PROTOKOLL ÜBER DIE BAKTERIZIDE UND FUNGIZIDE WIRKSAMKEIT VON NEOCHEMOSEPT

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1 PROTOKOLL ÜBER DIE BAKTERIZIDE UND FUNGIZIDE WIRKSAMKEIT VON NEOCHEMOSEPT Durchgeführt von: DI Wolfgang Stocker Protokoll erstellt am für: SANOCHEMIA PHARMAZEUTIKA AG Abteilung Mikrobiologische Qualitätskontrolle Landeggerstrasse 7 A-2491 Neufeld/Leitha SLO-WERFFT Ticha 4 Dunajska Streda SK Slovakia Getestete Charge: #03W611 Musterzug: 1. Eckdaten des getesteten : Neochemosept Spezial #03W611 ( Fa. Sanochemia Pharmazeutika AG / 5%ige wässrige Lösung ) Wirkstoff: Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid 2. Verwendete Keime für die Suspensionstests: Staphylococcus aureus ATCC 6538 ( grampositive Kokken ) Enterococcus hirae ATCC ( grampositive Kokken ) Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 ( gramnegative Stäbchen ) Proteus vulgaris ATCC ( gramnegative Stäbchen ) Candida albicans ATCC ( grampositive Hefe ) Aspergillus niger ATCC ( grampositiver Schimmelpilz ) Nocardia sp. 4590/95 ( Isolat aus Milchdrüse, Rind ) 3. Verwendete METHODE: Als Methode werden sogenannte quantitative Suspensionstests verwendet. Diese Tests werden in folgenden DIN-NORMEN beschrieben: DIN EN 1656 DIN EN

2 4. Testvorbereitungen: Herstellung der Stammkulturen: Die Stammkulturen aller verwendeten Mikroorganismen wurde durch Kultivierung auf passende Agarplatten durchgeführt. Diese Kulturen wurden dann bei 4-8 C gelagert und als Impfmaterial für die Arbeitskulturen verwendet. - Bakterien: Caso-Agar ( fertige Platten Fa. BioMerieux Art. Nr.: ) 24h bei 36,5 C - Hefe: Sabouraud-2%-Glukose Agar ( fertige Platten Fa. BioMerieux Art. Nr.: ) Malz-Agar ( Granulat Fa. VWR Art. Nr.: 5398) 48h bei 32,5 C - Schimmelpilz: lyophilisierte Pellets ( Fa. VWR Art. Nr.: PRMC0392PEC) mit genau definierter Keimzahl ( 10 7 /Pellet ); Gebrauchsbereit! - Nocardia sp.: Isolat auf Sabouraud-2%-Glukose Agar ( VETMED ) 5-7d bei 32,5 C Herstellung der Arbeitskulturen: Unter Verwendung des Inokulums der Stammkulturen wurden für jeden Ansatz frische Flüssigkulturen ( für Bakterien Caso-Bouillon / für Hefe und Nocardia Sabouraud-2%-Glukose Bouillon ) angesetzt. Die Keimzahl dieser Arbeitskulturen lag zwischen 10 7 ( bei Nocardia sp. und Candida albicans ) und 10 9 ( bei den Bakterien ). Die Keimzahlbestimmung wurde mittels Impedanzmethode ( µ-trac Fa. SY-LAB ) und der Plattenverdünnungsmethode bestimmt. Diese Suspensionen wurden bei Raumtemperatur gelagert und innerhalb von ca. 2h für die Tests verwendet. Herstellung der sterilen Gebrauchslösungen - Sabouraud-2%-Glukose Bouillon ( Fa. VWR Art. Nr.: 8339 ): 30g Granulat wurden in 1000ml dest. Wasser gelöst und bei 121 C und 1,2bar Überdruck für 15 sterilisiert. - Caso Bouillon ( Fa. VWR Art. Nr.: 5459 ): 30g Granulat wurden in 1000ml dest. Wasser gelöst und bei 121 C und 1,2bar Überdruck für 15 sterilisiert. - Wasser mit standardisierter Härte ( CaCO 3 300mg/L ): Wasserfreies MgCl 2 ( Fa. VWR Art. Nr.: ) und CaCl 2 ( Fa. VWR Art. Nr.: 2386 ) wurden in 1000ml dest. Wasser gelöst und bei 121 C und 1,2bar Überdruck für 15 sterilisiert ( Lösung A ). NaHCO 3 ( Fa. VWR Art. Nr.: ) wurde in 1000ml dest. Wasser gelöst und mittels Filtration (µ=0,22nm ) sterilisiert ( Lösung B ). Dann wurden 3ml Lösung A in 200ml sterilem dest. Wasser gelöst mit 4ml Lösung B versetzt und auf 500ml mit sterilem dest. Wasser aufgefüllt. - Milch 10% ( für in-vitro Zitzentest ): 5g rekonstituiertes Milchpulver ( Fa. VWR Art. Nr.: ) wurden in 50ml dest. Wasser gelöst und bei 121 C und 1,2bar Überdruck für 5 sterilisiert. - Serum Albumin 3% ( für Suspensionstest ohne ): 3g Serum Albumin ( Fa. SIGMA Art. Nr.: A4503 ) wurden in 100ml dest. Wasser gelöst und mittels Filtration ( µ=0,22nm ) sterilisiert. 2

3 - Pepton-NaCl-Puffer ( Fa. VWR Art. Nr.: 7228 ): 25,5g Pepton-NaCl-Puffer wurden in 1000ml gelöst und bei 121 C und 1,2bar Überdruck für 15 sterilisiert. - Wasser ( zur Verdünnung des Neutralisationsmediums ): Bidest. Wasser wurden bei 121 C und 1,2bar für 15 sterilisiert. - Neutralisationsmedium: 30g Saponin ( Fa. RIEDEL de HAEN Art. Nr.: ), 30g TW80 ( Fa. VWR Art. Nr.: 17661), 30g Caso- ( für Bakterien ) oder 30g Sabouraud-2%-Glukose Bouillon ( für Hefe, Pilze und Nocardia ), 1g L - Histidin ( Fa. VWR Art. Nr.: 4351 ) und 1g L - Cystein ( Fa. VWR Art. Nr.: ) wurden in 1000ml gelöst und bei 121 C und 1,2bar Überdruck für 15 sterilisiert. Diese Lösung mußte nach der Sterilisation im warmen Zustand gut gerührt werden, damit alle Bestandteile auch tatsächlich in Lösung gebracht werden konnten! 5. Methodenbeschreibung: Oberflächenmethode für Agarplatten: Nach den Suspensionsansätzen werden die gezogenen Proben ( 1ml nach der Neutralisation ) mittels Pepton-NaCl-Puffer passend verdünnt und 100µl auf den Agarplatten ausgestrichen. 6. Durchführung der Suspensionstests: Suspensionstest mit Serum Albumin ( Inkubationstemperatur 10±1 C ohne ) 1ml Serum Albumin und 1ml Keimsuspension werden in 14ml sterilen PP - Röhrchen ( Fa. GREINER Art. Nr.: ) für 2 bei 10 C vorinkubiert und dann mit den hergestellten lösungen versetzt. Dieser Testansatz wird mittels VORTEX homogenisiert und bei 10 C inkubiert. Nach einer Einwirkzeit von 5 ±10 und 30 ±10 ( bei Ansätze mit Nocardia sp. wurde zusätzlich nach 60 ±10 Probe gezogen! ) wird jeweils 1ml Probe aus den Ansätzen gezogen und in 8ml Neutralisationsmediums und 1ml dest. Wasser übergeführt und mittels VORTEX homogenisiert. Diese Neutralisation des s bei Raumtemperatur dauert 5 ±10. Nun wird 1ml neutralisierte Probe gezogen und durch passende Verdünnung mit Pepton-NaCl-Puffer auf Agarplatten ( Caso, Sabouraud oder Malz ) ausgestrichen und bei den passenden Temperaturen ( Bakterien: 36,5 C für 24h / Nocardia: 32,5 C für 5-7d / Hefe und Schimmelpilz: 32,5 C für 48-72h ) inkubiert. Suspensionstest mit Milch ( Inkubationstemperatur 30±1 C mit ): Siehe Suspensionstest mit Serum Albumin! Berechnung ( Oberflächenverfahren ): RF...Reduktionsfaktor N 0...Anfangskeimzahl N...Keimzahl nach Einwirkzeit RF = N 0 x 10-1 / N 3

4 7. Validierung des Suspensionstests: Verwendete Mikroorganismen: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans und Nocardia sp. Alle Gebrauchskulturen wurden durch passende Verdünnungen mit Pepton-NaCl-Puffer auf eine Ausgangskeimzahl ( N 0 ) von 10 4 KBE/ml eingestellt. Validierung der Testbedingungen ( Bedingung A ): Suspensionsansatz ( Inkubation bei 10 C und 30 C ) mit standardisiertem Wasser anstelle des s und als Inokulum wird eine Keimsuspension mit einer Keimzahl von 10 4 KBE/ml ( d.h KBE/ml im Ansatz ). 1ml Probe wird entnommen und auf Agarplatte ausgestrichen. Parallel dazu wird 1ml in einem µ-trac Meßzelle überführt. Auswertung: A 0,5 x N 0 Überprüfung der Toxizität des Neutralisationsmediums ( Bedingung B ): Das verwendete Neutralisationsmedium wird mit einer Keimzahl von 10 4 KBE/ml ( d.h KBE/ml im Ansatz ) inokuliert und für 5 bei Raumtemperatur inkubiert. 1ml Probe wird entnommen und auf Agarplatte ausgestrichen. Parallel dazu wird 1ml in einem µ-trac Meßzelle überführt. Auswertung: B 0,5 x N 0 Validierung des Neutralisationsmediums ( Bedingung C ): Suspensionsansatz mit dem zu prüfenden s. 1ml dieser Mischung wird für 5±1 im Neutralisationsmediums neutralisiert. Dann wird dieser Ansatz mit einer Keimzahl von 10 4 KBE/ml ( 10 3 KBE/ml im Ansatz ) inokuliert und für 30 bei Raumtemperatur inkubiert. 1ml Probe wird entnommen und auf Agarplatte ausgestrichen. Parallel dazu wird 1ml in einem µ-trac Meßzelle überführt. Auswertung: C 0,05 x B Alle drei Bedingungen müssen erfüllt werden, um die Validierung erfolgreich abschließen zu können!! 8. Ergebnisse der Validierung: Bei der Validierung der Suspensionstests wurde pro Keimgruppe ein Vertreter für diese Verifizierung verwendet! Grampositive Bakterien: Staphylococcus aureus Gramnegative Bakterien: Pseudomonas aeruginosa Hefe und Schimmelpilze: Candida albicans Aktinomycetes: Nocardia sp. 4590/95 4

5 Staphylococcus aureus: T [ C] Einwirkzeit A B C Milch 1% ,8E+03 7,2E+03 valid - - Albumin 9, ,8E+03 4,4E+03 valid - - Wasser RT ,8E+03 4,6E+03 - valid - Milch 1% Neochemosept 0,1 4,8E+03 3,2E valid Albumin 9,8 30 Neochemosept 0,1 4,8E+03 3,7E valid Pseudomonas aeruginosa: Candida albicans: T Einwirkzeit Desinfektions- [ C] mittel A B C Milch 1% ,6E+03 1,7E+03 valid - - Albumin 9, ,6E+03 1,3E+03 valid - - Wasser RT ,6E+03 2,3E+03 - valid - Milch 1% Neochemosept 0,1 2,6E+03 5,0E valid Albumin 9,8 30 Neochemosept 0,1 2,6E+03 4,9E valid Nocardia sp.: T [ C] Einwirkzeit T Einwirkzeit [ C] A B C Milch 1% ,8E+03 4,8E+03 valid - - Albumin 9, ,8E+03 5,5E+03 valid - - Wasser RT ,8E+03 4,7E+03 - valid - Milch 1% Neochemosept 0,1 5,8E+03 5,1E valid Albumin 9,8 30 Neochemosept 0,1 5,8E+03 4,6E valid Konzen tration A B C Milch 1% ,7E+03 5,2E+03 valid - - Albumin 9, ,7E+03 4,7E+03 valid - - Wasser RT ,7E+03 3,1E+03 - valid - Milch 1% Neochemosept 0,1 5,7E+03 1,7E valid Albumin 9,8 30 Neochemosept 0,1 5,7E+03 1,8E valid Prüfer: Unterschrift: Datum: 5

6 9. Suspensionstests: Für die Suspensionstests wurden folgende Keime verwendet: Grampositive Bakterien: Staphylococcus aureus, Enterococcus hirae Gramnegative Bakterien: Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris Hefe und Schimmelpilze: Candida albicans, Aspergillus niger Aktinomycetes: Nocardia sp. 4590/95 Staphylococcus aureus ( ): Enterococcus hirae ( ): Pseudomonas aeruginosa ( ): Milch 1% 30,0 5 Neochemosept 5 1,4E+07 1,0E+00 7,1 Milch 1% 30,0 5 Neochemosept 1 1,4E+07 1,0E+00 7,1 Milch 1% 30,0 5 Neochemosept 0,05 1,4E+07 1,0E+00 7,1 Milch 1% 30,0 30 Neochemosept 5 1,4E+07 1,0E+00 7,1 Milch 1% 30,0 30 Neochemosept 1 1,4E+07 1,0E+00 7,1 Milch 1% 30,0 30 Neochemosept 0,05 1,4E+07 1,0E+00 7,1 Albumin 9,8 5 Neochemosept 5 1,5E+07 1,0E+00 7,2 Albumin 9,8 5 Neochemosept 1 1,5E+07 1,0E+00 7,2 Albumin 9,8 5 Neochemosept 0,05 1,5E+07 1,5E+01 6,0 Albumin 9,8 30 Neochemosept 5 1,5E+07 1,0E+00 7,2 Albumin 9,8 30 Neochemosept 1 1,5E+07 1,0E+00 7,2 Albumin 9,8 30 Neochemosept 0,05 1,5E+07 1,0E+00 7,2 Albumin 9,7 5 Neochemosept 5 1,2E+07 1,0E+00 7,1 Albumin 9,7 5 Neochemosept 1 1,2E+07 1,0E+00 7,1 Albumin 9,7 5 Neochemosept 0,05 1,2E+07 1,0E+00 7,1 Albumin 9,7 30 Neochemosept 5 1,0E+07 1,0E+00 7,0 Albumin 9,7 30 Neochemosept 1 1,0E+07 1,0E+00 7,0 Albumin 9,7 30 Neochemosept 0,05 1,0E+07 1,0E+00 7,0 Milch 1% 30,0 5 Neochemosept 5 5,2E+06 1,0E+00 6,7 Milch 1% 30,0 5 Neochemosept 1 5,2E+06 1,0E+00 6,7 Milch 1% 30,0 5 Neochemosept 0,05 5,2E+06 1,1E+04 2,7 Milch 1% 30,0 30 Neochemosept 5 5,2E+06 1,0E+00 6,7 Milch 1% 30,0 30 Neochemosept 1 5,2E+06 1,0E+00 6,7 Milch 1% 30,0 30 Neochemosept 0,05 5,2E+06 1,0E+00 6,7 Albumin 10,5 5 Neochemosept 5 3,0E+06 1,0E+00 6,5 Albumin 10,5 5 Neochemosept 1 3,0E+06 1,0E+00 6,5 Albumin 10,5 5 Neochemosept 0,05 3,0E+06 1,5E+01 5,3 Albumin 10,5 30 Neochemosept 5 3,0E+06 1,0E+00 6,5 Albumin 10,5 30 Neochemosept 1 3,0E+06 1,0E+00 6,5 Albumin 10,5 30 Neochemosept 0,05 3,0E+06 1,0E+00 6,5 Milch 1% 29,5 5 Neochemosept 5 1,1E+07 1,0E+00 7,0 Milch 1% 29,5 5 Neochemosept 1 1,1E+07 1,0E+00 7,0 Milch 1% 29,5 5 Neochemosept 0,05 1,1E+07 1,5E+01 5,9 Milch 1% 29,5 30 Neochemosept 5 1,1E+07 1,0E+00 7,0 Milch 1% 29,5 30 Neochemosept 1 1,1E+07 1,0E+00 7,0 Milch 1% 29,5 30 Neochemosept 0,05 1,1E+07 1,5E+01 5,9 6

7 Proteus vulgaris ( ): Candida albicans ( ): Aspergillus niger ( ): Albumin 10,3 5 Neochemosept 5 9,6E+06 1,0E+00 7,0 Albumin 10,3 5 Neochemosept 1 9,6E+06 1,0E+00 7,0 Albumin 10,3 5 Neochemosept 0,05 9,6E+06 1,0E+00 7,0 Albumin 10,3 30 Neochemosept 5 9,6E+06 1,0E+00 7,0 Albumin 10,3 30 Neochemosept 1 9,6E+06 1,0E+00 7,0 Albumin 10,3 30 Neochemosept 0,05 9,6E+06 1,0E+00 7,0 Milch 1% 31 5 Neochemosept 5 1,6E+07 1,0E+00 7,2 Milch 1% 31 5 Neochemosept 1 1,6E+07 1,0E+00 7,2 Milch 1% 31 5 Neochemosept 0,05 1,6E+07 5,0E+03 3,5 Milch 1% Neochemosept 5 1,6E+07 1,0E+00 7,2 Milch 1% Neochemosept 1 1,6E+07 1,0E+00 7,2 Milch 1% Neochemosept 0,05 1,6E+07 1,0E+00 7,2 Albumin 9,0 5 Neochemosept 5 2,0E+05 1,00E+00 5,3 Albumin 9,0 5 Neochemosept 1 2,0E+05 1,00E+00 5,3 Albumin 9,0 5 Neochemosept 0,05 2,0E+05 1,00E+00 5,3 Albumin 9,0 30 Neochemosept 5 4,0E+05 1,0E+00 5,6 Albumin 9,0 30 Neochemosept 1 4,0E+05 1,0E+00 5,6 Albumin 9,0 30 Neochemosept 0,05 4,0E+05 1,0E+00 5,6 Milch 1% 31,0 5 Neochemosept 5 2,6E+05 1,0E+00 5,4 Milch 1% 31,0 5 Neochemosept 1 2,6E+05 1,0E+00 5,4 Milch 1% 31,0 5 Neochemosept 0,05 2,6E+05 4,0E+03 1,8 Milch 1% 31,0 30 Neochemosept 5 2,6E+05 1,0E+00 5,4 Milch 1% 31,0 30 Neochemosept 1 2,6E+05 1,0E+00 5,4 Milch 1% 31,0 30 Neochemosept 0,05 2,6E+05 1,0E+00 5,4 Albumin 9,3 5 Neochemosept 5 1,5E+05 1,5E+01 4,0 Albumin 9,3 5 Neochemosept 1 1,5E+05 8,8E+03 1,2 Albumin 9,3 5 Neochemosept 0,05 1,5E+05 5,1E+04 0,5 Albumin 9,3 30 Neochemosept 5 1,8E+05 1,0E+00 5,3 Albumin 9,3 30 Neochemosept 1 1,8E+05 1,5E+01 4,1 Albumin 9,3 30 Neochemosept 0,05 1,8E+05 1,5E+01 4,1 Milch 1% 30,5 5 Neochemosept 5 2,5E+05 1,0E+00 5,4 Milch 1% 30,5 5 Neochemosept 1 2,5E+05 2,3E+02 3,0 Milch 1% 30,5 5 Neochemosept 0,05 2,5E+05 9,5E+04 0,4 Milch 1% 30,5 30 Neochemosept 5 2,5E+05 1,0E+00 5,4 Milch 1% 30,5 30 Neochemosept 1 2,5E+05 1,0E+00 5,4 Milch 1% 30,5 30 Neochemosept 0,05 2,5E+05 1,0E+00 5,4 7

8 Nocardia spp. ( ): T Einwirkzeit Desinfektions- Konzentration [ C] mittel Milch 1% 30,5 5 Neochemosept 5 9,2E+05 1,0E+00 6,0 Milch 1% 30,5 5 Neochemosept 1 9,2E+05 1,0E+00 6,0 Milch 1% 30,5 5 Neochemosept 0,1 9,2E+05 1,0E+00 6,0 Milch 1% 30,5 30 Neochemosept 5 7,4E+05 1,0E+00 5,9 Milch 1% 30,5 30 Neochemosept 1 7,4E+05 1,0E+00 5,9 Milch 1% 30,5 30 Neochemosept 0,1 7,4E+05 1,0E+00 5,9 Milch 1% 30,5 60 Neochemosept 5 7,0E+05 1,0E+00 5,8 Milch 1% 30,5 60 Neochemosept 1 7,0E+05 1,0E+00 5,8 Milch 1% 30,5 60 Neochemosept 0,1 7,0E+05 1,0E+00 5,8 Albumin 10,2 5 Neochemosept 5 1,1E+06 1,0E+00 6,0 Albumin 10,2 5 Neochemosept 1 1,1E+06 1,0E+00 6,0 Albumin 10,2 5 Neochemosept 0,1 1,1E+06 1,0E+00 6,0 Albumin 10,2 30 Neochemosept 5 6,8E+05 1,0E+00 5,8 Albumin 10,2 30 Neochemosept 1 6,8E+05 1,0E+00 5,8 Albumin 10,2 30 Neochemosept 0,1 6,8E+05 1,0E+00 5,8 Albumin 10,2 60 Neochemosept 5 7,9E+05 1,0E+00 5,9 Albumin 10,2 60 Neochemosept 1 7,9E+05 1,0E+00 5,9 Albumin 10,2 60 Neochemosept 0,1 7,9E+05 1,0E+00 5,9 Prüfungszeitraum: Prüfer: Unterschrift: Datum: 8

9 10. Beurteilung der Ergebnisse der Suspensionstests: Bewertungskriterien der Wirksamkeit von laut DIN NORMEN: Bakterizid: Reduktion der Keimzahl um 5 log Stufen Fungizid: Reduktion der Keimzahl um 4log Stufen Neochemosept zeigt gegen alle Testkeime ( sogar bei sehr niedrigen Konzentrationen und auch gegen Nocardia sp. ) eine breite Wirksamkeit. Unterschiede bei den Suspensionstests zwischen den ssubstanzen gibt es kaum! Prüfer: Unterschrift: Datum: Approbiert von: Unterschrift: Datum: 9