muss wiederholt werden. Die Gründe für schlechte Doppelbestimmungen können vielfältig sein: Fehler beim Pipettieren der Proben und Reagenzien, Fehler bei den Inkubationszeiten bzw. -temperaturen, das Auslassen des Abwischens der Unterseite der Teststreifen vor dem Einsatz in den Reader, falsche Volumina oder Verschleppungen. All dieses kann zu falschen Ergebnissen führen. Die positive Serumkontrolle enthält Antikörper gegen HLA Klasse I Antigene. Diese Kontrolle dient der Kontrolle der Reagenzien und der technischen Durchführung. Sie dient nicht der Kontrolle von besonderen Antigen/Antikörper Reaktionen. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE Bestimmen Sie den Cutoff für jedes Antigen (Reihe) wie folgt: 1. Bestimmen Sie den Mittelwert der Doppelbestimmungen der negativen Kontrolle für jedes Antigen (Reihe). 2. Multiplizieren Sie den OD-Mittelwert der NC mit dem Cutoff Multiplier (siehe Protokollbogen) und notieren Sie den Wert in das entsprechende Feld der Cutoff-Spalte. Bestimmen Sie für jede Probe das Resultat für jedes Antigen (Reihe) wie im Folgenden beschrieben: 1. Errechnen Sie den OD-Mittelwert für jedes Paar der Probendoppelbestimmungen. 2. Vergleichen Sie den Mittelwert mit dem NC Cutoff der Reihe. Sie haben 2 mögliche Resulte für jedes Antigen (Reihe): Negativ oder Positiv, die sich wie folgt ergeben: a. Wenn der OD-Mittelwert < cutoff ist, ist das Ergebnis Negativ. b. Wenn der OD-Mittelwert > cutoff ist, ist das Ergebnis Positiv. 3. Bestimmen Sie das endgültige Ergebnis für jedes Glykoprotein wie folgt: a. Nicht auswertbare Ergebnisse für eine Probe: eine positive Probe in den Reihen A-D plus E und/oder F ist nicht auswertbar für GP IIb/IIIa, GP Ia/IIa, GP Ib/IX und GP IV. Diese pan-reaktiven Ergebnisse passen nicht in ein PakPlus Test IFUDE REV G

7 Muster von Alloantikörper-Spezifität und weisen auf die Anwesenheit von freien Autoantikörpern, auf unspezifische Bindungen oder auf andere Ursachen unbekannter Art hin. Hinweis: dieses bezieht sich nicht auf die HLA Klasse I. b. Für GP Ib/IX, GP IV und HLA Klasse I (Reihe E, F und G) ist das endgültige Ergebnis das Ergebnis des Antigens der Reihe. c. Für GP IIb/IIIa: Wenn A und B beide Negativ sind, ist das Ergebnis für GP IIb/IIIa Negativ. Wenn A oder B Positiv sind, und die alternierende Antigenreihe Negativ ist, ist das Ergebnis für GP IIb/IIIa Positiv. Wenn A und B Positiv sind, ist das Ergebnis für GP IIb/IIIa Positiv. d. Für GP Ia/IIa beziehen Sie sich auf folgende Tabelle: Interpretation für GPIa/IIa (Reihe C und D) Reihe C Resultat Reihe D Resultat Interpretation Negativ Negativ Negativ für Antikörper gegen GP Ia/IIa Negativ Positiv Positiv Positiv Negativ Positiv Positiv für Antikörper gegen GP Ia/IIa Positiv oder nicht auswertbar für Antikörper gegen GPIa/IIa. Siehe ** unten. EINSCHRÄNKUNGEN ** Bei Ergebnissen, bei denen sowohl C wie auch D Positiv sind, dividieren Sie den höheren OD-Mittelwert durch den geringeren OD-Mittelwert. Eine Ratio von > 3,0 sollte als positiv für einen Antikörper gegen GP Ia/IIa, eine Ratio von <3,0 sollte als nicht auswertbar für GP Ia/IIa bewertet werden. Kontaminationen der Reagenzien, falsche Inkubationszeiten bzw. temperaturen, unzureichendes Waschen und Ausklopfen der Vertiefungen, falsche Volumina, Streulicht bei der Substratinkubation oder Auslassung von Schritten bei der Abarbeitung, führen zu falschen Ergebnissen. Dieser Test ist ein Screeningtest. Die Testergebnisse alleine sollten nicht Basis der klinischen Entscheidung sein Einige schwache Titer oder Antikörper geringer Avidität werden u.u. nicht erfaßt und können zu falsch negativen Ergebnissen führen Antikörper gegen Thrombozyten spezifische Antigene, die auf dem Recording Sheet nicht aufgeführt sind, werden nicht erfaßt. Die Anwesenheit weiterer polymorpher HPA-Varianten auf GP IIb/IIIa (HPA-6, 7, 8, 9, 10, 11, 14, 16, 17, 19, 20, 21), GPIb/IX (HPA-12) and GPIa-IIa (HPA-13, 18) wurden nicht für die Antigenauswahl im PakPlus berücksichtigt. Antikörper gegen diese Varianten können im Test reaktiv sein. Antikörper gegen seltene HLA Klasse I Antigene werden im Test u.u. nicht erfaßt. PakPlus wurde nicht für den Nachweis von Autoantikörpern gegen Thrombozytenantigene evaluiert. SPEZIFISCHE CHARAKTERISTIKA DER DURCHFÜHRUNG Präzision Die Between-Assay Präzision wurde beurteilt mit CLSI EP12-A2, User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline. Ein Set vo 5 Serumproben wurde in Doppelbestimmung in 20 verschiedenen Tests getestet. Jede der 5 Proben enthielt einen Antikörper gegen eines der 5 Glykoproteine, die im PakPlus nachgewiesen werden: GPIIb/IIIa, GPIa/IIa, GPIb/IX, GPIV, und HLA Class I. Es bestand eine 100% Übereinstimmung der qualitativen Ergebnisse über alle 20 Tests für alle getesteten Proben. Die Gesamtabweichungen der OD-Werte in %CV lag zwischen 4,4 (1,139 OD-Durchschnitt) und 14,9 (0,064 OD-Durchschnitt), abhängig vom Antigen und dem OD-Wert der Probe. Reproduzierbarkeit Die Reproduzierbarkeit wurde in einer Multi-Center-Studie an 3 verschiedenen Orten untersucht: Immucor GTI Diagnostics, Inc., the Blood Center of Wisconsin (Milwaukee, Wisconsin) and Puget Sound Blood Center (Seattle, Washington). An jedem Ort haben 2 Untersucher ein Panel von 5 Proben mit dem PakPlus getested, um die Between-Run Variabilität zu beurteilen. Jede Probe war reaktiv auf ein einzelnes PakPlus Antigen und negativ auf alle anderen. Jede Probe wurde in 20 verschiedenen Tests PakPlus Test IFUDE REV G

8 von 6 Untersuchern (2 Personen pro Ort) untersucht. Die folgende Tabelle zeigt eine Zusammenfassung der Ergebnisse der Austestung der 5 Proben in 20 verschiedenen Tests durch 6 Untersucher. PakPlus Between-User Reproduzierbarkeit # Probe Zu erwartende Antikörper Testanzahl Positive (von 120) % positive Übereinstimmung Testanzahl Negative (von 480) % negative Übereinstimmung 1 GPIIb/IIIa (HPA-1a) % % 2 HLA % % 3 GPIV % % 4 GPIb/IX % % 5 GPIa-IIa (HPA-5b) % 479* 99.8% *Probe 5 hatte ein falsch positives Resultat für die HLA Klasse I. Die Gesamtabweichung (Total CV) der OD-Werte, berechnet auf alle Untersucher, lag zwischen 7,4% (1,379 OD-Durchschnitt) und 26,6% (0,048 OD-Durchschnitt), abhängig vom Antigen, der Probe und dem OD-Wert. Lot-To-Lot Variabilität Abweichungen zwischen den Chargen des PakPlus wurde in einer Studie untersucht, die ein Set von 5 Serumproben- jedes enthielt einen Antikörper gegen eines der 5 Glykoproteine, die im PakPlus nachgewiesen werden können: GPIIb/IIIa, GPIa/IIa, GPIb/IX, GPIV und HLA Class I. Jede Probe wurde in 3 Chargen PakPlus getested. Es besteht eine 100% Übereinstimmung zwischen den qualitativen Ergebnissen der getesteten Proben mit allen 3 Chargen. Die Gesamtabweichungen der OD-Werte in %CV lag zwischen 1,4% (0,827 OD-Durchschnitt) und 20,5% (0,067 OD-Durchschnitt), abhängig vom Antigen und der Probe. Methodenvergleichsstudien Die Durchführung des PakPlus zum Nachweis von Antikörpern reaktiv gegen GPIIb/IIIa, GPIb/IX, GPIV,oder GPIa/IIa wurde mit der Durchführung im MAIPA und dem Lifecodes QuikScreen zum Nachweis von Antikörpern gegen HAL Klasse I Antigenen verglichen. 3 Klinische Studien wurden durchgeführt. 2 davon wurdenals externe Studie am Blood Center of Wisconsin (Milwaukee, Wisconsin) und Puget Sound Blood Center (Seattle, Washington) durchgeführt. Die MAIPA Testung wurde vom Australian Red Cross Kelvin Grove (Queensland, Australia) durchgeführt. Eine dritte interne Studie, wurde von Immucor GTI Diagnostics durchgeführt mit Proben von Sanquin Diagnostic Services (Amsterdam, The Netherlands) und von Immucor GTI Diagnostics. Für die Analyse wurden die Daten aller Studien kombiniert. Die 2x2 folgenden Tabellen zeigen die positive Übereinstimmung in % (Sensitivität) und die negative Übereinstimmung in % (Spezifität) und die Gesamtübereinstimmung aller getesteten Proben in %. Das 95% Confidence Interval um diese Werte ist in Klammern. Methodenvergleich: PakPlus vs. QuikScreen zum Nachweis von Antikörpern gegen HLA Klasse I Antigene. Lifecodes QuikScreen Positiv % Gesamtübereinstimmung: 92.3% ( %) PakPlus Negativ % positive Übereinstimmung: 84.9% ( %) Total % negative Übereinstimmung: 96.9% ( %) PakPlus 3 Proben wurden von der Studie ausgeschlossen wegen nicht auswertbarer oder invalider Ergebnisse im QuikScreen. Proben mit unstimmigen Ergebnissen im Vergleich PakPlus vs. QuikScreen wurden zudem beurteilt durch Austestung mit einem Luminx basierten Test (Lifematch LMX) zum Nachweis von Antikörpern gegen HLA Klasse I Antigene. Von den 12 im PakPlus positiven Proben und QuikScreen negatven Proben waren alle 12 im LMX negativ. Von den 36 im PakPlus negativen Proben und QuikScreen positiven Proben waren 14 auch im LMX negativ. Methodenvergleich: Nachweis von Antikörpern gegen GPIIb/IIIa, GPIa/IIa, GPIb/IX oder GPIV Die Analyse wurde in 2 Schritten durchgeführt. Die folgende Tabelle zeigt den Gesamtvergleich des PakPlus mit dem MAIPA für jeden im Test nachweisbaren HPA-Antikörper. Die nachfolgenden Tabellen vergleichen das PakPlus Ergebnis mit dem MAIPA für jedes spezifische Glykoprotein des PakPlus. Für beide Analysetypen wurden Proben mit nicht auswertbaren MAIPA- Ergebnissen (Allospezifität konnte nicht bestätigt werden oder breite Reaktivität auf viele Ziele), ausgeschlossen. Die Anwendung vom PakPlus bei Proben dieser Art wurde nicht evaluiert. Analyse auf der Basis von Antikörpern gegen beliebige HPA-Antigene MAIPA Positiv % Gesamtübereinstimmung: 91.2% ( %) Negativ % positive Übereinstimmung: 96.7% ( %) Total % negative Übereinstimmung: 89.3% ( %) PakPlus Test IFUDE REV G

9 PakPlus PakPlus PakPlus 17 Proben wurden wegen nicht auswertbarer MAIPA-Ergebnisse aus der Analyse genommen. 9 Proben wurden wegen nicht Auswertbarkeit (Pan-Reaktiv) im PakPlus ausgechlossen. Diese Proben wurden auch aus allen weiteren Analysen des PakPlus vs. MAIPA ausgenommen. Die GP IV Austestung wurde nur in einer Studie durchgeführt wie Sie der Analyse auf der Basis von Antikörpern gegen GP IV unten entnehmen können. Analyse auf der Basis von Antikörpern gegen GP IIb/IIIa MAIPA Positiv % Gesamtübereinstimmung: 94.3% ( %) Negativ % positive Übereinstimmung: 100% ( %) Total % negative Übereinstimmung: 93.3% ( %) Analyse auf der Basis von Antikörpern gegen GP Ia/IIa MAIPA Positiv % Gesamtübereinstimmung: 96.6% ( %) Negativ % positive Übereinstimmung: 91.1% ( %) Total % negative Übereinstimmung: 97.2% ( %) 24 Proben wurden im PakPlus als nicht auswertbar bestimmt wegen positive Ergebnisse in beiden GP Ia/IIa Präperationen (Reihe C und D) und einer Ratio der OD-Mittelwerte < 3,0 (Siehe auch unter Interpretation ). Diese Proben wurden vom Vergleich ausgenommen. Alle Proben waren im MAIPA negativ. Analyse auf der Basis von Antikörpern gegen GP Ib/IX MAIPA Positiv % Gesamtübereinstimmung: 95.5% ( %) Negativ % positive Übereinstimmung: 66.7% ( %) Total % negative Übereinstimmung: 95.9% ( %) PakPlus Analyse auf der Basis von Antikörpern gegen GP IV Der Nachweis von reaktiven GP IV Antikörpern im PakPlus wurde mit dem MAIPA in einer Single Studie des Blood Center of Wisconsin (Milwaukee, Wisconsin), verglichen. MAIPA Positiv % Gesamtübereinstimmung: 98.7% ( %) Negativ % positive Übereinstimmung: 75.0% ( %) Total % negative Übereinstimmung: 99.3% ( %) Störende Substanzen Sudien zu störenden Substanzen wurden mit CLSI EP07-A2 Interference testing in clinical Chemistry; Approved Guideline. durchgeführt. Die folgenden Substanzen zeigten keinerlei Einfluss auf den PakPlus Test in den angezeigten Konzentrationen: Haemoglobin Triglycerides Bilirubin 500 mg/dl 500 mg/dl 20 mg/dl IVIG Gereinigtes humanes IgG als Surrogat für IVIG wurde auf seine Wechselwirkung im PakPlus getested. Bei einer Serumkonzentration von > 200 mg/dl wurden signifikante Auswirkungen im Test beobachtet. Nicht auswertbare (panreaktiv) oder falsch positive Ergebnisse wurden nachgewiesen. Austestungen mit Serumkonzentration < 200 mg/dl wurden nicht durchgeführt. Basisspiegel bei Patienten unter IVIG-Therapie sind gezielt höher als die niedrigste getestete Konzentration. 22 Ergebnisse von Personen unter IVIG Therapy sollten sorgfältig evaluiert werden unter Berücksichtigung dieser Ergebnisse. PakPlus Test IFUDE REV G

10 REFERENZLITERATUR 1. Rozman P. Platelet antigens. The role of human platelet alloantigens (HPA) in blood transfusion and transplantation. Transpl.Immunol. 2002;10: Metcalfe P et al. Nomenclature of human platelet antigens. Vox Sang. 2003; 85: Santoso S. Human platelet alloantigens. Transfus.Apher.Sci. 2003;28: Saw CL, Szykoluk H, Curtis BR et al. Two cases of platelet transfusion refractoriness associated with anti-cd36. Transfusion 2010;50: Klein J, Sato A. The HLA system. N Eng J Med. 2000; 343: Mueller-Eckhardt C. Mueller-Eckhardt C, Kiefel V, Grubert A et al. 348 cases of suspected neonatal alloimmune thrombocytopenia. Lancet 1989;1: Mueller-Eckhardt C. Platelet allo-and autoantigens and their clinical implications. In: Nance SJ eds. Transfusion Medicine in the 1990s, Arlington, Va., American Association of Blood Banks 1990; Brand A. Immunological aspects of blood transfusions. Transpl.Immunol. 2002;10: McFarland JG. Detection and identification of platelet antibodies in clinical disorders. Transfus.Apher.Sci. 2003;28: Davoren A, Curtis BR, Aster RH, McFarland JG. Human platelet antigen-specific alloantibodies implicated in 1162 cases of neonatal alloimmune thrombocytopenia. Transfusion 2004;44: Rebulla P. A mini-review on platelet refractoriness. Haematologica 2005;90: Kanhai HH, Porcelijn L, Engelfriet CP et al. Management of alloimmune thrombocytopenia. Vox Sang. 2007;93: Stroncek DF, Rebulla P. Platelet transfusions. Lancet 2007;370: Arnold DM, Smith JW, Kelton JG. Diagnosis and management of neonatal alloimmune thrombocytopenia. Transfus.Med.Rev. 2008;22: Bussel JB, Primiani A. Fetal and neonatal alloimmune thrombocytopenia: progress and ongoing debates. Blood Rev. 2008;22: Curtis BR, McFarland JG. Detection and identification of platelet antibodies and antigens in the clinical laboratory. Immunohematology. 2009;25: Vassallo RR. Recognition and management of antibodies to human platelet antigens in platelet transfusion-refractory patients. Immunohematology. 2009;25: Kaplan C, Ni H, Freedman J. Alloimmune Thrombocytopenia. In: Michelson A eds. Platelets 3rd Edition. Academic Press Elsevier. 2012; 46: Wu GG, Kaplan C, Curtis BR, Pearson HA. Report on the 14th International Society of Blood Transfusion Platelet Immunology Workshop. Vox Sang. 2010;99: Smith GA, Ranasinghe E, Ouwehand WH. The importance of using multiple techniques for detection of platelet antibodies. Vox Sang. 2007;93: Metcalfe P. Ensuring quality in platelet immunology. Vox Sang. 2007;93: Goddard EA. Intravenous Immunoglobulin. Current Allergy & Clinical Immunology, March 2008 Vol 21, No : Immucor GTI Diagnostics, Inc Crossroads Circle Waukesha, WI USA EC REP Immucor Medizinische Diagnostik GmbH Adam-Opel-Strasse 26A Rodermark Germany US and International Contact Information: Technical Support : waukeshatechsupport@immucor.com Immucor GTI Diagnostics, Inc IFUDE Rev G Warning Danger H302 H318 H412 EUH032 P264 P270 P273 P280 P301 + P312 P305 + P351 + P338 P310 P330 Warnung Gefahr Gesundheitsschädlich bei Verschlucken Verursacht schwere Augenschäden Schädlich für Wasserorganismen, mit langfristiger Wirkung Entwickelt bei Berührung mit Säure sehr giftige Gase Nach Gebrauch Hände gründlich waschen Bei Gebrauch nicht essen, trinken oder rauchen Freisetzung in die Umwelt vermeiden Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschutz tragen BEI VERSCHLUCKEN: Bei Unwohlsein GIFTINFORMATIONSZENTRUM oder Arzt anrufen BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser spülen. Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter spülen. Sofort GIFTINFORMATIONSZENTRUM/Arzt anrufen Mund ausspülen PakPlus Test IFUDE REV G

11 ÜBERSETZUNG DER SYMBOLE SYMBOL ENGLISH (EN) CHINESE (ZH) DEUTSCH (DE) FRANҪAIS (FR) GREEK (EL) ITALIANO (IT) PORTUGUÊS (PT) ESPANOL (ES) JAPANESE (JA) RS Recording Sheet 记录单 Protokollbogen Tableaux de Tabela de Φύλλο Καταγραφής Foglio di lavoro résultats resultados Tabla de Resultados 記録用紙 ID # N o Identification 识别编 Identifikations- Αριθμός Numero di Número de identification Number 号 nummer Ταυτότητας identificazione identificação du patient Nº de identificación 検体 ID DATE Date Read 读取日 Fecha Datum Date Ημερομηνία Data Data da leitura 期 検査日 TECH Technologist 技师 Untersucher Technologue Τεχνολόγος Tecnico Técnico Analista 検査者 NC Negative Control 阴性对 Negative Contrôle Αρνητικός Ορός Controllo Control 陰性コント Controlonegativo 照 Kontrolle négatif (A) ελέγχου negativo negativo ロール PC Positive Control 阳性对 Positive Contrôle Θετικός Ορός Controllo Control 陽性コント Controlopositivo 照 Kontrolle positif ελέγχου positivo positivo ロール Pocillo del BLANK Blank Well 空白孔 Blank Puitsvierge ΤΥΦΛΟ Bianco Poço do Branco Blanco ブランク DIL MNCOD MPCOD Multiplier CUTOFF Dilute Before Use Mean Negative Control OD Mean Positive Control OD Cutoff Multiplier Control Cutoff OD 1 Optical Density 1 使用前稀释 平均阴性对照 O D 平均阳性对照 O D 乘数截止数值 对照截止数值 光密度 1 Vor Gebrauch verdünnen OD-Mittelwertder NC OD-Mittelwertder PC Cutoff Multiplier CUTOFF der Kontrolle Optische Dichte 1 OD 2 Optical Density 2 光密度 2 Optische Dicht 2 ROW A ROW B MEAN INTRP VALID RSLT DUP OK Row A Row B Mean Sample OD A 行 B 行 平均样品 OD Diluer avant utilisation Moyenne des DO du contrôle négatif Moyenne des DO du contrôle positif Multiplicateur du seuil de positivité Seuil de positivité du contrôle Densité optique 1 Densité optique 2 Αραιώστε πριντηνχρήση Μέση τιμή OD Αρνητικού μάρτυαρα Μέση τιμή OD Θετικού μάρτυαρα Πολλαπλασιαστής cutoff Μαρτυρας cutoff Diluire con acquadeionizzata prima dell uso Media del Controllo Negativo OD Media del Controllo Positivo OD Moltiplicatore Cutoff Οπτική πυκνότητα 1 Densità ottica 1 Οπτική πυκνότητα 2 Densità ottica 2 Diluir antes de utilizar DO Média do Controlo Negativo DO Média do Controlo Positivo Multiplicador de Cutoff Dilución promedio de la OD del CN promedio de la OD del CP Controllo Cutoff Controlo Cutoff Cutoff (corte) Densidade Óptica 1 Densidade Óptica 2 Densidad Optica 1 Densidad óptica 2 Reihe A Rangée A Γραμμή Α Riga A Linha A Fila A Reihe B Rangée B Γραμμή Β Riga B Linha B Fila B Mittelwert OD der Probe Moyenne des DO de l échantillon Μέση OD δείγματος Media Campione OD DO Média da Amostra Interpretation 说明 Interpretation Interprétation Ερμηνεία Interpretazione Interpretação Interpretacion Controls meet criteria for valid assay Result Duplicate Variation Acceptable 对照符合有效测定标准 结果 可接受的重复变化 Kontrollen valide für den Test Les contrôles rencontrent les critères de validité de l essai Ο έλεγχος πληρεί τα κριτήρια για έγκυρη μέθοδο I controlli corrispondono ai requisiti richiesti per la validazione del test Controlos satisfazem os critérios de validação do teste Media Resultados de los controles para un ensayo valido Ergebnis Résultat Αποτέλεσμα Risultato Resultado Resultados Doppelbestimmung sind ok Variation des analyses en double acceptable Modèle de la plaque Calculs de contrôle Résultats des échantillons Αποδεκτή διακύμανση εις διπλούν Variazione accettabile dei duplicati Variação Duplicada Aceitável Variación duplicada aceptable TEMPLATE 平皿模 Template/ Plate Template Plattenbelegung Μήτρα πλάκας Modello di piastra Template 板 Plantilla CALCS Control 对照计 Berechnungen Υπολογισμός Calculos Calcoli di controllo Cálculos de control calculations 算 der Kontrolle ελέγχου control SAMPLE 样品结 Ergebnis der Αποτελέσματα Risultati del Resultdos da Sample Results RESULTS 果 Probe δειγμάτων campione Amostra Resultados SAMPLE Sample 样品 Probe Échantillon Δείγμα Campione Amostra Muestra CONTROLS Controls 对照 Kontrollen Contrôles Μάρτυρες Controlli Controlos Controles RVW Reviewed by 审核 Gegengelesen durch Revu par Ανασκόπηση από Controllato da Revisto por Revisado por 使用前に希釈してください PakPlus Test IFUDE REV G