A) Spatel-Verfahren mit Kanamycin Äsculin Azid Agar: Methodenbuch VI M (1993)

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1 METHODEN ZUM NACHWEIS VON ENTEROKOKKEN Nachweis von Streptokokken der Gruppe D nach Lancefield (Fäkalstreptokokken) in Lebensmitteln, Trink- und Brauchwasser mit KANAMYCIN - ÄSCULIN - AZID - MEDIEN Das KANAMYCIN-ÄSCULIN-AZID-ANREICHERUNGSMEDIUM dient zur selektiven Anreicherung von Streptokokken der Gruppe D nach Lancefield aus kontaminiertem Untersuchungsmaterial (Lebensmittel, Wasser usw.). Das Wachstum von "Fäkalstreptokokken" äußerst sich im Medium durch eine schwarze Verfärbung des Nährbodens infolge Hydrolyse von Äsculin. Bei diesem Vorgang bilden sich aus dem Glukosid Äsculin, Glukose und Äsculetin; letztgenannte phenolartige Verbindung gibt mit Eisen(III)Ionen einen olivgrün-schwarz gefärbten Komplex. Kanamycin und Azid hemmen die Begleitflora weitgehend. A) Spatel-Verfahren mit Kanamycin Äsculin Azid Agar: Methodenbuch VI M (1993) Anwendung: Milch, Milchprodukte und Wasser Vorwiegend bei Proben mit geringer Begleitflora; sehr spezifisch bei Einhaltung aller Parameter; Von den Verdünnungen wird jeweils 0, auf die Oberfläche des Agarnährbodens pipettiert und mit einem sterilen Drigalski-Spatel gleichmäßig verteilt. Bebrütung: Stunden bei 37 C Das Ergebnis ist positiv für Streptokokken der Gruppe D nach Lancefield, wenn die dunkelgrünenschwarzen Kolonien von einem schwarzen Hof umgeben sind; Kolonien von heller Farbe werden nicht gezählt. Die Bestätigung der Enterokokken erfolgt mit Katalase (Enterokokken sind Katalase negativ). Die gewachsenen Kolonien sollten unmittelbar nach der Bebrütung ausgezählt werden, da der Nährboden völlig schwarz werden kann und andere MO wie, z.b. Sc, Mc und Lb könnten eine erhöhte KZ ergeben. B) Selektivagar nach SLANETZ und BARTLEY (DIN ) Selektivnährböden zur Keimzahlbestimmung von Enterokokken in Wasser, Schmutzwasser, Milch, Milchprodukten und anderem Untersuchungsmaterial. Durch den Gehalt an Natriumazid wird die gesamte gramnegative Begleitflora gehemmt. Der Nährboden ist als Fertignährboden erhältlich. Die Herstellung des Nährbodens muß genau nach Vorschrift der Erzeugerfirma erfolgen. Nach Abkühlen des Nährbodens werden Platten gegossen und diese vor der Beimpfung 2-4 Std. bei 30 bis 37 C oder 24 Stunden bei Zimmertemperatur vorgetrocknet. Jeweils 0, der Verdünnung wird auf die Nährbodenoberfläche geimpft und mit einer Drigalski- Spatel gleichmäßig verteilt. Bebrütung und Auswertung der Platten: Die Platten werden 48 Stunden bei 37 C bebrütet. Enterokokken erscheinen als rosa bis dunkelbraun gefärbte Kolonien mit einem Durchmesser von 0,5 bis 3 mm. Die Anzahl der Enterokokken wird unter Anwendung des jeweiligen Verdünnungsfaktors pro Gramm/Milliliter berechnet und angegeben. Auch hier erfolgt eine Bestätigung der Enterokokken mit Katalase Enterokokken sind Katalase negativ. AW: /Platte 10 Entero- und Staphylokokken by gnagl 48

2 METHODEN ZUM NACHWEIS VON KOAGULASE-POSITIVEN STAPHYLOKOKKEN Die Gattungen Micrococcus und Staphylococcus gehören zur Familie der Micrococcaceae. Ogston fand 1881 in humanem Abszeßeiter traubenähnliche Bakterienkluster und benannte sie aufgrund dieser Form Staphylokokken. Rosenbach konnte diese Bakterien 3 Jahre später kultivieren und gab ihnen, aufgrund der goldgelben Pigmentierung, den Beinamen aureus. Seit Rosenbach waren postoperative Wundinfektionen mit Staphylokokken gefürchtet und galten bis zur Einführung von Penicillin, in den späten 1940ern, als nicht therapierbar. Durch die Bildung von beta-lactamase, waren bereits 1950 mehr als 80 % der hospitalen Staphylococcus aureus-infektionen penicillinresistent. Die in den 1960ern eingeführten halbsynthetischen Penicilline lösten dieses Problem nur kurzfristig, da sich umgehend methycillinresistente Staphylococcus aureus-stämme (MRSA) bildeten. Die Mikrokokken und Staphylokokken sind weit verbreitet und stammen überwiegend von Euter, Haut und Nasenschleim. In Milch und Milchprodukte gelangen sie entweder über Kontamination durch ungenügend gereinigte und desinfizierte Gerätschaften und Luft oder unmittelbar durch Mensch und Tier. Staphylokokken sind grampositive, unbewegliche, kugelige Bakterien mit einem Durchmesser von 0,5 bis 1,5 µm. Sie kommen einzeln, paarweise und in Tetraden vor. Staphylokokken teilen sich charakteristischerweise in mehr als einer Ebene, sodass unregelmäßige Haufen entstehen. Mikrokokken können die Kurzzeiterhitzung im Gegensatz zu Staphylokokken überstehen. Typische Stoffwechselerscheinungen von Mikrokokken in neutralen Milchprodukten sind Bitterstoffe und Süßgerinnung/Flockenbildung. Verantwortlich für die relativ häufigen Lebensmittelvergiftungen sind enterotoxinbildende Staphylococcus aureus-stämme. Die Enterotoxine können 2 6 h nach der Aufnahme Erbrechen, Durchfall und Kreislaufstörungen hervorrufen. Die Pathogenität von Staphylococcus aureus ergibt sich aus der Summe der einwirkenden Enzyme und dem Zusammenwirken von der Anwesenheit der Mikroorganismen mit der Empfänglichkeit des Wirtes. Folgende Enzyme könne von Staphylococcus aureus gebildet werden: Koagulase Leukocidin Hyaluronidase Toxine Hämolysine Enterotoxine Haftung im Gewebe Schutz gegen Abwehrreaktion Durchdringung von Zellwänden lokale Gewebsnekrosen Auflösung von Erythrozyten Lebensmittelvergiftung (thermostabil) 10 Entero- und Staphylokokken by gnagl 49

3 A) NACHWEIS VON KOAGULASE-POSITIVEN STAPHYLOKOKKEN Selektivanreicherung mit Giolitti-Cantoni-Bouillon MPN-Technik IDF 60:2001(E) / ISO 5944:2001 ersetzt IDF 60C:1997 Anwendung: Milch und Milchprodukte, insbesondere für gestresste oder Proben mit geringer Keimzahl, getrocknete Milchprodukte 1. Anlegen einer Verdünnungsreihe mit Pepton-Kochsalzlösung oder auch Ringerlösung 2. Überimpfen in Giolitti-Cantoni-Bouillon mit Tween 80 (1g /Liter); ev. vorher 20min bei 100 C erhitzen um Sauerstoff aus Bouillon zu entfernen V 0 V 1 V 2 V 3 3. Zugabe von 0,1ml einer sterilen 1%igen K-Tellurit-Lösung für ek und 0,2ml für dk Bouillon 4. Überschichten mit 2 ml Wasseragar 5. Bebrütung für h bei 37±1 C 6. Isolierung mit einer Öse (0,001ml) auf Baird Parker Agar mittels fraktioniertem Ausstrich, nur Röhrchen mit schwarzem Niederschlag werden zur Isolierung herangezogen V 0 V 1 V 2 V 3 7. Bebrütung für h bei 37±1 C typische Kolonien: schwarz glänzend mit schmalen grau-weißem Rand, umgeben von einer klaren Zone im trüben Agar 8. Überimpfen mit einer Öse in Hirn-Herz-Bouillon (10ml) zuvor Katalasetest, dann überimpfen 9. Bebrütung für h bei 37 C 10. Bestätigung Agglutinationstest Koagulase-Test 10 Entero- und Staphylokokken by gnagl 50

4 B) Bestimmung von Staph. aureus in Milchpulver Direktansatz auf Platten, Spatelverfahren (FIL-IDF 138: 1986 / ISO 8869) Anwendung: alle Typen von Milchpulver 1. Jeweils der Ausgangssuspension auf 2 Petrischalen ( 140 mm) mit Baird-Parker- Agar ausspateln Probe V 0 2. Bebrütung für h bei 37 C 3. Auszählung aller Kolonien, die Staphylokokken sein könnten 4. Überimpfung von 5 Kolonien/Platte in Hirn-Herz Bouillon Katalasetest 5. Bebrütung für 24 h bei 37 C 6. Bestätigung Agglutinationstest Koagulase-Test 10 Entero- und Staphylokokken by gnagl 51

5 C) NACHWEIS VON KOAGULASE-POSITIVEN STAPHYLOKOKKEN Koloniezählung mit RPF-Medium, FIL-IDF145A:1997/ ISO 11867) Anwendung: Milch und Milchprodukte, 1. Anlegen einer Verdünnungsreihe mit Pepton-Kochsalzlösung oder auch Ringerlösung V 1 V 2 V 3 Probe V 0 2. Überimpfen in Petrischalen 1ml bei Koch und 0,1ml bei Spatel V 0 V 1 V 2 V 3 3. Vermischung mit Baird Parker RPF-Agar 4. Bebrütung für 24-(48) h bei 37 C 5. Auszählung aller Kolonien, die Staphylokokken sein könnten grau-schwarz, glänzende Kolonien Ø 1-1,5mm, umgeben von einem klarem bis opaken Hof 6. ev. Bestätigung auf Hirn-Herz und Koagulase Test 10 Entero- und Staphylokokken by gnagl 52

6 Bestätigungsreaktionen: Koagulasetest Koagulase ist ein Enzym mit der Fähigkeit, Plasma zu koagulieren. Staphylococcus aureus bildet freie und gebundene Koagulase, die im Röhrchentest nachgewiesen werden kann. Von jeder Kultur in Hirn-Herz-Bouillon gibt man 0, unter aseptischen Bedingungen zu 0,5 ml Kaninchen-Plasma (wenn der Hersteller keine andere Menge vorschreibt) in sterilen Koagulaseröhrchen und bebrütet diese bei C. Die Prüfung auf die Gerinnung des Plasmas erfolgt nach 4 6 Std. Der Koagulase-Test gilt als positiv, wenn die Kulturen mindestens 3+ positive Koagulase-Reaktionen liefern. negativ keine Anzeichen von Fibrinbildung 1+ positiv kleine, unzusammenhängende Gerinnsel 2+ positiv kleine, kompakte Gerinnsel 3+ positiv große, kompakte Gerinnsel 4+ positiv Gesamtinhalt des Röhrchens koaguliert und verrutscht auch nicht beim Umdrehen des Röhrchens. Zur Kontrolle gibt man 0, sterile Hirn-Herz-Bouillon zu der empfohlenen Menge Kaninchen-Plasma und bebrütet ohne Beimpfung. Das Kontroll-Plasma darf keine Anzeichen von Gerinnung zeigen, sonst ist der Test ungültig. Latex-Agglutination Staphylokokken können mit Agglutinationstests (z.b. BactidentStaph, Avipath-Staph, Staphytect) weiter differenziert werden. Der Latex-Agglutinationstest dient zur Differenzierung zwischen Staphylokokken, die gebundene Koagulase (Clumping-Faktor) und/oder Protein A bilden und solchen, die diese Eigenschaften nicht aufweisen. Protein A ist in der Lage, den Fc-Anteil des Immunglobulins G (IgG) zu binden. Der BactidentStaph besteht aus roten Latex-Partikeln, die mit Rinderfibrinogen und IgG beschichtet sind. Wenn Staphylokokken-Kolonien, die die Fähigkeit zur Bildung zellwandgebundener Koagulase und/oder Protein A an der Zelloberfläche haben, mit dem Latex-Reagenz gemischt werden, kommt es infolge der Vernetzung zu einer deutlich sichtbaren Agglutination der Latex- Partikel. 10 Entero- und Staphylokokken by gnagl 53