Mikrobiologie-Praktikum. Inhalt

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1 Mikrobiologie-Praktikum Versuch Nr. 1 Isolierung und Identifizierung unbekannter Mikroorganismen Inhalt 1. Aufgabenstellung S.2 2. Durchführung 2.1 Nährbodenherstellung S Beimpfung S Schnelltests zur Identifizierung der Mikroorganismen S.3 3. Auswertung S.5 4. Diskussion S.5

2 1. Aufgabenstellung In diesem Versuch soll die Gesamtmenge an Mikroorganismen, welche auf einem HNB-Agar und einem Mac Conkey-Agar wachsen können, von vier verschiedenen Proben, bestimmt werden. Außerdem sollen Einzelkolonien, sowie Fehlermöglichkeiten beschrieben werden. 2. Durchführung 2.1 Nährbodenherstellung Bestandteile HNB-Agar (Komplexmedium zur Anzucht von Bakterien) Zusamensetzung pro 1 Liter Leitungswasser - 3g Fleischextrakt - 5g Pepton aus Fleisch - 5g Hefeextrakt - 15g Agar (ph: 7,2) Bestandteile MacConkey-Agar (Selektivagar zur Isolierung von Enterobacteriacen) Zusammensetzung pro 1 Liter destilliertes Wasser - 17g Pepton aus Casein - 3g Pepton aus Fleisch - 10g Lactose - 1,5g Gallesalzmischung - 0,03g Neutralrot -0,001g Kristallviolett - 13,5g Agar Bestandteile Saline Zusammensetzung pro 1 Liter destilliertes Wasser - 0,12g MgSO 4. 7H 2 O Alle Bestandteile bis auf das Agarpulver werden in einen Erlenmeyerkolben eingewogen und in der Hälfte der erforderlichen Wassermenge gelöst. Durch gründliches Schütteln und mit Hilfe eines Magnetrührers wird die Lösung homogenisiert. Das Agarpulver wird in 500-mL- Meplatflaschen vorgelegt und die Lösung sowie das restliche Wasser unter Rühren hinzugefügt. Der ph-wert des MacConkey-Agars wird mit Hilfe eines ph-meters überprüft und wenn nötig mit HCl oder NaOH eingestellt. Anschließend wird der Agar bei 121 C 20 Minuten autoklaviert. Um steriles Arbeiten zu ermöglichen, wird der Agar unter der Clean-Bench in Petrischalen zu Nährböden gegossen. Beim Gießen ist darauf zu achten, dass eine luftblasenfreie ca. 5mm starke Schicht entsteht. Die Arbeitstemperatur sollte 50 C betragen, da sich der Agar ab 40 C verfestigt. Die abgekühlten Nährböden werden bis zur Beimpfung kopfüber im Kühlschrank gelagert. 2

3 2.2 Beimpfung Von folgenden Proben wurden Verdünnungsreihen hergestellt: - Teichwasser - Reutlinger Echaz-Wasser - Vitell Mineralwasser - Naturjoghurt Die Joghurtprobe wurde mit Saline-Lösung 1:10 und 1:100 verdünnt, die Wasserproben wurden zusätzlich 1:1000 verdünnt. Mit einem Trigalski-Spatel werden jeweils 0,1,mL der Probe möglichst gleichmäßig und dünn auf einem Nährboden verteilt. Um steriles Arbeiten zu gewährleisten, wird der Trigalski Spatel nach jeder Beimpfung mit Methanol gespült und in der Bunsenbrennerflamme abgeflammt. Sämtliche Nährböden werden kopfüber bei 37 C im Trockenschrank bebrütet. Die erste Auszählung der Kolonien erfolgte einen Tag später. Ebenfalls am ersten Tag nach der Beimpfung wurde von der Joghurt-Probe ein Mikroorganismus mittels Verdünnungsaustrich isoliert. Es gibt verschiedene Techniken um einen Verdünnungsaustrich auszuführen. Hier wurde wie folgt verfahren: Mit einer sterilen Impföse wird der Mikroorganismus aus einer speziellen kolonie auf einen neuen Nährboden übergeimpft. Zunächst wurde ein Strich gezogen und die Impföse danach ausgeglüht. Um die Impföse abzukühlen wurde sie kurz am Rande der Petrischale leicht in den Agar eingetaucht. Nun wurden im rechten Winkel zum ersten Austrich weitere Striche gezogen, welche den ersten Strich durchkreuzen. Auch hier wird zwischen den einzelnen Ausstrichen die Impföse ausgeglüht. Abschließend werden noch parallel zum ersten Austrich Striche gezogen. Man erhält eine gitterartige Struktur. Somit verdünnt man die Mikroorganismen auf einer Agarplatte, in der Absicht, Einzelkolonien zu erhalten. 2.3 Schnelltests zur Identifizierung der Mikroorganismen KOH Test Eine kleine Menge der zu testenden Keime wird mit etwas KOH auf einem Objektträger vermischt. Zieht das Gemisch beim Anheben der Impföse Fäden, so handelt es sich um gramnegative Bakterien. Ist kein Fadenziehen zu beobachten, so handelt es sich um grampositive Bakterien. Bei diesem Test wird die schnelle Zerstörung der Zellwand gramnegativer Bakterien durch KOH ausgenutzt. Durch die Lyse der Zellwand wird die DNA frei, welche als viskoser Faden in Erscheinung tritt. Der KOH-Test fiel positiv aus. gramnegative Bakterien 3

4 Gramfärbung Man unterscheidet grampositive und gramnegative Bakterien. Sie unterscheiden sich in ihrem Zellwandaufbau. Grampositive Bakterien besitzen ein mehrschichtiges Peptidoglykanskelett, gramnegative ein einschichtiges. Die Färbung sollte nur mit jungen Kulturen erfolgen, da im Alter viele Bakterien kein eindeutiges Ergebnis mehr liefern ( gramvariabel ). Bakterien der Joghurtkultur wurden einer Gramfärbung unterzogen. Der Ausstrich darf während der gesamten Färbung nicht austrocknen. Durchführung der Gramfärbung Ein Ausstrichpräparates wird durch Trocknung an der Luft und Hitzefixierung mit Hilfe der Bunsenbrennerflamme hergestellt. Der fixierte Ausstrich wird ganz mit Karbolgentianaviolett (oder Kristallviolett bedeckt und angefärbt. Die Einwirkungszeit des Farbstoffes beträgt 3 Minuten. Die Färbelösung wird nun abgegossen und der restliche Farbstoff durch Auftropfen von Lugolscher Lösung ausgewaschen. Der Ausstrich wird 1 Minute komplett mit Lugolscher Lösung bedeckt. Danach wird die Lösung abgegossen und der ausstrich zwei Sekunden unter warmen Leitungswasser gespült. Über den angeschrägten Objektträger lässt man vor weißem Hintergrund tropfenweise 96% Ethanol-Lösung laufen, bis der abtropfende Alkohol farblos ist. Dies sollte nicht länger als 10 Sekunden dauern. Anschließend wird sofort 5 Sekunden unter Leitungswasser gespült. Der Ausstrich wird mit Safraninlösung bedeckt, welche eine Minute einwirkt. Das Präparat wird mit Leitungswasser abgespült, kurz getrocknet und unter dem Mikroskop betrachtet. Blauviolette Färbung gramnegativ Rote Färbung grampositiv Auch die Gramfärbung lieferte das Ergebnis gramnegativer Bakterien. Enterotube Das Enterotube ist ein Schnelltest-System, mit dem man 15 bakterielle Eigenschaften gleichzeitig testen kann. In einem Röhrchen sind 15 verschiedene Nährböden hintereinander, welche mit der im Lieferumfang enthaltenen sterilen Impfnadel gleichzeitig beimpft werden. Die einzelnen Kammern werden zusätzlich von außen angestochen um aerobes Wachstum zu fördern. Die Röhrchen werden 24 Stunden bei 37 C bebrütet und danach ausgewertet. Man erhält einen fünfstelligen Code (ID-Value), welcher es erlaubt, den Keim durch Nachschlagen im CCIS zu bestimmen. Ergebnis wird nachgereicht. 4

5 3. Auswertung Anzahl der Kolonien Probe Verdünnung am am am am Teichwasser keine : : Echazwasser keine Vittel keine Joghurt keine? 9 + Verwuchs Abb. 1 Wachstum der Mikroorganismen auf MacConkey Agar Anzahl der Kolonien Probe Verdünnung am am am am Teichwasser keine Verwuchs 1: (gelb, glatt) 1: Echazwasser keine : Vittel keine (rot) 1: : Joghurt keine Abb. 2 Wachstum der Mikroorganismen auf HNB-Agar 4. Diskussion Das Teichwasser schnitt erwartungsgemäß schlecht ab, d.h. es war eine hohe Verkeimung nachweisbar. Das Echazwasser lieferte erstaunlich gute Ergebnisse. Ein Grund dafür könnte sein, dass man hier ein fließendes mit einem stehenden Gewässer vergleicht. Im Teich können sich Bakterien schneller anreichern. Das Vittel Trinkwasser schnitt ebenfalls recht gut ab. Dies zeigt sich auch im Vergleich zu einem später durchgeführten Versuch, der Wasserfiltration. Im Joghurt war eine höhere Anzahl an Mikroorganismen zu erwarten. 5