PLATELIA TM EBV-VCA IgM Tests
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- Sarah Friedrich
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1 PLATELIA TM EBV-VCA IgM Tests ENZYMIMMUNOASSAY FÜR DIE QUALITATIVE BESTIMMUNG VON IgM-ANTIKÖRPERN GEGEN DAS EPSTEIN-BARR-VIRUS (VIRAL CAPSID ANTIGEN) IN HUMANSERUM
2 1- VERWENDUNGSZWECK Dieser Immunoassay ist für die qualitative Bestimmung von IgM-Antikörpern gegen das Viruskapsidantigen des Epstein-Barr-Virus (VCA) in Humanserum vorgesehen. Platelia TM EBV-VCA IgM kann in Verbindung mit anderen Epstein- Barr-Serologietests (Platelia TM EBV-VCA IgG, Platelia TM EB-NA-1 IgG und Platelia TM EBV-EA-D IgG) als Hilfsmittel für die Diagnose einer infektiösen Mononukleose verwendet werden. 2- KLINISCHE BEDEUTUNG Das Epstein-Barr-Virus (EBV) ist ein verbreiteter humaner Erreger, von dem 80% der Erwachsenen in den USA betroffen sind. Seit der Entdeckung des Epstein-Barr-Virus im Jahr 1964 wird EBV mit einer zunehmenden Anzahl an Krankheiten im Zusammenhang gesehen, wie z. B. der infektiösen Mononukleose. EBV wurde auch mit B-Zell-Lymphomen bei Immunsupprimierten, einschließlich Transplantationspatienten und AIDS- Patienten, assoziiert. EBV wird aufgrund seiner charakteristischen Morphologie zur Familie der Herpes-Viren gezählt. Alle Herpesviren haben die Fähigkeit, bei ihrem Wirt zu latenten Infektionen zu führen. Die infektiöse Mononukleose (IM) ist eine akute, selbstlimitierende lymphoproliferative Krankheit, die durch EBV hervorgerufen wird. Obwohl die EBV- Primärinfektion während der Kindheit in der Regel asymptomatisch verläuft, führen die Hälfte bis zwei Drittel der Primärinfektionen bei Jugendlichen und jungen Erwachsenen zu einer offenen klinischen Erkrankung wie die infektiöse Mononukleose mit folgenden Symptomen: fibrige Pharyngitis, Tonsilitis, Lymphadenopathie, Unwohlsein, Kopfschmerzen, Myalgien, Spleno- und Hepatomegalie, Hautausschlag und Leukozytose. Die EBV-Infektion führt zur Produktion von Antikörpern gegen vier verschiedene Komplexe: das EBV-induzierte nukleäre Antigen (EBNA), das EBV-induzierte Early Antigen (EA, frühes Antigen), das Viruskapsidantigen (VCA) und das EBV-induzierte Membranantigen (MA). Der EA-Komplex wird in zwei Komponenten, EA-D (diffuse Komponente) und EA-R ((restricted) begrenzte Komponente), unterteilt. VCA-IgM-Antikörper sind im Frühstadium der Erkrankung nachweisbar. Die Antikörperkonzentration steigt früh an, erreicht nach 3 4 Wochen ihren Höchstwert und sinkt anschließend auf nicht mehr nachweisbare Werte ab. 58
3 3- TESTPRINZIP Die ELISA-Assays (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) beruhen auf der Fähigkeit von biologischen Materialien (d. h. Antigenen), an Kunststoffoberflächen wie z. B. Polystyrol (Festphase) zu adsorbieren. Platelia TM EBV-VCA IgM verwendet die ELISA-Technik, wobei ein affinitätsgereinigtes VCA-Antigen an die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gebunden ist. Wenn die an die Festphase gebundenen Antigene mit dem Patientenserum in Berührung kommen, bindet der antigenspezifische Antikörper, sofern vorhanden, an das Antigen auf der Festphase und bildet Antigen-Antikörper-Komplexe. Die Serumvorbehandlungslösung wird zur Vermeidung von potentiellen, durch IgG und IgM-RF hervorgerufenen Interferenzen verwendet. Überschüssiger Antikörper wird durch einen Waschgang entfernt. Anschließend wird mit Meerrettich-Peroxidase markiertes Anti-Human-IgM- Globulin (Ziege) zugegeben, das an die Antikörper-Antigen-Komplexe bindet. Überschüssiges Konjugat wird durch einen Waschgang entfernt. Danach wird Substrat, Tetramethylbenzidin (TMB), zugegeben. Ist IgMspezifischer Antikörper gegen das Antigen EBV-VCA im Patientenserum vorhanden, entwickelt sich eine blaue Färbung. Nach Stoppen der Enzymreaktion mit 1N H 2 SO 4 verfärbt sich der Inhalt der Vertiefungen gelb. Die Färbung, die proportional zur Antikörperkonzentration im Serum ist, kann mit einem geeigneten Spektrophotometer oder einem ELISA-Mikrotiterplattenleser abgelesen werden. Sensitivität, Spezifität und Reproduzierbarkeit von ELISA-Assays können mit anderen serologischen Tests für Antikörper wie Immunfluoreszenz, Komplementbindung, Hämagglutination und Radioimmunoassays vergleichbar sein. 59
4 4- INHALT DES KITS Alle Reagenzien sind ausschließlich für die in vitro-diagnostik bestimmt. Etikett Art der Reagenzien Darreichungs form R1 Microplate Mikrotiterplatte: 12 Streifen (8 Vertiefungen), beschichtet mit inaktiviertem affinitätsgereinigtem EBV-Viruskapsidantigen(gp125), in einem Folienbeutel mit Trockenmittel /Feuchtigkeitsindikator. 1 R2 R3 R4a R4b Concentrated Washing Solution (20x) Non reactive control Positive Control I Positive Control II Konzentrierte Waschlösung (20 fach): Tris-Puffer (ph 7,2 ± 0,2) mit 1% Tween 20. Konservierungsmittel: ProClin 300 (0,1%). Nicht reaktive Kontrolle (human) für Anti-EBV- VCA IgM-Antikörper, negativ für HBs Ag und HIV-1-, HIV-2- und HCV-Antikörper. Konservierungsmittel: Natriumazid (< 0,1 %) und Pen/Strep (0,01%) Positive Kontrolle I (human) für Anti-EBV-VCA IgM-Antikörper, negativ für HBs Ag und HIV-1-, HIV-2- und HCV-Antikörper. Konservierungsmittel: Natriumazid (< 0,1 %) und Pen/Strep (0,01%) Positive Kontrolle II (human) für Anti-EBV-VCA IgM-Antikörper, negativ für HBs Ag und HIV-1-, HIV-2- und HCV-Antikörper. Konservierungsmittel: Natriumazid (< 0,1 %) und Pen/Strep (0,01%) R5 Calibrator Kalibrator (human) für Anti-EBV-VCA IgM- Antikörper, mit kitspezifischem Faktor auf dem Etikett der Packung aufgedruckt, negativ für HBs Ag und HIV-1-, HIV-2- und HCV-Antikörper. Konservierungsmittel: Natriumazid (< 0,1 %) und Pen/Strep (0,01%) R6 Conjugate Konjugat (gebrauchsfertig): Ziegen-Antikörper gegen Human-IgM, markiert mit Meerrettich- Peroxidase. Konservierungsmittel: ProClin 300 (0,1%) und Gentamycin 1 x 50 ml 1 x 0,4 ml 1 x 0,4 ml 1 x 0,4 ml 1 x 0,4 ml 1 x 16 ml 60
5 Etikett 5- WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN Vorsichtsmassnahmen Art der Reagenzien R7 Diluent II Verdünnungsmittel II: gebrauchsfertiger Puffer (ph 7,5) mit Proteinstabilisatoren, mit Antihuman-IgG (Ziege/Schaf) für die Serumadsorption zur Entfernung von konkurrierendem IgG.Konservierungsmittel: ProClin 300 (0,1%) R9 R10 Chromogen TMB Stopping Solution Darreichungs form 2 x 45 ml Chromogen/Substratlösung (gebrauchsfertig): 1 x 15 ml Tetramethylbenzidin (TMB). Das Reagenz sollte nach der Verwendung wieder verschlossen werden, da sich ansonsten Präzipitat in den Reaktionsvertiefungen bilden kann. Stopplösung (gebrauchsfertig): 1N 1 x 15 ml Schwefelsäure Testarbeitsblatt 1 Die Zuverlässigkeit der Ergebnisse hängt von der Einhaltung folgender GLP-Richtlinien ab: Die Reagenzien nicht über das Verfallsdatum hinaus verwenden. Keine Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen innerhalb einer Messreihe vermischen. ANMERKUNG: Es können Chargen aus unterschiedlichen Kits miteinander verwendet werden, sofern immer die gleiche Charge für eine bestimmte Messreihe verwendet wird: Waschlösung (R2), Chromogen/Substratlösung (R9) und Stopplösung (R10). Diese Reagenzien können mit Platelia TM EBV-VCA IgG, Platelia TM EBV-EA-D IgG und Platelia TM EB-NA-1 IgG unseres Katalogs verwendet werden. Detaillierte Informationen erhalten Sie von unserer Technikabteilung. Vor der Verwendung 30 Minuten warten, damit sich die Reagenzien bei Raumtemperatur stabilisieren. Reagenzien vorsichtig auflösen und jegliche Kontamination vermeiden. Den Test nicht in Gegenwart reaktiver Dämpfe (saure, alkalische, Aldehyd- Dämpfe) oder unter Staubeinwirkung durchführen, durch die die Enzymaktivität des Konjugats beeinträchtigt werden könnte. 61
6 Sorgfältig gewaschene und mit entionisiertem Wasser gespülte Glasgefäße oder vorzugsweise Einwegmaterial verwenden. Die Mikrotiterplatte nach Beendigung des Waschvorgangs und vor dem Pipettieren der Reagenzien nicht trocknen lassen. Die Enzymreaktion weist gegenüber Metallionen eine hohe Sensitivität auf. Daher dürfen Metallelemente nicht mit den verschiedenen Konjugat- und Substratlösungen in Berührung kommen. Die Chromogen/Substratlösung muss farblos sein. Ist eine Verfärbung sichtbar, darf das Reagenz nicht verwendet werden und muss ersetzt werden. Für jede Probe eine neue Pipettenspitze verwenden. Das Waschen der Mikrotiterplatte ist ein wesentlicher Arbeitsgang: Die empfohlene Anzahl an Waschzyklen ist zu beachten, und es ist sicherzustellen, dass alle Vertiefungen vollständig befüllt und anschließend vollständig geleert werden. Nicht korrekt durchgeführte Waschzyklen können zu fehlerhaften Ergebnissen führen. Niemals das gleiche Gefäß zum Pipettieren des Konjugates und der Entwicklungslösung verwenden. Für die Genauigkeit des Tests und einen korrekten Testablauf Pipetten und Zubehör überprüfen. Das Testverfahren darf nicht geändert werden. SICHERHEITSVORSCHRIFTEN Alle Reagenzien sind ausschließlich für die In-vitro-Diagnostik bestimmt. Beim Umgang mit Reagenzien Einweghandschuhe tragen. Nicht mit dem Mund pipettieren. Das Humanmaterial zur Vorbereitung der Reagenzien wurde getestet und als nicht reaktiv für Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBs Ag), Antikörper gegen das Hepatitis-C-Virus (anti-hcv) und gegen das humane Immundefizienz-Virus (anti-hiv1 und anti-hiv2) befunden. Da keine Testmethode eine potentielle Infektionsgefahr mit absoluter Sicherheit ausschließen kann, müssen alle Reagenzien, die Humanmaterial enthalten, und Patientenproben als potentiell infektiös behandelt werden. Alle Materialien, die mit Proben und Reagenzien, die Humanmaterial enthalten, in Berührung kommen, einschließlich der Waschlösung, sollten als infektiös betrachtet werden. 62
7 Verschütten von Proben oder probenhaltigen Lösungen vermeiden. Verschüttete Proben müssen mit auf 10% verdünnter Natriumhypochlorit - lösung gespült werden. Wenn es sich bei der Flüssigkeit um eine Säure handelt, muss die verschüttete Menge zunächst mit Natriumbicarbonat neutralisiert und anschließend mit Natriumhypochloritlösung gereinigt und mit Papiertüchern getrocknet werden. Das für die Reinigung verwendete Material ist in einem Behälter für Sondermüll zu geben. Proben, Reagenzien, die Humanmaterial enthalten, sowie kontaminierte Materialien und Produkte sollten nach einer Dekontaminierung entsorgt werden, und zwar - entweder durch Eintauchen in Natriumhypochloritlösung mit einer Natriumhypochlorit-Endkonzentration von 5% für die Dauer von 30 Minuten. - oder durch Autoklavieren bei 121 C für mindestens 2 Stunden. Mindestens halbstündiges Autoklavieren bei 121 C ist die beste Methode zum Inaktivieren von HIV- und HBV-Viren. VORSICHT: NATRIUMHYPOCHLORITHALTIGE LÖSUNGEN NICHT IN DEN AUTOKLAVEN STELLEN. Chemikalien müssen gemäß den GLP-Richtlinien gehandhabt und entsorgt werden. Substratpuffer, Chromogen und Stopplösung nicht mit der Haut oder den Schleimhäuten in Berührung bringen (giftig, reizend und kann Verbren - nungen verursachen). Ein Sicherheitsdatenblatt ist auf Anfrage erhältlich. Vorsicht: Einige Reagenzien enthalten < 1,5% ProClin TM 300. Xi - Reizend R43: Sensibilisierung durch Hautkontakt möglich. S28-37: Bei Berührung mit der Haut sofort mit viel Wasser und Seife abwaschen. Geeignete Schutzhandschuhe tragen. 63
8 6- ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL Vortex. Mikrotiterplatten-Lesegerät, ausgestattet mit 450 nm-filtern (*). Behälter für infektiösen Abfall. Natriumhypochlorit und Natriumbicarbonat. Destilliertes oder entionisiertes Wasser. Zylinder mit Maßeinteilung. Einweg-Latexhandschuhe. Schutzbrille. Saugfähige Papiertücher. Automatische oder halbautomatische, einstellbare oder voreingestellte Pipetten oder Multipipetten zum Abmessen und Pipettieren von 10, 100, und 1000 µl. Manuelles, halbautomatisches oder automatisches Mikrotiterplatten- Waschgerät (*). Einwegröhrchen. (*) Weitere Informationen zu den von unserer Technikabteilung empfohlenen Geräten erhalten Sie direkt bei uns. 7- REKONSTITUTION UND LAGERUNG DER REAGENZIEN Der Kit kann bei +2-8 C bis zu dem auf der Packung angegebenen Verfalls - datum gelagert werden, sofern nicht anders vorgeschrieben. Die Reagenzien vor der Verwendung auf Raumtemperatur ( C) bringen. Alle Reagenzien nach der Verwendung sofort wieder in den Kühlschrank stellen. 1) Gebrauchsfertige Reagenzien Reagenz 1 (R1): Mikrotiterplatte Jede Blotwanne mit 12 Teststreifen ist in einem versiegelten Folienbeutel verpackt. Den Beutel mit einer Schere oder einem Skalpell 0,5-1 cm über der Linie abschneiden. Unbenutzte Streifen unverzüglich zurück in die Verpackung stecken. Den Beutel sorgfältig verschließen und bei +2-8 C lagern. Auf diese Weise sind die Streifen bis zu einem Monat haltbar. Reagenz 3 (R3): nicht reaktive Kontrolle Reagenz 4a (R4a): positive Kontrolle I Reagenz 4b (R4b): positive Kontrolle II 64
9 Reagenz 5 (R5): Kalibrator Reagenz 6 (R6): Konjugat Reagenz 7 (R7): Verdünnungsmittel II Reagenz 9 (R9): Chromogen/Substratlösung Reagenz 10 (R10): Stopplösung 2) Aufzulösende Reagenzien Reagenz 2 (R2): Konzentrierte Waschlösung (20fach) 50 ml der 20fach konzentrierten Waschlösung auf 1,0 l mit destilliertem bzw. entionisiertem Wasser verdünnen, um eine gebrauchsfertige Lösung zu erhalten. Gründlich mischen. Nach der Verdünnung ist die Lösung bei +2-8 C 5 Tage haltbar. 8- PROBEN Die Entnahme der Blutprobe erfolgt gemäß der üblichen Vorgehensweise. Der Test wird mit unverdünnten Proben durchgeführt. Das Serum vom Blutkuchen bzw. den Erythrozyten so schnell wie möglich trennen, um eine Hämolyse zu vermeiden. Eine starke Hämolyse kann die Testleistung beeinträchtigen. Proben, die Gerinnsel enthalten, müssen vor dem Test durch Zentrifugation geklärt werden. Aufgeschwemmte Fibrinaggregate oder -partikel können zu falsch positiven Ergebnissen führen. Die Proben sollten bei +2-8 C gelagert werden, sofern die Analyse innerhalb von 5 Tagen erfolgt, andernfalls können sie tiefgeforen bei -20 C über mehrere Monate aufbewahrt werden. Wiederholtes Einfrieren/Auftauen vermeiden. Zum Transport sind die Proben gemäß den Bestimmungen für den Transport infektiöser Stoffe zu verpacken. KEINE KONTAMINIERTEN, HYPERLIPÄMISCHEN, IKTERISCHEN, HYPERHÄMOLYTISCHEN ODER HITZEINAKTIVIERTEN SEREN VERWENDEN. 9- TESTVERFAHREN Bitte das Testverfahren strikt befolgen. Verwenden Sie zur Validierierung der Testergebnisse für jede Messreihe den Kalibrator und die Kontrollen. Halten Sie sich an die folgenden GLP-Richtlinien: 1. Probenverteilung und Identifikationsplan sorgfältig festlegen. 65
10 2. Die verdünnte Waschlösung (R2) vorbereiten (siehe Abschnitt 7). 3. Die Blotwanne und die Streifen (R1) aus der Schutzpackung nehmen. Die erwünschte Anzahl an Antigen-beschichteten Streifen in einen Mikrotiter- Rahmen stellen. 1 Vertiefung wird für den Reagenz-Leerwert, 3 Vertiefungen für den Kalibrator, jeweils 1 Vertiefung für die negative Kontrolle, die positive Kontrolle I und die positive Kontrolle II benötigt. A B C D E F G H 1 B1 R3 R4a R4b R5 R5 R5 S1 2 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S Alle Proben und Kontrollen sowie der Kalibrator müssen vor der Verwendung auf dem Vortex gemischt werden. Die Testproben, den Kalibrator sowie die negative und die positiven Kontrollen im Verhältnis 1:81 (z. B. 10 µl µl) mit Verdünnungsmittel II (R7) in den Verdünnungsröhrchen oder der Verdünnungsplatte verdünnen µl des verdünnten Kalibrators, der Kontrolle bzw. der Patientenprobe in eine Vertiefung geben. 100 µl Probenverdünnungsmittel II (R7) in die erste Vertiefung für den Reagenzleerwert pipettieren. 6. Die Mikrotiterplatte 30 Minuten ± 2 Minuten bei Raumtemperatur (21-25 C) inkubieren. 7. Den Inhalt aller Vertiefungen in einen Behälter für infektiöse Abfälle (mit Natriumhypochlorit) absaugen. Unverzüglich mindestens 300 µl Waschlösung in jede Vertiefung geben. Anschließend Rückstände absaugen. Dieses Verfahren mindestens viermal wiederholen (d. h. der Waschgang wird insgesamt mindestens fünfmal wiederholt). Falls erforderlich, die Platte umdrehen und auf einem Papiertuch abtrocknen. Wird eine automatische Waschvorrichtung benutzt, ist die Vorgehensweise die gleiche. 66
11 µl des gebrauchsfertigen Konjugats (R6) in alle Vertiefungen geben Minuten ± 2 Minuten bei Raumtemperatur (21-25 C) inkubieren. 10. Den Inhalt aller Vertiefungen absaugen und wie oben beschrieben fünfmal waschen µl Chromogen/Substratlösung (R9) schnell in alle Vertiefungen pipettieren. 12. Für die Entwicklung der Reaktion die Platte lichtgeschützt bei Raumtemperatur (21-25 C) 10 ± 2 Minuten stehen lassen. Während dieser Inkubation keine Klebefolie verwenden. Die Chromogen/Substratlösung wird sich in den Vertiefungen mit nachweisbaren IgM-Antikörper - konzentrationen blau färben µl Stopplösung (R10) in jede Vertiefung geben. Den Inhalt durch vorsichtiges Klopfen auf die Platte mischen. Durch Zugabe der Stopplösung (R10) kommt es zu einer Farbänderung von blau in gelb. 14. Mindestens 5 Minuten warten und anschließend die Ergebnisse ablesen. Den Boden der Platte sorgfältig abwischen. Bei einer Wellenlänge von 450 nm den Leser über der Vertiefung für den Reagenzleerwert auf null stellen und die optische Dichte jeder Vertiefung messen. Die Platte sollte innerhalb von 30 Minuten nach Stoppen der Reaktion abgelesen werden (die Streifen müssen vor dem Ablesen stets lichtgeschützt aufbewahrt werden). 15. Alle Ergebnisse hinsichtlich der Übereinstimmung zwischen den Werten sowie gegen die Platten- und Probenverteilung und den Identifikationsplan prüfen. 10- BERECHNUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE 1) Berechnung der mittleren Extinktion 1. Mittlere OD (optische Dichte) des Grenzwert-Kalibrators Die mittlere OD des Grenzwert-Kalibrators aus den drei Bestimmungen des Kalibrators (R5) berechnen. Weicht einer der drei Kalibratorwerte mehr als 15% vom Mittelwert ab, wird der Wert verworfen und der Mittelwert aus den übrigen beiden Werten berechnet. 2. Korrekturfaktor Um Schwankungen der Assayaktivität zwischen den Tagen aufgrund der Raumtemperatur oder der Testzeiten zu berücksichtigen, wird für jede Kitcharge ein Korrekturfaktor bestimmt. Der Korrekturfaktor ist auf dem Fläschchenetikett aufgedruckt. 67
12 3. Wert des Grenzwert-Kalibrators Der Wert des Grenzwert-Kalibrators für jeden Assay wird durch Multiplikation des Korrekturfaktors mit der in Schritt 1 bestimmten mittleren OD des Grenzwert-Kalibrators bestimmt. 4. ISV-Wert Ein Immunstatusverhältnis (ISV) für jede Probe wird durch Division der Proben-OD durch den in Schritt 3 bestimmten Wert des Grenzwert-Kalibrators berechnet. Beispiel : ODs der Kalibratoren (R5) = 0.380, 0.400, Mittlere OD der Kalibratoren (R5) = Korrekturfaktor = 0.5 Wert des Grenzwert-Kalibrators = 0.5 x = OD der Patientenseren = ISV-Wert = 0.600/0.200 = ) Validierung des Assays 1. Reagenzleerwert (wenn gegen die Luft abgelesen) muss < 0,150 bei 450 nm sein: OD (RB) < 0, Die negative Kontrolle (R3) muss 0,250 bei 450 nm sein (wenn gegen Reagenzleerwert abgelesen): OD (R3) 0, Jeder Kalibrator (R5) muss 0,250 bei 450 nm sein (wenn gegen Reagenzleerwert abgelesen): OD (R5) 0, Die positive Kontrolle (R4b) muss 0,500 bei 450 nm sein (wenn gegen Reagenzleerwert abgelesen): OD R4b 0, Die ISV-Werte (Immunstatusverhältnis) für die negative Kontrolle, die positive Kontrolle I und die positive Kontrolle II (R3, R4a, R4b) sollten innerhalb der jeweiligen, auf den Fläschchen aufgedruckten Bereiche liegen. Liegen diese Werte nicht innerhalb ihrer Bereiche, sollte der Test als ungültig betrachtet und wiederholt werden. 68
13 3) Interpretation der Ergebnisse Die ISV-Werte der Patienten werden wie folgt interpretiert: ISV-Wert Ergebnisse Interpretation 0.90 Negativ Keine signifikante Konzentration an nachweisbarem EBV-VCA IgM-Antikörper Nicht eindeutig Die Proben sollten erneut getestet werden Positiv Signifikante Konzentration an nachweisbarem EBV-VCA IgM-Antikörper. Anzeichen für eine akute oder zurückliegende Infektion. 1. Folgende Methode wird zur Weiterleitung der Ergebnisse empfohlen: "Folgende Ergebnisse wurden mit Platelia TM EBV-VCA IgM erzielt. Die mit unterschiedlichen Methoden erzielten Werte können nicht ausgetauscht werden. Die Höhe der berichteten IgM-Konzentration kann nicht mit einem Endpunkttiter korreliert werden". 2. Eine genaue Interpretation der EBV-Infektion basiert auf den Ergebnissen der vier verschiedenen EBV-Antikörper, die für ein aussagekräftiges Bild einer EBV-Infektion verwendet werden sollten: das EBV-induzierte nukleäre Antigen (EB-NA), das EBV-induzierte Early Antigen (EBV-EA, frühes Antigen) sowie IgG und IgM des Viruskapsidantigens (EBV-VCA). Eine genaue Interpretation der EBV-Infektion basiert auf den Ergebnissen all dieser Antikörper, und die Diagnose sollte in der Regel nicht auf einem einzigen Testergebnis beruhen. 3. Wiederholt nicht eindeutige Proben sollten mit einer anderen Methode, z. B. Immunfluorezenz (IF), erneut getestet werden. Sind die Ergebnisse nach weiterem Testen immer noch nicht eindeutig, sollte eine zusätzliche Probe entnommen werden. 4) Erwartete Werte Akute Phase Die Konzentration an EBV-VCA IgM steigt in der frühen akuten Phase der Erkrankung rasch an und ist vor oder mit den EBV-VCA IgG- und EB-NA-1 IgM-Antikörpern und den heterophilen Antikörpern nachweisbar. Die Konzentration an EBV-VCA IgM nimmt während der frühen Phase der Erkrankung zusammen mit den EB-NA-1 IgM-Antikörpern ab, während EBV-VCA IgG-Antikörper persistieren. 69
14 Übergangsphase Die Konzentration an EBV-VCA IgM-Antikörpern geht auf niedrige Werte zurück, die etwa denen der daraufhin zunehmenden EB-NA-1 IgG- Antikörper entsprechen. EBV-VCA IgG-Antikörper persistieren. Konvaleszente Phase Die EBV-VCA IgM-Antikörperkonzentration ist sehr niedrig bis negativ bei steigender Konzentration an EB-NA-1 IgG-Antikörpern. 5) Prävalenz Eine Gruppe von 158 Seren einer normalen Population unterschiedlichen Alters, Geschlechts und aus verschiedenen Regionen der USA wurde mit Platelia TM EBV-VCA IgM getestet. Die Rate positiver Ergebnisse mit Platelia TM EBV-VCA IgM lag bei 2,5%, die Rate nicht eindeutiger Ergebnisse bei 1,9%. Die Verteilung der ISV-Werte dieser Studie ist in folgender Tabelle dargestellt. Verteilung der ISV-Werte in einer normalen Population (n = 158) [0-0,11[ [0,11-0,21[ [0,21-0,3[ [0,3-0,41[ [0,41-0,51[ [0,51-0,61[ [0,61-0,71[ [0,71-0,81[ [0,81-0,91[ [0,91-1,09[ [1,09-1,3[ [1,3-1,6[ [1,6-1,9[ [1,9-2,5[ [2,5-3[ ISR 70
15 In der folgenden Tabelle ist die gesunde Population nach Altersgruppen unterteilt: Alter Negativ Nicht eindeutig Positiv Gesamt Gesamt ) Grenzen des Verfahrens 1. Andere Verfahren oder Techniken als die in dieser Packungsbeilage beschriebenen können zu falschen Ergebnissen führen. Nicht wiederholbare Reaktionen haben häufig folgende Ursachen: - nicht korrekt durchgeführte Waschgänge der Mikrotiterplatten, - falsche Inkubationszeiten, - Kontamination negativer Proben durch Serum oder Plasma mit hoher Antikörperkonzentration, - Kontamination der Entwicklungslösung durch Oxidationsmittel (Bleiche, Metallionen...), - Kontamination der Stopplösung. Kontaminierte, ikterische, lipämische, hämolytische oder hitzeinaktivierte Seren können zu falschen Ergebnissen führen und sollten nicht verwendet werden. Die Leistungsmerkmale wurden lediglich für Serum evaluiert. 2. Der Arzt sollte die Testergebnisse im Zusammenhang mit klinischen Befunden und anderen Diagnostikverfahren interpretieren. Dieser Test ist für die Bestimmung der Immunantwort als Hinweis auf eine Primärinfektion oder eine Virusreaktivierung vorgesehen. Die Leistungsmerkmale wurden nicht für Patienten mit Nasopharyngeal - karzinom, Burkitt-Lymphom, anderen mit EBV assoziierten Lymphadenopathien und weiteren, mit EBV assoziierten Erkrankungen sowie mit EBV assoziierter Mononukleose bestimmt. Die Ergebnisse von mit Platelia TM EBV-VCA IgM getestetem Serum von immunsupprimierten Patienten müssen unter Vorbehalt interpretiert werden. 71
16 Die Leistungsmerkmale dieses Assays wurden nicht mit pädiatrischen Proben bestimmt. Eine nicht nachweisbare EBV-VCA IgM-Antikörperkonzentration schließt nicht die Möglichkeit einer vorliegenden oder zurückliegenden Infektion aus. Die Probe kann entnommen worden sein, bevor sich nachweisbare Antikörper entwickelt haben oder nachdem die Antikörper nachweisbar waren. Bei Verdacht auf eine EBV-Infektion sollte eine zweite Serumprobe 5 bis 7 Tage nach der ersten Probe entnommen und getestet werden. Dennoch liegen IgM-Antikörper bei der Blutentnahme häufig bereits in abnehmenden Konzentrationen vor. Spezifische IgG-Antikörper können mit IgM-Antikörpern um die Bindungsstellen konkurrieren und zu falsch negativen Ergebnissen führen. Umgekehrt kann Rheumafaktor in Anwesenheit von spezifischem IgG zu falsch positiven Reaktionen führen. Der Anti-human IgG-Antikörper (Ziege/Schaf) im Serumverdün nungsmittel Plus reduziert das konkurrierende spezifische IgG und setzt die Interferenzen durch Rheumafaktor in den Proben auf ein Minimum herab. Es wurde erwiesen, dass einige anti-nukleäre Antikörper zu falsch positiven Reaktionen mit manchen ELISA-Tests führen. 11- LEISTUNGSMERKMALE 1 - Relative Sensitivität und Spezifität auf der Basis einer Serumcharakterisierung 166 ausgewählte Proben wurden in einem klinischen Labor getestet. Das Serum der Studie wurde als seronegativ (kein serologisches Anzeichen für eine vorhandene oder zurückliegende EBV-Infektion), akut (EBV-VCA IgM- und heterophile Antikörper vorhanden, EB-NA IgG nicht vorhanden) oder seropositiv (Vorliegen von EBV-VCA IgG- und EB-NA IgG-Antikörpern, kein Anzeichen von EBV-VCA IgM- oder heterophhilen Antikörpern, die ein Hinweis auf eine zurückliegende Infektion wären) charakterisiert. Die für die Serumcharakterisierung verwendeten Assays waren im Handel erhältliche ELISA-Assays. Die Sensitivität, Spezifität und die Übereinstimmung des Assays wurden auf der Basis dieser Charakterisierung bestimmt. Es wurde angenommen, dass die Antwort auf EBV-VCA IgM-Antikörper bei seronegativem und konvaleszentem Serum negativ und bei akutem Serum positiv sein sollte. 72
17 Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst. Platelia TM EBV-VCA IgM Positiv Nicht eindeutig Negativ Gesamt Akut EBV-VCA IgM + EB-NA IgG - Heterophile A Seropositiv EBV-VCA IgG + EB-NA IgG + EBV-VCA IgM - Heterophile A Seronegativ EBV-VCA IgG - EB-NA IgG - EBV-VCA IgM - Heterophile A Relative Sensitivität (akut) = 37/38 = 97,4% 95 % Konfidenzintervall = 92,2% - 100% Relative Spezifität (seronegativ) = 27/28 = 96,4% 95 % Konfidenzintervall = 89,4% - 100% Relative Spezifität (seropositiv) = 98/99 = 99,0% 95 % Konfidenzintervall = 97,0% - 100% Relative Übereinstimmung = 162/165 = 98,2% 95 % Konfidenzintervall = 96,1% - 100% Nicht eindeutige Ergebnisse wurden von den Berechnungen ausgeschlossen. Nicht eindeutige Ergebnisse wurden nicht erneut getestet. Sie wurden als nicht eindeutig weitergeleitet. Die 95%-Konfidenzintervalle wurden mit der normalen Methode berechnet. Bitte beachten Sie, dass sich "relativ" auf den Vergleich dieser Testergebnisse mit den Ergebnissen eines ähnlichen Tests beziehen. Es wurde kein Versuch unternommen, die Ergebnisse dieses Assays mit einer vorliegenden oder fehlenden Erkrankung in Zusammenhang zu setzen. Die Genauigkeit, eine Erkrankung vorherzusagen, kann aufgrund des Testvergleiches nicht beurteilt werden. 73
18 2 Wiederholbarkeit (Intraassay-Präzision) Die Präzision von Platelia TM EBV-VCA IgM wurde durch die Analyse von drei Seren in Zehnfachbestimmung auf der gleichen Mikrotiterplatte bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst. Serum n X S.A. VK% Negativ Schwach positiv Positiv X = Mittleres ISV S.A. = Standardabweichung VK = Variationskoeffizient 3 Wiederholbarkeit (Interassay-Präzision) Die Präzision von Platelia TM EBV-VCA IgM wurde durch die Analyse von drei Seren in Zehnfachbestimmung an drei verschiedenen Tagen bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst. Serum n X S.A. VK% Negativ 30 0, ,6 Schwach positiv 30 1, ,1 Positiv 30 4, ,6 4 - Kreuzreaktivität Es wurden Seren mit IgM-Antikörperkonzentrationen, die mit ELISA-Assays für Herpes Simplex Virus I & II, Zytomegalievirus und Varicella-Zoster-Virus nachweisbar waren, getestet. Darüber hinaus wurden Seren mit Rheumafaktor (RF) getestet. Alle anderen Assays waren im Handel erhältliche ELISA-Assays.Die in der Tabelle zusammengefassten Daten zeigen, dass Herpesvirus-Antikörper und Seren mit RF keine Kreuzreaktivität mit Platelia TM EBV-VCA IgM aufweisen. 74
19 Kreuzreaktivitätsstudie mit Platelia TM EBV-VCA IgM 12- LITERATUR Spezifität Platelia TM EBV-VCA IgM Alternativer Assay RF+ RF+ RF+ RF+ RF+ VZV IgM+ VZV IgM+ VZV IgM+ VZV IgM+ VZV IgM+ HSV 1 IgM+ HSV 1 IgM+ HSV 1 IgM+ HSV 1 IgM+ HSV 2 IgM+ HSV 2 IgM+ HSV 2 IgM+ HSV 2 IgM+ CMV IgM+ CMV IgM+ CMV IgM+ CMV IgM+ 1. Siehe Englische Version
20 12- BIBLIOGRAPHY 1. Epstein, M.A., B.B. Achong, and Y.M. Barr Virus Particles in Cultured Lymphoblasts from Burkitt s Lymphoma. Lancet. 1: Epstein, M.A., Y.M. Barr, and B.G Achong Studies wilth Burkitt s Lymphoma. Wister Inst. Sympos. Monogr. 4: Schooley, R.T. and R. Dolin Epstein-Barr Virus (Infectious Mono-nucleosis), 2nd edition. In: Principles and Practices of Infectious Diseases. Mandell, G.L., R.G.Douglas, and J.E. Bennett, eds. John Wiley and Sons, New York. Pp Henle, W. and Henle G. Epstein-Barr Virus and Infectious Mononucleosis. Human Herpesvirus Infections. Glaser and Gottlieb-Stematsky, eds. Marcel Dekker, Inc. NR. Basel Tobi, M. and S.E. Straus Chronic Epstein-Barr Virus Diseas: A Workshop Held by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Ann. Intern. Med. 103 (6(pt. 1)): Birx, D. L., R.R. Redfield, and G. Tosarto Defective Regulation of Epstein-Barr Virus Infection in Patients with Aquired Immunodefiency Syndrome (AIDS) or AIDS- Related Disorders. New Eng. J. Med. 314 (14): Gottlieb-Sematsky, T. and Glaser, R Assocation of Epstein-Barr Virus with Neurological Diseases. Human Herpesvirus Infections. Glaser and Gottlieb-Sematsky, eds. Marcel Dekker, Inc., NR. Basel. 8. Henle, G., W. Henle and V. Diehl Relation of Burkitt s Tumor-Associated Herpes-Type Virus to Infectious Mononucleosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 59: Henle G., and W. Henle The Virus as the Etiologic Agent of Infectious Mononucleosis. In: The Epstein-Barr Virus. Berlin Sprihger-Verlag. Pp Sumaya, C.V Infectious Mononucleosis and Other EBV Infections: Diagnostic Factors. Lab. Mgmt. Oct., pp Lenelle, E.T. and W. Henle Epstein-Barr Virus Infections: Clinical and Serological Features. Laboratory Mgmt. Oct., pp Nikoskelainen, J. and P. Hanninen Antibody Response to Epstein-Barr Virus in Infectious Mononucleosis. Infect. Immun. 11: Sumaya, C.V Infectious Mononucleosis and other EBV Infections: Diagnostic Factors. Laboratory Management. pp Henle, W. and G. Henle Epstein-Barr Virus and Infectious Mononucleosis. New Eng. J. Med. 228: Engvall, E. and P. Perlman Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA. III. Quantitation of Specific Antibodies by Enzyme-Labeled Anti-Immunoglobulins in Antigen Coated Tubes. J. Immunol. 109:
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22 12- LITTERATURLISTE 1. Se den engelsk version. TRINITY BIOTECH, Jamestown - NY USA TRINITY BIOTECH, Bray, Co. Wicklow - IRELAND Distributed by: Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) Fax.: +33 (0) /2008
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