Mikrobiologisches Praktikum im Grundmodul GM11

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1 Mikrobiologisches Praktikum im Grundmodul GM Mikrobiologie der Technischen Universität Kaiserslautern 1

2 Inhaltsverzeichnis Beschreibung der Praktikumsversuche 1 Untersuchungen zur Bodenflora 1.1 Bestimmung der Lebendkeimzahl einer Bodenprobe 1.2 Anreicherung aerober Sporenbildner (Bacillus spp.) 2 Untersuchung der Flora des Mund- und Nasenraumes 2.1 Isolierung von Streptococcus spp. 2.2 Isolierung von Staphylococcus spp. 3 Wachstum von Bakterien. Erstellen einer Wachstumskurve. 4 Antibiotische Substanzen 4.1 Erstellen eines Antibiogramms von E. coli und Staphylococcus carnosus 4.2 Lantibiotika Produktion von Staphylococcus 4.3 Suche nach Produzenten von antibiotischen Substanzen 5. Bestimmung biochemisch-physiologischer Merkmale 5.1 Beweglichkeit 5.2 Katalase 5.3 Verwertung von Zuckern 6 Morphologische und cytologische Untersuchung von Bakterien 6.1. Untersuchung und Beschreibung von Bakterienkolonien 6.2 Mikroskopische Untersuchungen 6.3 Gramfärbung von Bakterien A Anhang Material, Medien, Lösungen 2

3 BESCHREIBUNG DER PRAKTIKUMSVERSUCHE Vorbemerkung: Eine wesentliche Voraussetzung für mikrobiologische Experimente ist das sterile Arbeiten. Durch Vorsichtsmaßnahmen soll gewährleistet werden, dass Mikroorganismen, die sich in der Luft, auf Oberflächen, auf Personen befinden, keinen Eingang in die Experimente finden. Ebenso ist darauf zu achten, dass die Bakterien, die aus der Umwelt (Boden, Körper) isoliert und vermehrt wurden, nicht unkontrolliert im Labor weiterverbreitet werden. Vor allem die Kontamination von Personen mit den Isolaten sollte vermieden werden. Dementsprechend sollte mit bakteriellen Kulturen vorsichtig und ruhig umgegangen werden. Steriles Arbeiten: Sterile Gefäße immer geschlossen halten, zum Gebrauch so kurz wie möglich öffnen. Das Öffnen geschieht stets in der Nähe der Bunsenbrennerflamme. Vorher werden Flaschen und Reagenzgläser kurz am Hals abgeflammt, damit dort warme Luft das Eindringen kalter, unsteriler Luft verhindert. Vor dem Schließen wird der Gefäßrand kurz abgeflammt. Nicht über geöffnete Gefäße greifen, da Keime hineinfallen können. Die Gefäßdeckel wenn möglich in der Hand behalten. Pipettenbehälter werden nur zur Entnahme geöffnet; Pipetten vor Gebrauch kurz durch die Bunsenbrennerflamme ziehen. Falls die Pipette berührt wird, nicht mehr benutzen. Allgemein ist Zugluft zu vermeiden, da die Sterilglocke in der Umgebung des Bunsenbrenners zerstört wird. 1. Untersuchungen zur Bodenflora 1.1 Bestimmung der Lebendkeimzahl einer Bodenprobe 1 g Bodenprobe wird in einer Schüttelflasche mit 99 ml sterilem 0.9 % NaCl durch 5-minütiges Schütteln suspendiert und dann davon die Verdünnungsstufen 10-3, 10-4 und 10-5 hergestellt. Davon und von der 10-2 Verdünnung werden jeweils 0.1ml auf LB Agar Platten ausgestrichen. Inkubation der Platten über Nacht bei 37 C. Durch Auszählen der bewachsenen Platten wird anschließend die Keimzahl pro Gramm Boden bestimmt. Die Organismen aus einigen Kolonien werden mikroskopiert und einer Gram-Färbung unterzogen. Anlegen einer Verdünnungsreihe: Verdünnungsschritte: 1:100 1:10 1:10 1:10 Verdünnungsstufe: ,1 ml der Verdünnungsstufen 10-2, 10-3, 10-4 und 10-5 werden auf LB-Agar mittels eines Drigalski-Spatels ausgestrichen. 3

4 Ausplattieren mit dem Drigalski Spatel: 1. Bakteriensuspension auf die Mitte einer Agar Platte geben. Sofort weiterarbeiten. Nicht lange stehen lassen, da die Flüssigkeit einziehen könnte. 2. Drigalski Spatel in eine Schale mit reinem Ethanol tauchen. Ethanol abtropfen lassen. 3. Spatel durch die Flamme eines Bunsenbrenners ziehen. Am Spatel verbliebenes Ethanol abbrennen lassen. Spatel nicht extrem erhitzen. 4. Spatel am Rand auf den Agar auftupfen, um den Spatel Glas vollständig abzukühlen. Bakteriensuspension gleichmäßig auf dem Agar verteilen. Eine Weile aufrecht stehen lassen. Danach umdrehen und inkubieren. 1.2 Anreicherung aerober Sporenbildner (Bacillus) Aus rohen Kartoffeln werden etwa 5 cm lange, keilförmige Stücke geschnitten und in Reagenzgläser gestellt. Die schrägen Schnittflächen der Kartoffelstücke werden mittels einer Impföse mit Erde beimpft. Nach Verschluss der Gläser werden diese für 10 Minuten bei 100 C im Wasserbad erhitzt und anschließend über Nacht bei 37 C bebrütet. Falls sich auf den beimpften Schnittflächen der Kartoffelkeile schleimige Kolonien gebildet haben, werden diese auf eine TBAB-Agar Platte überimpft. Hierzu wird ein Verdünnungsausstrich mit einer Impföse durchgeführt. Die Platten werden bei 37 C über Nacht inkubiert. Die Kolonien der bewachsenen Platten werden anschließend für mikroskopische Untersuchungen (Phasenkontrast, Gramfärbung) herangezogen. Verdünnungsaustrich mit einer Impföse: 3. Abnehmen einer Einzelkolonie oder der Probe 1. Ausglühen im Bunsenbrenner 2. Abkühlen im Agar 4. Verdünnungsausstrich Bebrüten Einzelkolonien Zwischen den Schritten A, B, C und D die Impföse jeweils ausglühen und abkühlen. 4

5 2. Untersuchung der Flora des Mund- und Nasenraumes 2.1 Isolierung von oralen Streptokokken (Streptococcus spp.) Mit einem sterilen Wattestäbchen werden Abstriche vom Zahnhals und von der Mundschleimhaut auf einer D-Blutagar Platte ausgestrichen.. Weitere Ausstriche werden auf einer D-Blutagar Platte mit Tetracyclin (2µg/ml) angefertigt. Alle Platten werden bei 37 C über Nacht inkubiert. Nach der Inkubation sollen die Kolonien der unterschiedlichen Ausstriche verglichen werden. Die Koloniemorphologie und und eventuell auftretende Hämolyse sollen beschrieben werden. Die Zellen von unterschiedlichen Kolonien werden mikroskopiert, einer Gram-Färbung und einem Katalasetest unterzogen. In diesen Auistrichen können sich verschiedene Streptokokken, wie z.b. Streptococus mitis, S. oralis, S. mutans, S. salivarius befinden. 2.2 Isolierung von Staphylokokken Mit einem sterilem Wattestäbchen wird ein Abstrich des Nasenraumes auf einer Baird-Parker-Agar Platte ausgestrichen. Zusätzlich können weitere Abstriche, z.b. Ohr, Haut, Haaransatz angefertigt werden. Platten über Nacht bei 37 C bebrüten. Schwarze, gut wachsende Kolonien auf Baird-Parker-Agar stellen Staphylococcus aureus dar, graue, langsamer wachsende Kolonien sind wahrscheinlich Staphylococcus epidermidis oder andere Staphylokokken. Verschiedene Kolonien sollen mikroskopiert, einer Gram-Färbung und einem Katalasetest unterzogen werden. 3. Wachstum von Bakterien. Erstellen einer Wachstumskurve In dem Versuch soll das Wachstum bakterieller Kulturen durch die Messung der optischen Dichte verfolgt werden. In einer wachsenden Bakterienkultur wird durch Zellteilung die Zahl der Organismen erhöht, was zu einer Zunahme der Trübung des Mediums führt. Die Messung der Trübung, d.h. der optischen Dichte kann daher zur Bestimmung des bakteriellen Wachstums genutzt werden. Drei Röhrchen mit 5 ml Kulturmedium werden mit je 0.5 ml Übernachtkultur oder Glycerinkultur von drei Test Bakterien, Escherichia coli, Staphylococcus carnosus und Streptococcus pneumoniae, beimpft. Von den beimpften Kulturen wird im Photometer die optische Dichte bei 600 nm (OD 600 ) bestimmt.. Danach werden die Kulturen ohne Belüftung bei 37 C im Wasserbad inkubiert und in Intervallen von. 45 Min. 60 Min. wird die OD 600 gemessen. Die erhaltenen Werte werden auf sog. Halb-logarithmisches Papier aufgetragen. Die Einteilung der Zeitachse erfolgt linear, das Auftragen der OD 600 erfolgt dagegen logarithmisch. Im linearen Teil der Kurve kann die Verdopplungszeit abgelesen und damit die Wachstumsrate bestimmt werden. Die Kulturen werden nach dem Ende der Messungen am Nachmittag in den 37 C Brutraum gestellt. Am nächsten Morgen werden die Bakterien durch Vortexen resuspendiert. Zum Abschluss der Wachstumskurve wird noch einmal die OD 600 gemessen. In einem zweiten Experiment wird noch einmal das Wachstum von E. coli und S. carnosus untersucht, diesmal allerdings mit Belüftung (Schütteln) im 37 C Brutraum. Die Intervalle zur Messung der OD 600 werden etwas kürzer gewählt (ca. 30 Min. 45 Min). Die Auswertung dieser Wachstumskurve erfolgt wie oben beschrieben. Die Schüttelkulturen werden mit je 0.5 ml der Kulturen des Vortags beimpft. 4. Antibiotische Substanzen 4.1 Erstellen eines Antibiogramms In diesem Versuch wird das Antibiogramm von Escherichia coli als Vertreter Gram-negativer Bakterien und von Staphylococcus carnosus als Vertreter Gram-positiver Bakterien erstellt. Für diesen Test werden die E. coli und S. carnosus Kulturen der ersten Wachstumskurve benutzt. Jeweils 0,1 ml der Kulturen werden auf je eine LB-Agar Platte mit dem Drigalski-Spatel ausgestrichen. Die ausplattierte Flüssigkeit soll dann für ca. 1 Stunde in den Agar einziehen.. Danach werden 6 Filterplättchen, die verschiedene Antibiotika enthalten, auf die Platte aufgebracht und diese über Nacht bei 37 C bebrütet. Zur Auswertung wird die Größe der Hemmhöfe bestimmt. In diesem Versuchsteil wird die Wirkung von Cephalotin (ein Cephalosporin), Chloramphenicol, Erythromycin, Rifampin, Streptomycin und Tetracyclin untersucht. 4.2 Produktion von Lantibiotika durch Staphylococcus Eine Gruppe von antibakteriellen Peptiden zeichnet sich durch das Vorhandensein von Lanthionin aus und werden deshalb als Lantibiotika bezeichnet. Lantibiotika werden von einer Reihe von Bakterien produziert, unter anderem von verschiedenen Staphylokokken. In dem Versuch werden vier Staphylokokken auf die Produktion von Lantibiotika untersucht. Dazu werden je 0.1 ml der unter 3/4.1 beschriebenen Kulturen von E. coli und von S. carnosus auf eine LB- 5

6 Agar Platte ausgestrichen (Drigalski). Nach Eintrocknen (ca. 1 Stunde) werden die verschiedenen Staphylokokken mit einem sterilen Zahnstocher oder mit der Impföse von der Agar Platte abgenommen und in einer Linie über die vorplattierten Testplatten gestrichen. Die Platten werden über Nacht bei 37 C inkubiert. Die Hemmhöfe zeigen die Produktion von Lantibiotika an. 4.3 Suche nach Produzenten von antibiotischen Substanzen In diesem Experiment soll unter den durch Plattierung der Bodenprobe (1.1) erhaltenen Bakterien nach Produzenten von antibiotisch wirksamen Substanzen gesucht werden. Hierzu werden wie in 4.1/4.2 beschrieben Testplatten mit E. coli und S. carnosus. ausgestrichen. Einige Bakterien der Bodenprobe werden mit sterilen Zahnstochern auf die Testplatten übertragen. Parallel dazu werden die Bakterien auf eine LB-Agar Platte ohne Testbakterien übertragen. Um später die Bakterien auf der LB-Agar Platte und die Bakterien auf der Agar Platte mit Testbakterien zuordnen zu können, wird ein Raster für diese Replikaplattierung benutzt. Die überpickten Bakterien werden über Nacht bei 37 C inkubiert. Am nächsten Morgen wird untersucht, ob Kolonien in der Lage sind, Hemmhöfe zu produzieren. Um die Wahrscheinlichkeit für das Auffinden von Produzenten zu erhöhen, sollte vor allem die Agar Platte untersucht werden, auf der die Bodenprobe in geringster Verdünnung ausplattiert wurde (10-2 ). Da hier sehr viele Organismen auf engem Raum wachsen, sollten Bakterien erkennbar sein, die in der Nachbarschaft wachsende Bakterien am Wachstum hindern. Man kann auf dieser Agar Platte unter Umständen sogar vollständige Hemmhöfe erkennen. Die Bakterien, die solche Hemmhöfe produzieren können, sind die besten Kandidaten als Produzenten von antibiotisch wirkenden Substanzen. 5. Bestimmung biochemisch-physiologischer Merkmale 5.1 Beweglichkeit Die Beweglichkeit von Organismen kann auf Agar-Platten untersucht werden, bei denen der Anteil an Agar reduziert wurde. Dazu wird in der Mitte der Schwärm-Agar Platte punktförmig angeimpft. Bewegliche Organismen haben bei diesem Experiment die Möglichkeit, große Teile, unter Umständen die ganze Agar Platte zu besiedeln. In dem Experiment werden Bakterien verteilt, deren Beweglichkeit getestet werden soll. 5.2 Nachweis von Katalase Das Enzym Katalase produziert aus H 2 O 2 Sauerstoff und Wasser. Das Vorhandensein von Katalase kann mit verdünnter H 2 O 2 -Lösung (3% in H 2 O) getestet werden. Man tropft die Lösung entweder auf Kolonien auf Agar-Platten oder man überträgt eine Impföse Bakterien auf einen Objektträger und tropft dort die H 2 O 2 -Lösung auf. Das Aufschäumen (Sauerstoffbildung) zeigt die Katalase Aktivität an. In dem Experiment soll einerseits die Katalase Aktivität von Test Organismen bestimmt werden. Zusätzlich sollten Katalase Tests mit Eigenisolaten (Boden, Mund, Nase, 1.1, 1.2, 2.1, 2.2) durchgeführt werden. 5.3 Verwertung von Zuckern Die Verwertung von Zuckern wird häufig durch die Bildung von Säure angezeigt. Eine Reihe von Nachweisen zur Zuckerverwertung beruht auf dem Nachweis der Säureproduktion durch geeignete ph Indikatoren Nachweis der Lactose-Verwertung; Nachweis der ß-Galactosidase Aktivität Zum Nachweis der Lactose-Verwertung werden zwei Agar Platten eingesetzt, Chinablau-Lactose Agar und MacConkey Agarplatten. In beiden Agarplatten ist Lactose enthalten. Der Abbau der Lactose wird in beiden Platten durch ein Ansäuern des Mediums mit Hilfe von ph-indikatoren angezeigt. Auf Chinablau-Lactose Agar erscheinen Lactose-fermentierende Organismen blau, auf MacConkey Agar dunkelrot. Chinablau-Lactose Agar enthält keine Hemmstoffe, er ist also geeignet für Gram-positive und Gram-negative Bakterien, MacConkey Agar enthält dagegen Gallensalze und Kristallviolett, wodurch das Wachstum von Gram-positiven Bakterien gehemmt wird. Die Aktivität der ß-Galactosidase, des Enzyms, das für die Spaltung von Lactose in Glucose und GaLactose verantwortlich ist, kann auf Agar Platten nachgewiesen werden, die das chromogene Substrat X-Gal ((5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D- Galactopyranoside) enthalten. Die Aktivität der ß-Galactosidase ist an der Entwicklung einer blauen Farbe erkennbar. Die zu testenden Organismen werden auf den Platten mit der Impföse ausgestrichen und über Nacht bei 37 C inkubiert. 6

7 5.3.2 Nachweis der oxidativen/fermentativen Glucose Verwertung (O/F Test) Bei diesem Test wird die Fähigkeit eines Bakteriums ermittelt, einen bestimmten Zucker in einem komplexen Medium oxidativ oder fermentativ (durch Gärung unter Luftabschluss) verwerten zu können. Zugleich wird getestet, ob bei dieser Kohlenhydratverwertung Säure- oder Gasbildung stattfindet. Die Prüfung auf Säurebildung erfolgt mit ph-indikator, Gasbildung lässt sich in dem hier verwendeten Weichagar an Bläschenbildung erkennen. Die zu testenden Bakterien werden mit einer Impföse in den Weichagar übertragen. Die beimpften Röhrchen werden über Nacht bei 37 C inkubiert. Bei der Auswertung wird beobachtet, ob ein Farbumschlag stattgefunden hat, ob Wachstum entlang des Stichkanals oder Wachstum auf der Oberfläche stattgefunden hat Nachweis der Verwertung von Saccharose im Flüssigmedium. In diesem Experiment wird die Fähigkeit von Mikroorganismen getestet, Zucker zu verwerten. Die Verwertung der entsprechenden Zucker wird wiederum durch Säureproduktion angezeigt. Mit einer Impföse werden die Organismen in die Röhrchen mit Saccharose Bouillon übertragen und über Nacht bei 37 C inkubiert. Zuckerverwertung zeigt sich durch einen Farbumschlag von Rot nach Gelb. 6. Morphologische und cytologische Untersuchung von Bakterien 6.1. Untersuchung und Beschreibung von Bakterienkolonien Bakterien bilden auf festen Nährböden Kolonien. Man versteht darunter mit bloßem Auge sichtbare Zellaggregationen, die infolge ortsgebundener Vermehrung einer einzelnen oder mehrerer aneinanderhaftender Bakterienzellen entstanden sind. Kolonien treten nicht nur unter Laborbedingungen und damit unter künstlichen Bedingungen, sondern auch unter natürlichen Bedingungen auf Substraten mit fester Oberfläche wie z.b. auf Kartoffeln, Fleischwaren, Früchten usw. auf. Form, Struktur und Farbe der am Kolonieaufbau beteiligten Einzelzellen bestimmen u.a. die Koloniemerkmale. Da die Koloniebildung artspezifisch verläuft, ist es möglich, bei Konstanthaltung der Nährboden-, Temperatur- und Luftfeuchtigkeitsbedingungen in einer bestimmten Wachstumszeit nach Farbe, Größe, Höhe, Profil und Umriss einander ähnliche Kolonien eines Bakteriums zu erhalten. Die Kolonieeigenschaften sind Teil der Art- bzw. Stammbeschreibung und dienen dem Wiedererkennen eines bestimmten Bakteriums. Allerdings ist es praktisch nie möglich, Bakterien nur auf Grund ihrer Kolonieform eindeutig zu bestimmen. Kolonieformen: 6.2 Mikroskopische Untersuchungen Bakterien lassen sich im Mikroskop besonders gut darstellen, wenn durch bestimmte Färbungen bakterieller Strukturen deren Kontrast erhöht wurde. Ungefärbt, als sog. Lebendpräparat, sollten Bakterien durch Phasenkontrast Mikroskopie dargestellt werden. Hierfür werden von einer Flüssigkeitskultur mit der Impföse ein Tropfen auf einen Objektträger 7

8 gebraucht, oder es werden Bakterien einer Kolonie mit der Impföse in einem Tropfen Flüssigkeit resuspendiert. Der Tropfen wird mit einem Deckglas bedeckt und mit dem Ölimmersionsobjektiv untersucht. Formen von Bakterien: 6.3. Gram-Färbung von Bakterien Grampositive und gramnegative Bakterien unterscheiden sich in Aufbau und chemischer Zusammensetzung ihrer Zellwand. Dieser Unterschied wird in der von Gram eingeführten Färbetechnik zur Differenzierung von Bakterien ausgenützt. Die Prozedur der Gram-Färbung beginnt mit einer Anfärbung der fixierten Bakterienzelle mit dem basischen Farbstoff Kristallviolett. Die nachfolgende Jod-Jod-Kali-Beizung führt zur Bildung von Lacken zwischen Kristallviolett und Jod (Farbstoff-Jod-Komplex). Bei der nachfolgenden Alkoholbehandlung lässt die Zellwand der gramnegativen Bakterien den Farbstoff-Jod-Komplex entsprechend dessen Alkohollöslichkeit bis zur Entfärbung wieder aus der Zelle austreten. Die Zellwand der grampositiven Bakterien hingegen kann von dem Farbstoff-Jod-Komplex nicht oder nur in geringem Maße passiert werden. Eine anschließende Gegenfärbung mit Safranin macht den Unterschied sichtbar. Die vollständig durchgeführte Gramfärbung ergibt somit schwarzblau gefärbte Gram-positive und rot gefärbte Gram-negative Zellen. Durchführung: 1. Färbung eines hitzefixierten Bakterienausstriches mit Kristallviolett: 1 min. 2. Farbstoff abgießen und mit deion. Wasser nachspülen (Wasser höchstens 2 sec einwirken lassen! ). 3. Dann Präparat mit Lugol'scher Lösung überschichten und für 2-3 min einwirken lassen. 4. Lugolsche Lösung mit Wasser abspülen und trocknen lassen. Evtl. vorsichtig mit Papier abtupfen. 5. Zur Entfärbung mit Alkohol spülen (etwa 30 sec). 6. Gegenfärbung mit Safraninlösung (etwa 30 sec einwirken lassen). 7. Mit Wasser abspülen und Präparat zwischen Löschpapier trocknen. 8. Mikroskopische Untersuchung mit dem Olimmersionsobjektiv (Durchlicht!). Im Praktikum werden Test Organismen ausgegeben, deren Gramfärbungstyp bestimmt werden soll. Zu diesen Testbakterien sollen eine Anzahl Eigenisolate (aus 1.1, 1.2, 2.1, 2.2) gefärbt werden. Schnelltest zur Gram-Differenzierung Bei dieser Methode wird die schnelle Zerstörung der Zellwand eines Gram-Typs in 3%iger Kalilauge zur Differenzierung ausgenutzt. Bakterien des anderen Gram-Typs lysieren unter diesen Bedingungen nicht. Durch die Lyse der Zellwand wird die DNA frei, die als viskoser Faden in Erscheinung tritt. Dieses Auftreten der viskosen DANN zeigt also an, welchen Gram-Typ das betreffende Bakterium darstellt. Um die Bestimmung des Gram-Typs der Eigenisolate zu Beschleunigen kann dieser einfache Test herangezogen werden. Voraussetzung ist allerdings, dass bei den Testorganismen Lyseverhalten eindeutig mit der Gram-Färbung korreliert werden konnte. Durchführung: 1. Einen Tropfen KOH auf den Objektträger geben 2. Bakterien mit sterilem Holzzahnstocher von der Agarkultur entnehmen und in den KOH-Tropfen bringen. Zellmasse sehr rasch in der KOH-Lösung mit kreisförmiger Bewegung verreiben. (5-8 sec) Zahnstocher vorsichtig vom Objektträger abheben(1-2 cm hoch) und auf Fadenbildung achten. 8

9 Anhang A. Material, Medien, Lösungen Bestandteile von einfachen synthetischen Medien Synthetische Medien sind in ihrer Zusammensetzung definiert und enthalten für einen chemoorganotrophen Mikroorganismus Makro- und Mikroelemente in ausreichender Form. Als Stickstoff- und Schwefelquellen können im einfachsten Fall anorganische Salze dienen etwa (NH 4 ) 2 SO 4, Inder Regel sind solche Medien phosphatgepuffert und enthalten als C-Quelle ein Monosaccharid wie Glucose oder andere einfach metabolisierbare Kohlenstoffe wie Citrat oder Pyruvat. Bestandteile komplexer Medien AGAR-AGAR Agar ist der Trivialname für eine Gruppe gelbildender Polysaccharide aus Rotalgen (Rodo-phyta: z.b. Gelidium, Gracilaria usw.), die in 2 Hauptkomponenten zerfallen: Agarose und Agaropektin. Agaropektin bildet ein 3-dimensionales Netzwerk aus alternierenden 3-β-verknüpften β-d-galactopyranose-(90 % Anteil) und 4-β- verknüpften 3,6-Anhydro-α-Lgalactopyranose Einheiten (ca. 10 % Anteil). Bei etwa jeder zehnten Galactopyranoseeinheit ist eine der primären bzw. sekundären Hydroxylgruppen mit Schwefelsäure verestert. Die im wesentlichen neutralen Teile des Agars werden als Agarose bezeichnet. Sie bestehen aus linearen Ketten mit alternierenden 1,3 verknüpften β-d-galactose- und 1,4 verknüpften 3,6-Anhydro-α-L- Galactose Einheiten. Feste Nährböden enthalten im allgemeinen 1,2-2 % Agar (w/v), halbfeste Medien oder Weichagars ca. 0,5 % Agar oder weniger und sehr feste Medien 8 % Agar oder mehr. Anstelle von "Agar Agar" wird in diesem Skript nur die Kurzbezeichnung "Agar" verwendet. CASEINHYDROLYSAT Das Hydrolysat wird aus Casein durch salzsauren Aufschluss gewonnen. Bei diesem Verfahren werden Vitamine und sonstige Wuchsstoffe weitgehend zerstört. Dies gilt auch für die Aminosäure Tryptophan. Das Hydrolysat eignet sich daher besonders für die bakteriologische Bestimmung von Vitaminen. FLEISCHEXTRAKT Fleischextrakt wird aus sehnen- und fettfreiem Fleisch hergestellt. Vor der Extraktion wird das Fleisch einer leichten Proteolyse unterworfen. Fleischextrakt stellt eine hochwertige Nährgrundlage dar. Er ist nahezu frei von vergärbaren Kohlenhydraten. GALLE, RINDERGALLE Die in der Mikrobiologie verwendete Rindergalle ist eine gereinigte Naturgalle in lyophilisierter Form. Zur Hemmung des Wachstums der Grampositiven Flora werden dem Nährboden g/l vor dem Autoklavieren zugesetzt. Anstelle von getrockneter Naturgalle kann auch eine Gallensalzmischung verwendet werden. Dieses Produkt hat den Vorteil, dass die verschiedenen Gallensalze in einer standardisierten Form hergestellt und gemischt werden und sie eine höhere Hemmwirkung besitzen. Eine gewissen Hemmung kann hierbei auch innerhalb der Enterobacteriaceae-Gruppe nicht ausgeschlossen werden. Die übliche Konzentration im Medium ist ca. 1,5 %. Nährböden/Medien Die Angaben gelten, wenn nicht anders vermerkt, für 1 l dest. Wasser. Zur Verfestigung Zusatz von 1,5 % (g/v) Agar. Angegebenen ph-wert vor dem Autoklavieren mit HCl oder NaOH einstellen. LB-MEDIUM / LB-AGAR Zusammensetzung: (g/l) Trypton 10,0 Hefeextrakt 5,0 NaCl 10,0 (Agar 15,0) 9

10 LB-X-Gal Agar Platten Zugabe von 40µg/ml X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-Galactopyranosid). THB-Medium (Todd-Hewitt Broth) Komplex-Medium zur Anzucht von verschiedenen Bakterien, u.a. Streptococcus pneumoniae. Zusammensetzung: Herzinfusion Pepton Glucose Natriumcarbonat Natriumchlorid Dinatriumphosphat ad 1000ml 3,1 g 20,0 g 2,0 g 2,5 g 2,0 g 0,4 g D-AGAR (Blutagarplatten für S. pneumoniae oder Streptococcus mitis) Zusammensetzung: (g/l) Glucose 1 Bactopepton 10 Neopepton 5 Yeast-extract (Hefe-Extract) 1,25 NaCl 5 Tris 1,25 AGAR 16,5 Der ph-wert muss nicht eingestellt werden. Der Agar wird autoklaviert und in 300 ml Portionen abgefüllt. Vor Verwendung wird der Agar in der Mikrowelle aufgekocht und anschließend auf 48 C im Brutschrank oder Wasserbad temperiert. Pro 100 ml Medium werden 3 ml defibriniertes Schafsblut zugegeben gut durchmischt und dann umgehend die Platten gegossen. (Zu heißer Agar führt zum Platzen der Erythrocyten und zu einer Braunfärbung der Platten!) BAIRD PARKER AGAR Verwendungszweck: Nachweis von Staphylococcus aureus. Schwarze Kolonien zeigen die aerobe Reduktion von Tellurit zu metallischem Tellur an. Natriumpyruvat und Glycin wirken auf Staphylokokken wachstumsfördernd, während Lithiumchlorid und Tellurit auf die übrige Begleitflora hemmend wirkt. Zusammensetzung: (g/l) Pepton aus Casein 10,0; Fleischextrakt 5,0; Hefeextrakt 1,0; Natriumpyruvat 10,0; Glycin 12,0; Lithiumchlorid 5,0; Agar 15,0. Zubereitung: 58 g des Trockennährbodens werden in 950 ml destilliertem oder voll-entsalztem Wasser suspendiert, 15 min eingeweicht, zum Lösen vorsichtig erhitzt und 1 min gekocht. Die Sterilisation erfolgt im Autoklaven bei 121 C für 15 min. Danach wird das Medium auf ca C abgekühlt. Danach 50 ml einer Eigelb-Tellurit Emulsion zugeben. Der gebrauchsfertige Nährboden hat bei 25 C einen ph-wert von 7,0 ± 0,2, ist opak und von heller bis mittelgelber oder schmutzig strohgelber Farbe. CHINABLAU LACTOSE AGAR Nährboden zur Unterscheidung Lactose-positiver und Lactose-negativer Mikroorganismen sowie zur Keimzahlbestimmung in Milch. Wirkungsweise: Der Nährboden ohne Hemmstoffe enthält Lactose als C-Quelle, deren Abbau zu Säure vom ph-indikator Chinablau durch einen Farbumschlag von farblos nach blau angezeigt wird. 10

11 Zusammensetzung: (g/l) Fleischextrakt 3,0 Pepton aus Casein 5,0 Natriumchlorid 5,0 Lactose 10,0 Chinablau 0,375 Agar 12,0 ph 7,0 ± 0,2 Zubereitung: 35,5 g /Liter, durch Erhitzen lösen, 15 min autoklavieren MacConkey Agar Der Agar ist ein Selektivmedium zur Isolierung und zum Nachweis von Enterobakterien in klinischem Material, Wasser, Milch, Milchprodukten und anderen Nahrungsmitteln. Wirkungsweise: Durch Kristallviolett und Gallesalze werden die Grampositiven Keime weitgehend unterdrückt. Die Lactose dient zur Differenzierung von Lactose-positiven und -negativen Bakterien. Lactose-abbauende Mikroorganismen bilden Säure. Die Reduktion des ph wird durch Neutralrot angezeigt. Lactose-positive Kolonien sind dunkelrot. Zusammensetzung: MacConkey-Agar (in g/l) (Mengen für 1 Liter): Bacto Pepton 20,0 Bacto Gallensalze 3,0 NaCl 5,0 Neutralrot 0,03 Kristallviolett 0,001 Lactose 10,0 Agar 13,5 Oxidation-Fermentation (OF)-Testnährböden Bei diesem Test wird die Fähigkeit eines Bakteriums ermittelt, einen bestimmten Zucker in einem komplexen Medium oxidativ oder fermentativ (durch Gärung unter Luftabschluss) verwerten zu können. Zugleich wird getestet, ob bei dieser Kohlenhydratverwertung Säure- oder Gasbildung stattfindet. Die Prüfung auf Säurebildung erfolgt mit ph-indikator, Gasbildung lässt sich in dem hier verwendeten Weichagar an Bläschenbildung erkennen. Zusammensetzung (g/l) Pepton aus Casein 2,0 Hefeextrakt 1,0 NaCl 5,0 K 2 HPO 4 0,2 Bromthymolblau 0,08 AGAR 2,5 zu testender Zucker 10 die Zuckerlösung wird als separat autoklavierte 10%ige oder 20%ige Lösung dem autoklavierten Weichagar beim Abkühlen (55 C) zugesetzt Saccharose BOUILLON Sacharose-Bouillon dient zum Nachweis von Zuckerverwertung. Es können selbstverständlich auch andere Zucker getestet werden. Das Medium enthält keine anderen vergärbaren Kohlenhydrate als Saccharose und ist daher auch zum Nachweis der Saccharoseverwertung unter Säurebildung bei vorheriger Zugabe eines ph-indikators, z.b. Phenolrot geeignet, wobei ein Farbumschlag von purpurrot nach gelb beobachtet wird. Zusammensetzung: g/l Pepton aus Casein 10,0 Natriumchlorid 5,0 Saccharose 5,0 Phenolrot 0,012 11

12 Tryptose-Blood Agar Base (TBAB) TBAB ist ein reiches Komplexmedium auf dem auch ohne Zusatz von Blut eine Reihe Bakterien gut wachsen können. So hat sich gezeigt, dass z.b. Bacillus gut auf diesem Medium kultiviert werden kann..zusammensetzung: (g/liter) Tryptose 10 Beef Extract 3 NaCl 5 Agar 15 ph 7,2 Schwärm-Agar Komplettmedium (LB) mit erniedrigtem AGAR Gehalt (0,3 % = 3 g/l). Platten werden in der Mitte mit dem zu testenden Bakterium punktförmig beimpft. Nach dem Bebrüten zeigt eine punktförmige Kolonie Unbeweglichkeit an. Bewegliche Zellen haben die Möglichkeit sich vom Impfpunkt zu entfernen und sich auf einen größeren Umkreis (evtl. die gesamte Petrischale) zu verteilen. Färbelösungen zur Gramfärbung Ammoniumoxalat-Kristallviolett: Lösung A: 2 g Kristallviolett in 100 ml Äthanol (96 %) lösen Lösung B: 0,8 g Ammoniumoxalat in 80 ml dest. Wasser lösen A + B mischen, filtrieren Lugol'sche Lösung: 1 g Jod + 2 g Kaliumjodid werden in 25 ml dest. Wasser gelöst. Danach wird mit destilliertem Wasser auf 300 ml aufgefüllt. Safraninlösung: 1 g Safranin in 10 ml Äthanol lösen. Zu dieser Lösung werden 90 ml dest. Wasser zugegeben. 12