HAMA-ELISA medac. Deutsch A-VPD/010414

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1 HAMAELISA medac Deutsch 10018AVPD/010414

2 HERSTELLER medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D20354 Hamburg VERTRIEB medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Bereich Diagnostika Theaterstraße 6 D22880 Wedel Tel.: ++49/ 4103/ Fax: ++49/ 4103/ BESTELLADRESSE Tel.: ++49/ 4103/ Fax: ++49/ 4103/ AVPD/010414

3 HAMAELISA medac Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von HumanAntiMausAntikörpern (HAMA) KatalogNr.: 10018A ZUR IN VITRO DIAGNOSTIK EINFÜHRUNG Monoklonale MausAntikörper werden in vivo zur Immunsuppression nach Organtransplantation zwecks Unterdrückung von Rejektionskrisen, zur Unterdrückung akuter Schübe bei Autoimmunopathien und zur Immunszintigraphie bzw. invivo Immuntherapie bei Tumorpatienten eingesetzt. Die Applikation monoklonaler MausAntikörper kann bei den Patienten zu einer Induzierung von HumanAntiMausAntikörpern (HAMA) führen. Bei Mehrfachanwendung kommt es in der Regel zu signifikanten Anstiegen der HAMAKonzentration im Patientenserum. Die gebildeten HAMA sind meistens AntiIsotypen, seltener AntiIdiotypen. HAMA können die Effektivität der Immuntherapie bzw. der Immunszintigraphie dahingehend störend beeinflussen, dass durch die Bindung der eingesetzten Antikörper und die Bildung von Immunkomplexen (HAMAmAk) deren therapeutische Wirksamkeit und diagnostische Aussagekraft vermindert werden. Bei HAMApositiven Patienten besteht die erhöhte Gefahr anaphylaktischer Reaktionen bei erneuter Applikation von monoklonalen MausAntikörpern. In der InvitroDiagnostik verwendete Immunoassays basieren häufig auf dem Einsatz von monoklonalen MausAntikörpern. Aus diesem Grund muss bei unplausiblen falschpositiven und falschnegativen Ergebnissen immer an das Auftreten von HAMA in Patientenseren als mögliche Ursache gedacht werden. Trotz Zugabe von MausAntikörpern zu den Verdünnungsmedien werden diese störenden Reaktionen in den gegenwärtig verfügbaren Immunoassays häufig nicht vollständig unterdrückt. Der HAMAELISA medac ist ein einfach zu handhabender und schnell durchzuführender OneStepEnzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von HAMA im Serum. Der Test ist gegen AntiMausIgGAntikörper kalibriert. Der Messbereich des HAMAELISA medac erstreckt sich von ng/ml AVPD/

4 TESTPRINZIP Mit Maus IgG (Antigen) beschichtete Mikrotiterplatte.Mikrotiterstreifen Zugabe von Proben und Peroxidasegekoppeltem MausIgG (Konjugat)(P = Peroxidase). HumanAntiMausAntikörper (HAMA) binden an Festphasen und Peroxidasegekoppeltem MausIgG (Brükkenbildung). Inkubation mit TMBSubstrat (*). Stoppen der Reaktion mit Schwefelsäure. Die Auswertung erfolgt photometrisch. Testvorteile Einschrittassay mit kurzer Inkubationszeit. Die brechbaren Mikrotiterstreifen gewährleisten eine optimale Testauslastung. Gefärbte Reagenzien zur Kontrolle der Pipettierschritte. Automatisierbar auf offenen ELISAGerätesystemen AVPD/

5 PACKUNGSINHALT: KAT.NR A 1. MTP Mikrotiterplatte: 12 Teststreifen à 8 Vertiefungen (bedruckt mit HAM, mit Halterahmen und Trockenmittelpappe im Aluminiumbeutel vakuumverschweißt), brechbar, Rundboden, beschichtet mit MausIgG und BSA, gebrauchsfertig. 2. CONTROL 1 + Positive Kontrolle 1: 1 Fläschchen à 0,75 ml, ZiegeantiMausIgG Antikörper, gebrauchsfertig, blau gefärbt, enthält BSA, FKS, Phenol, ProClin TM 300 und Gentamycinsulfat. 3. CONTROL 2 + Positive Kontrolle 2: 1 Fläschchen à 0,75 ml, ZiegeantiMausIgG Antikörper, gebrauchsfertig, blau gefärbt, enthält BSA, FKS, Phenol, ProClin TM 300 und Gentamycinsulfat. 4. CAL Standards: je 1 Fläschchen à 0,75 ml, ZiegeantiMausIgGAntikörper, gebrauchsfertig, blau gefärbt, enthält BSA, FKS, Phenol, ProClin TM 300 und Gentamycinsulfat. 4a. CAL 1 Standard 1: 2000 ng/ml 4b. CAL 2 Standard 2: 1000 ng/ml 4c. CAL 3 Standard 3: 500 ng/ml 4d. CAL 4 Standard 4: 200 ng/ml 4e. CAL 5 Standard 5: 40 ng/ml 5. WB Waschpuffer: 1 Flasche à 100 ml, PBS/Tween (10x), ph 7,2 7,4, enthält ProClin TM VIRDIL Probenverdünnungspuffer: 1 Flasche à 110 ml, PBS/Tween/BSA, ph 7,2 7,4, gebrauchsfertig, blau gefärbt, enthält ProClin TM AVPD/

6 7. CON Konjugat: 2 Fläschchen à 5,0 ml, MausIgG, HRPkonjugiert, gebrauchsfertig, orange gefärbt, enthält BSA, Phenol, ProClin TM 300 und Gentamycinsulfat. 8. TMB TMBSubstrat: 2 Fläschchen à 10 ml, gebrauchsfertig. 9. STOP Stopplösung: 1 Fläschchen à 11 ml, 0,5 M Schwefelsäure (H 2 SO 4 ), gebrauchsfertig. 1. LAGERUNG UND HALTBARKEIT Material/Reagenz Zustand Lagerung Haltbarkeit Testkit ungeöffnet C bis Verfalldatum Mikrotiterplatte geöffnet C 4 Wochen im Beutel mit Trockenmittelpappe Kontrollen geöffnet C 4 Wochen Standards geöffnet C 4 Wochen Waschpuffer verdünnt C 4 Wochen Probenverdünnungspuffer geöffnet C 4 Wochen Konjugat geöffnet C 4 Wochen TMBSubstrat geöffnet C 4 Wochen Stopplösung geöffnet C bis Verfalldatum Die Reagenzien sind nach Ablauf des angegebenen Verfalldatums nicht mehr zu verwenden. 2. ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE REAGENZIEN UND MATERIALIEN 2.1. Destilliertes oder deionisiertes Wasser Mikroliterpipetten für entsprechende Volumina Saubere Glas oder Kunststoffgefäße zum Verdünnen von Waschpuffer und Proben Geeignete Vorrichtung zum Waschen der Mikrotiterplatte (z.b. Multistepper oder ELISAWaschgerät) Inkubator für 37 C MikrotiterplattenPhotometer mit Filtern für 450 nm und nm AVPD/

7 3. ANSETZEN DER REAGENZIEN Alle Kitkomponenten müssen vor Testansatz auf Raumtemperatur gebracht werden. Ermitteln Sie die Anzahl der benötigten Mikrotitervertiefungen Mikrotiterplatte Der Aluminiumbeutel muss nach jeder Entnahme von Mikrotitervertiefungen zusammen mit der Trockenmittelpappe wieder fest verschlossen werden. Lagerung und Haltbarkeit der nicht verwendeten Mikrotitervertiefungen s. unter Punkt Waschpuffer 1 Teil Waschpuffer (10x) wird mit 9 Teilen destilliertem/ deionisiertem Wasser angesetzt (z.b. 50 ml Waschpuffer (10x) mit 450 ml Wasser). Für 8 Vertiefungen werden 5 ml Waschpuffer benötigt. Evtl. im Waschpuffer (10x) vorhandene Kristalle sind vor dem Ansetzen durch Erwärmen (max. 37 C) und/oder Rühren bei RT in Lösung zu bringen. Die Reagenzien einer Charge sind nicht mit Reagenzien anderer Chargen oder anderer Hersteller zu mischen. Nur bei exakter Einhaltung der Arbeitsvorschrift und bei Verwendung der Testkitspezifischen Reagenzien werden valide und reproduzierbare Ergebnisse erhalten. 4. UNTERSUCHUNGSMATERIAL 4.1. Der Test ist geeignet zur Untersuchung von Serum. Die Patientenproben können für 7 Tage bei 2 8 C aufbewahrt werden. Eine längere Lagerung sollte bei 20 C erfolgen. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren der Proben ist zu vermeiden Eine Vorbehandlung der Seren, wie z.b. Inaktivierung, ist nicht erforderlich, sie sollten jedoch nicht mikrobiell kontaminiert und frei von Humanerythrocyten sein Die Seren werden 1:10 mit Probenverdünnungspuffer verdünnt (z.b. 20 μl Serum μl Probenverdünnungspuffer). Proben außerhalb des Messbereiches können beliebig weiterverdünnt werden (s. 6.A.). 5.A. ARBEITSVORSCHRIFT 5.1. Die Verpackung der Mikrotiterplatte am ZIPVerschluß öffnen und die erforderliche Anzahl Mikrotitervertiefungen entnehmen (s. 3.1) AVPD/

8 Die Mikrotitervertiefungen sind gebrauchsfertig und müssen nicht vorgewaschen werden In die Vertiefung A1 für die Ermittlung des Leerwertes 100 μl Probenverdünnungspuffer pipettieren. Jeweils 50 μl der Standards, Kontrollen und Proben in Doppelbestimmung in die Vertiefungen der Platte pipettieren. Danach jeweils 50 μl Konjugat in alle Vertiefungen außer A1 pipettieren. Das Pipettieren der Standards, Kontrollen, Proben und des Konjugats sollte innerhalb von 10 min erfolgen. Anschließend ist die Platte unverzüglich zu inkubieren (s. 5.3.). Bitte beachten: Beim Arbeiten mit automatisierten Gerätesystemen sind auf Grund der höheren Verdunstung in den Inkubationskammern jeweils 60 μl Standards, Kontrollen, Proben und Konjugat pro Vertiefung zu pipettieren. Die grundsätzliche Eignung des Tests für die automatisierte Abarbeitung konnte im Rahmen der Validierung gezeigt werden. Dennoch empfehlen wir, die Kompatibilität mit dem zum Einsatz kommenden Gerätesystem zu verifizieren Die Mikrotitervertiefungen 30 min ( 1 min) bei 37 C ( 1 C) inkubieren (feuchte Kammer oder mit Folie abgeklebt) Nach Inkubation die Mikrotitervertiefungen 3 x mit jeweils 200 μl Waschpuffer waschen. Darauf achten, daß alle Vertiefungen beim Waschen gefüllt werden. Nach Beendigung des Waschvorganges Mikrotitervertiefungen auf Filterpapier ausklopfen. Nicht austrocknen lassen! Umgehend weiterverwenden! μl TMBSubstrat in jede Vertiefung (auch A1) pipettieren und 15 min ( 1 min) bei 37 C ( 1 C) im Dunkeln inkubieren (feuchte Kammer oder mit Folie abgeklebt). Reaktive Proben erscheinen blau gefärbt Durch Zugabe von 50 μl Stopplösung in jede Vertiefung (auch A1) wird die Reaktion gestoppt. Es erfolgt ein Farbumschlag von blau nach gelb. Durch vorsichtiges Schütteln für gleichmäßige Durchmischung sorgen, Mikrotitervertiefungen vor photometrischer Messung von unten abwischen und darauf achten, dass keine Luftblasen in den Vertiefungen vorhanden sind. Die Messung ist innerhalb von 10 min nach dem Stoppen durchzuführen AVPD/

9 5.B. TABELLE ZUR ARBEITSVORSCHRIFT Leerwert Standards Kontrollen Probe (A1) Probenverdünnungspuffer 100 μl Standards Kontrollen Probe 50/60 μl*) 50/60 μl*) 50/60 μl*) Konjugat 50/60 μl*) 50/60 μl*) 50/60 μl*) 30 min bei 37 C inkubieren, 3 x mit 200 μl Waschpuffer waschen TMBSubstrat 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 15 min bei 37 C im Dunkeln inkubieren Stopplösung 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl Photometrische Auswertung bei 450 nm (Ref nm) *) manuelle/automatisierte Abarbeitung (s. 5.2.) 6.A. TESTBEURTEILUNG (VALIDITÄT) Die photometrische Auswertung erfolgt bei einer Wellenlänge von 450 nm (Referenzwellenlänge nm). Die OD des Leerwertes (Vertiefung A1) wird von allen ODWerten subtrahiert. Der Sollwertbereich der Kontrollen ist dem jeweiligen Flaschenetikett zu entnehmen. Validitätskriterien Der ODWert des Leerwertes muss < 0,050 betragen. Der ODMittelwert des Standards 5 muss < 0,200 betragen. Der ODMittelwert des Standards 1 muss > 1,500 betragen. Die Konzentrationen der Kontrollen müssen innerhalb des Sollwertbereiches (siehe Aufdruck auf dem Flaschenetikett) liegen. Sind die genannten Validitätskriterien nicht erfüllt, muss der Test wiederholt werden AVPD/

10 Standardkurve und Quantifizierung der Messergebnisse Die ODWerte der Standards werden gegen die Konzentration aufgetragen. Für die Standardkurve wird empfohlen, eine kubische SplineAnpassung durchzuführen. Für die ODWerte der Proben können die Konzentrationen aus der Standardkurve abgelesen werden. Der Messbereich erstreckt sich von 40 bis 2000 ng/ml. Proben mit Konzentrationen unterhalb des Messbereiches sind als < 40 ng/ml zu bewerten. Proben oberhalb des Messbereiches sind als > 2000 ng/ml zu bewerten. Diese dürfen nicht extrapoliert werden, sondern sollten in höherer Verdünnung wiederholt getestet werden. Wurde eine Probe in einer höheren Verdünnung als 1:10 gemessen, ist die aus der Standardkurve ermittelte Konzentration mit dem zusätzlichen Verdünnungsfaktor zu multiplizieren (zum Beispiel: Verdünnung im Test 1:40, abgelesene Konzentration 1500 ng/ml tatsächliche Konzentration = 1500 ng/ml x 4 = 6000 ng/ml). Beispiel einer Standardkurve: 2,5 2,0 OD (450/630 nm) 1,5 1,0 0,5 0, HAMAKonz. [ng/ml] 6.B. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE/GRENZEN DER METHODE Mit dem HAMAELISA medac werden ausschließlich AntiIsotyp Antikörper gemessen. HAMAKonzentrationen > 40 ng/ml sind als positiv zu bewerten. Diese können die therapeutische Wirksamkeit monoklonaler Maus Antikörper oder die diagnostische Aussagekraft entsprechender Methoden beeinträchtigen AVPD/

11 Zur individuellen Beurteilung empfiehlt es sich, den zeitlichen Verlauf der Antikörperkonzentration zu berücksichtigen. Falsch positive Reaktionen, die durch heterophile Antikörper hervorgerufen werden, können in Einzelfällen nicht ausgeschlossen werden. Rheumafaktorpositive Seren können erhöhte HAMAWerte aufweisen. Von 43 untersuchten Seren hatten 63 % HAMAKonzentrationen > 40 ng/ml, 5 % lagen > 320 ng/ml. HAMAWerte > 1000 ng/ml wurden im untersuchten Kollektiv nicht gemessen. Sehr stark erhöhte Lipidwerte sowie hohe Hämoglobin und Bilirubinkonzentrationen beeinflussen die Testergebnisse nicht. Die Verdünnungslinearität wurde im Rahmen der diagnostischen Evaluierung anhand ausgewählter Proben geprüft (vgl. Abschnitt 7.D.). Wir weisen jedoch darauf hin, dass es Patientenproben gibt, die sich nicht verdünnungslinear verhalten. 7. LEISTUNGSMERKMALE Die nachfolgenden Leistungsmerkmale wurden von uns im Rahmen der diagnostischen Evaluierung ermittelt. 7.A. PRÄVALENZ Im Rahmen der diagnostischen Erprobung wurden 101 Seren von Blutspendern gemessen. Davon erwiesen sich 98 Proben als negativ (HAMAKonzentration < 40 ng/ml). 7.B. PRÄZISION Probe IntraassayVarianz Probe InterassayVarianz MW OD S VK (%) n MW ng/ml S VK (%) n Std. 1 2,460 0,204 8,3 21 K ,6 11 Std. 5 0,070 0,008 11,4 21 K ,8 11 K1 1,013 0,053 5,2 21 Nr ,1 11 K2 2,205 0,121 5,5 21 Nr ,4 11 Nr. 1 0,128 0,011 8,6 22 Nr ,8 11 Nr. 3 2,341 0,129 5,5 22 Std. = Standard; K = Kontrolle; Nr. = Serum 10018AVPD/

12 7.C. WIEDERFINDUNG Durch Zugabe von jeweils 8 definierten HAMAKonzentrationen zu 3 verschiedenen Seren wurde eine mittlere Wiederfindung von 99 % (S = 12 %) ermittelt. 7.D. VERDÜNNUNGSLINEARITÄT Die Verdünnungslinearität wurde anhand von 10 hochreaktiven Seren, die in 5 verschiedenen Verdünnungen (jeweils 1:2 weiterverdünnt) getestet wurden, überprüft. Verd. 1 Verd. 2 Verd. 3 Verd. 4 Verd. 5 MW S VK ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml Nr % Nr % Nr % Nr % Nr % Nr % Nr % Nr % Nr % Nr % 7.E. UNTERE NACHWEISGRENZE (LIMIT OF QUANTITATION, LOQ) Die untere Nachweisgrenze beträgt 40 ng/ml. Diese Konzentration liegt signifikant oberhalb des NullBereiches. ALLGEMEINE HANDHABUNGSHINWEISE Reagenzienflaschen und deren Verschlüsse nicht vertauschen, um Kreuzkontamination zu vermeiden. Sofort nach Gebrauch die Reagenzflaschen wieder fest verschließen, um Verdunstung und mikrobielle Kontamination zu vermeiden. Nach Gebrauch sind die Reagenzien sofort wieder, entsprechend den vorgeschriebenen Lagerungsbedingungen, zu lagern, um die angegebene Haltbarkeit zu gewährleisten. Um Verwechslungen mit Reagenzien anderer Testsysteme oder Chargen zu vermeiden, sollten alle Kitkomponenten einer Testpackung nach dem Gebrauch zusammen in der Originalpackung gelagert werden (siehe auch 3.) AVPD/

13 SICHERHEITSHINWEISE Die national verbindlichen Arbeitsschutzvorschriften sind zu beachten. Die Reagenzien, die Bestandteile tierischer Herkunft enthalten (siehe Packungsinhalt), sollten als potentiell infektiös behandelt werden, um das Risiko einer Ansteckung zu vermeiden. ENTSORGUNGSHINWEISE Die in diesem Produkt enthaltenen Chemikalien und Zubereitungen sowie die bei der Anwendung dieses Produktes anfallenden Reste sind in der Regel Abfälle, die einer ordnungsgemäßen Entsorgung zugeführt werden müssen. Die Entsorgung solcher Abfälle unterliegt den nationalen abfallrechtlichen Gesetzen und Verordnungen. Die zuständige Behörde oder Abfallbeseitigungsunternehmen informieren über die Entsorgung von Sonderabfällen. Ausgabedatum: AVPD/

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15 Hertel, A., et al.: Antiidiotypic HAMA Triggered by OC 125 Radioimmunoscintigraphy: Beneficial to the Patient? in R. Klapdor (ed.): Tumor Associated Antigens, Oncogenes, Receptors, Cytokines in Tumor Diagnosis and Therapy at the Beginning of the Nineties. Cancer of the BreastState and Trends in Diagnosis and Therapy. Zuckerschwerdt Verlag München, Bern, Wien, New York, (1992) Hertel, A. and R. Baum: Influence of Human AntiMurine Antibodies on in vitro Assays in Ovarian Cancer Patients. HYBRIDOMA 12 (5), (1993) Klein, J.L., et al.: Detection of specific antiantibodies in patients treated with radiolabelled antibody. INT. J. RAD. ONCOL. BIOL. PHYS. 12, (1986) Kricka, L.J. and D. SchmerfeldPruss: Interlaboratory Survey of Methods for Measuring Human AntiMouse Antibodies. CLINICAL CHEMISTRY 38 (1), (1992) LaFontaine, G.S., H.J. Hansen, B.F. Weiss and D.M.Goldenberg: Enzyme Immunoassay for the Detection of Circulating Immunoglobulins in Humans to Mouse Monoclonal Antibody (HAMA). Presented at the Third International Conference of Monoclonal Antibody Immunoconjugates for Cancer, February 46 (1988) McCarthy, R.C., F.J. Ryan: Interference in immunoenzymometric assays (IEMA) using mouse monoclonal antibodies (MCAB) caused by human IgM antibody to mouse IgG (Abstract). CLIN. CHEM. 33, 918 (1987) Pimm, M.V., et al.: The Characteristics of Blood Borne Radiolabels and the Effect of AntiMouse IgG Antibodies on Localization of Radiolabelled Monoclonal Antibody in Cancer Patients. J. NUCL. MED. 26, (1985) Porstmann, T. (Hrsg.): Human antimausantikörper immer häufiger Ursache fehlerhafter Immunoassayergebnisse. INVITRO DIAGNOSTICA NACHRICHTEN 2 + 3, 15 (1993) Porstmann, T. (Hrsg.): Interferenzen durch humane AntiMausAntikörper (HAMA). INVITRO DIAGNOSTICA NACHRICHTEN 10, 8 (1993) 10018AVPD/