EBV-Serologie von medac. EBNA-1-IgG VCA-IgM VCA-IgG. Diagnostik mit Qualitätsgarantie
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- Elizabeth Kneller
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1 EpsteinBarr Virus EBVSerologie von EBNAIgG VCAIgM VCAIgG Diagnostik mit Qualitätsgarantie Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh GE Diagnostika Theaterstrasse 6 Telefon 43/86 Fax 43/ D2288 Wedel
2 EBVSerologie von Bedeutung Das EpsteinBarrVirus (EBV) gehört zur Familie der Herpesviridae. Es besteht aus einem doppelsträngigen DNAGenom, einem Kapsid, der Matrix sowie der Virushülle. Typisch für EBV ist, dass sie nach einer Primärinfektion lebenslang latent im Organismus verbleiben. Weltweit sind 9 95% aller erwachsenen Personen mit EBV infiziert. Bei Immunkompetenten verlaufen EBVPrimärinfektionen meist asymptomatisch im frühen Kindesalter. Bereits bei geringfügiger Immunsuppression kann es zu einer klinisch meist stummen Reaktivierung des Virus kommen. Für die EBVDiagnostik bei Immungesunden stehen Antikörperbestimmungen im Vordergrund. Die diagnostisch relevanten Antigenkomplexe sind das EBVspezifische Kernantigen (EBNA), das VirusKapsidAntigen (VCA) und für differenzialdiagnostische Fragestellungen ggf. das Early Antigen (EA). Das Auftreten von EBNAAntikörpern belegt in jedem Falle eine zurückliegende EBVInfektion. Ein es VCAIgM (und VCAIgG) bei em EBNABefund weist auf eine EBVPrimärinfektion hin. Fehlende Antikörper gegen EBNA und VCA charakterisieren eine Seroität gegen EBV. Krankheitsbilder Antikörperdiagnostik Folgende Erkrankungen stehen direkt oder indirekt mit EBV in Zusammenhang und stellen Indikationen für serologische Untersuchungen dar: Infektiöse Mononukleose EBVassoziierte BZellLymphome BurkittLymphom (endemisch in Zentralafrika und Neuguinea) NasopharynxKarzinom (höhere Inzidenz in Südostasien und China) HodgkinLymphome Primäres Ziel der EBVAntikörperdiagnostik bei immunkompetenten Patienten ist die Differenzierung von Primärinfektion Seroität zurückliegender Infektion 2
3 EBVSerologie von Eine EBVPrimärinfektion ist durch den nachfolgenden exemplarischen Antikörperverlauf charakterisiert. Antikörperverlauf S ymptome Infektion VCAIgG VCAIgA E B NAIgG VCAIgM E B NA2IgG E AIgG Beim Einsatz der Tests gemäß ihrer Zweckbestimmung liefert die nachfolgende stufendiagnostische Vorgehensweise aussagefähige serologische Ergebnisse. Stufendiagnostik EBNAIgG alte Infektion VCA VCAIgG+IgM VCAIgM sero Primärinfektion weiterführende Diagnostik z.b. Avidität, Blot, PCR Gutachten des Konsiliarlabors für EBV (Institut für Virologie der Universität des Saarlandes, Homburg/Saar, Fr. Prof. Dr. B. Gärtner) bestätigen die Eignung der Tests für die Routinediagnostik. 3
4 EBVSerologie von Testvorteile Für den Nachweis EBVspezifischer Antikörper werden routinemäßig Bindungstests wie IFT und ELISA eingesetzt. Anforderungen Die Tests erfüllen alle Anforderungen an eine zuverlässige Routinediagnostik. Interpretation der Ergebnisse 4 Der EBNAIgGELISA PKS detektiert Antikörper, die spezifisch gegen das Kernantigen gerichtet sind. Der VCAIgGELISA PKS und der VCAIgMELA Test PKS detektieren Antikörper, die gegen das VCAspezifische gp25 gerichtet sind. Bei dem EBNAIgGELISA PKS und dem VCAIgGELISA PKS wurde das Prinzip der Einpunktquantifizierung umgesetzt. Der VCAIgMELA Test PKS basiert auf dem µcapture Prinzip und gewährleistet einen hochspezifischen und sensitiven IgMNachweis. Die Tests sind gemäß den europäischen Richtlinien für IVD CEzertifiziert. Einfaches Handling einheitliche Abarbeitung und Inkubationsbedingungen Gebrauchsfertige Reagenzien Brechbare Mikrotiterstreifen (Einzelkavitäten) Einsetzbar auf offenen MikrotiterplattenAutomatensystemen Pipettierkontrollsystem (Indikatorsystem zur Vermeidung von Pipettierfehlern) In der Regel ermöglicht die Bestimmung der EBVAntikörper bei Immunkompetenten eine eindeutige Interpretation des Serostatus. Die mit den Tests gewonnenen Ergebnisse sind gemäß der nachfolgenden Tabelle zu interpretieren. EBNAIgG VCAIgG VCAIgM Interpretation sero + +/±/ zurückliegende Infektion +/±/ + Primärinfektion Alle anderen Befundkonstellationen sind als unklar zu bewerten. Bei etwa 5% der Patienten mit zurückliegender EBVInfektion sind keine EBNAAntikörper nachweisbar. Bei singulär em VCAIgG und bei kompletter VCAIgG, IgM und EBNAIgGPositivität ist eine erweiterte Differenzialdiagnostik (Bestimmung heterophiler Antikörper, Avidität, Nachweis von p8, PCR) erforderlich.
5 EBVSerologie von Im Rahmen einer diagnostischen Evaluierung mit klinisch definierten Proben wurden die nachfolgenden Ergebnisse erzielt: Evaluierung EBVe Gruppe (n = 5) EBNAIgG VCAIgG VCAIgM Akute EBVInfektion (n = 5) EBNAIgG VCAIgG VCAIgM Zurückliegende EBVInfektion (n = 5) EBNAIgG VCAIgG VCAIgM 48 5 Abweichungen zur Vorbefundung Serum Nr. Vorbefund EBNA akut akut ZI ZI +* / +** / NB ±/+ /+ * ** ZI Bestätigungstest zurückliegende Infektion VCAIgG VCAIgM Ergebnis * / +** +/ * / ** // /± / ZI*/ZI** ZI / ZI?/??/??/??/? NB? nicht bestimmt unklar (4th European Conference on Viral Diseases, , Budapest) Die Übereinstimmung der ELISAErgebnisse mit dem Referenztest (IFT) beträgt 96%. Zwei der diskrepanten Ergebnisse wurden durch weitere kommerzielle ELISA bestätigt. Die Evaluierung belegt eine sehr gute Eignung der Assays für die Routinediagnostik. 5
6 EBVSerologie von Sensitivität und Spezifität Sensitivität und Spezifität der Tests wurden im Vergleich zur Vorbefundung aus der diagnostischen Routine ermittelt und sind in den folgenden NeunFelderTafeln dargestellt: EBNAIgG IFTVorbefundung (n=65) Sensitivität: Spezifität: VCAIgM 4 % 99,% Übereinstimmung: 5 99,4% IFTVorbefundung (n=352) Sensitivität: Spezifität: VCAIgG ,4% 99,2% Übereinstimmung: 96,% IFTVorbefundung (n=352) Sensitivität: Spezifität: ,3% 97,9% Übereinstimmung: ,2% Die Tests ermöglichen eine hochspezifische und sensitive EBVAntikörperBestimmung und gewährleisten in Kombination eine zuverlässige Interpretation des EBVSerostatus. 6
7 KurzArbeitsanleitung für: EBV EBNAIgGELISA PKS Kat.Nr. 26PKS EBV VCAIgMELA Test PKS Kat.Nr. 27PKS EBV VCAIgGELISA PKS Kat.Nr. 28PKS Ansatz Serumverdünnung IgG / IgM Waschpuffer : ml 9 ml Aqua ad iniectabilia Waschpuffer (x) Probenverdünnungspuffer :2=IgG :=IgM AntigenKonjugatMischung VCAIgM 5 µl 2 ml 2.).) Antigenverdünnungspuffer IgG: Kontrollen, Kalibrator, verdünnte Proben IgM: Kontrollen, verdünnte Proben je 5 µl 2, ml Antigen Konjugat Inkubation bei 37 C, feuchte Kammer Platte 3 x waschen Testablauf je 2 µl 6 min entleeren und ausklopfen IgM: AntigenKonjugatMischung je 5 µl* IgG: Konjugat Inkubation bei 37 C, feuchte Kammer je 5 µl* Platte 3 x waschen je 2 µl 6 min entleeren und ausklopfen * Bei automatischer Abarbeitung 6 µl TMBSubstrat je 5 µl Inkubation bei 37 C, im Dunkeln, feuchte Kammer Stopplösung (,5 M H2SO4) je µl 3 min Photometrieren O.D. 45 nm Referenz nm 7
8 EBVSerologie von Auswertung Die photometrische Auswertung erfolgt bei 45 nm als Messwellenlänge (6265 nm als Referenzwellenlänge). Die OD des Leerwertes (Vertiefung A) wird von allen ODWerten subtrahiert. EBNAIgG VCAIgG Der ODMittelwert der Negativen Kontrolle muß <,5 betragen. Der ODMittelwert des Kalibrators muß oberhalb des Grenzwertes und der UnitWert der Positiven Kontrolle muß innerhalb des Sollwertbereiches gemäß chargenspezifischem Datenblatt liegen. Korrektur der Meßergebnisse: ODkorrigiert = ODSollwert des Kalibrators x OD gemessen ODMeßwert des Kalibrators Quantifizierung der Meßergebnisse: Konzentration AU/ml = b / ( a ODkorrigiert ) Cutoff = AU/ml Grenzbereich = Cutoff VCAIgM % (9 AU/ml) Der ODMittelwert der Negativen Kontrolle muß <, betragen. Der ODMittelwert der Positiven Kontrolle muß >,8 betragen. Cutoff = ODMittelwert der Negativen Kontrolle +,4 Grenzbereich = Cutoff % Interpretation Proben mit Werten unterhalb des Grenzbereiches werden als NEGATIV bewertet. Proben mit Werten innerhalb des Grenzbereiches werden als GRENZWERTIG bewertet. Werte im Grenzbereich sollten kontrolliert werden, indem nach 4 Tagen eine zusätzliche Patientenprobe entnommen wird, die zusammen mit der ersten Probe auf eine Titerbewegung untersucht wird. Proben mit Werten oberhalb des Grenzbereiches werden als POSITIV bewertet. 8 Stand /2 EBV
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