PLATELIA CANDIDA AB/AC/AK 96 TESTS 62799

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1 PLATELIA CANDIDA AB/AC/AK 96 TESTS PLATELIA CANDIDA AB/AC/AK IST EIN INDIREKTER IMMUNENZYMATISCHER MIKROTITERPLATTEN- ASSAY FÜR DEN QUANTITATIVEN NACHWEIS VON CANDIDA-ANTI-MANNAN-ANTIKÖRPER IN SERUM.

2 1- VERWENDUNGSZWECK Platelia Candida Ab/Ac/Ak ist ein indirekter immunenzymatischer Mikrotiterplatten-Assay für den quantitativen Nachweis von Candida-Anti-Mannan- Antikörper in Serumproben. 2- VERWENDUNGSHINWEIS Die Diagnose einer invasiven Candidiasis muss auf der Kombination dieses Mannan-Antikörper-Tests mit einem Test für das zirkulierende Mannan- Antigen (Platelia Candida Ag, Best.-Nr ) basieren. Durch die Kombination dieser beiden Tests kann eine Diagnose früher gestellt und die Sensitivität der Diagnose als Teil einer vollständigen Diagnose mit klinischen und mykologischen Daten und einer Evaluierung intrinsischer und iatrogener Risikofaktoren verbessert werden. 13 Die Kombination der Tests ist auch ein integraler Bestandteil der klinischen und der Laborüberwachung des Patienten als Hilfsmittel für Entscheidungen über die Behandlung. 3- ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG DES TESTS Candida -Infektionen sind die häufigste Form von Nosokomialpilzinfektionen. 1 Invasive Formen stellen die ernsthaftesten Infektionen mit Mortalitätsraten zwischen 30% und 70% bei Menschen mit geschwächtem Immunsystem dar. 12 Obwohl auf diesem Gebiet in letzter Zeit beträchtliche Fortschritte erzielt wurden, können invasive Candida-Infektionen aufgrund der geringen Spezifität der klinischen Symptome und der niedrigen Sensitivität von Kulturen nur schwierig diagnostiziert werden. Die Diagnose einer invasiven Candidiasis und eine Einleitung einer entsprechenden Behandlung basieren in der Regel auf einer Betrachtung der klinischen und mykologischen Ergebnisse sowie der Risikofaktoren. 8 In diesem Zusammenhang ist die Labordiagnose von besonderer Bedeutung. Die serologische Überwachung der Candida- Antikörper ist für die Erstellung bzw. Bestätigung der klinischen Diagnose zusätzlich zu mykologischen Ergebnissen ein nützliches Hilfsmittel. Mit Platelia Candida Ab/Ac/Ak werden Antikörper gegen das Candida- Mannan-Antigen, dem Hauptbestandteil der Hefezellmembran des Genus Candida, nachgewiesen. 2 Mannan, ein Candidiase-Marker 3,4, ist ein hoch immungenetisches Polysaccarid TESTPRINZIP Platelia Candida Ab/Ac/Ak ist ein indirekter immunenzymatischer Zwei- Phasen-Mikrotiterplatten-Assay zum quantitativen Nachweis von Anti- Mannan-Antikörpern in Humanserum. 50

3 Komponente Inhalt Menge R1 Microwell Strip Plate Mikrotiterplatte : - 96 Vertiefungen (12 Streifen mit jeweils 8 Vertiefungen), beschichtet mit gereinigtem C. albicans-mannan-antigen 1 Platte / 12 x 8 puits R2 R3 Die verdünnten Serumproben werden in die mit gereinigtem C. albicans- Mannan-Antigen beschichteten Vertiefungen gegeben und inkubiert. Die Teststreifen werden gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen. Das Konjugat wird in die Vertiefungen gegeben und inkubiert. Ein Komplex aus Mannan, humanem Anti-Mannan-Antikörper und mit Peroxidase markiertem Anti-Human-Ig-Ziegenantikörper wird in Anwesenheit von Anti-Mannan- Antikörper gebildet. Die Teststreifen werden gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen. Anschließend wird die Substratlösung zugegeben, die mit den an die Vertiefungen gebundenen Komplexen reagiert. Eine blaue Farbreaktion entsteht. Die Enzymreaktion wird durch Zugabe von Säure gestoppt, so dass die Farbe von blau in gelb wechselt. Die Extinktion (optische Dichte) der Proben, Kontrollen und Bereichspunkte wird mit Hilfe eines Spektrophotometers bei einer Wellenlänge von 450 und 620 nm bestimmt. 5- REAGENZIEN Platelia Candida Ab/Ac/Ak: Produkt Nr (96 Tests) Lagerung des Kits bei +2-8 C. Alle Reagenzien vor der Verwendung auf Raumtemperatur ( C) bringen. Alle Reagenzien nach der Verwendung sofort wieder bei +2-8 C aufbewahren. Unbenutzte Streifen/Platten unverzüglich zurück in den Beutel geben und wieder verschließen. Das Trockenmittel nicht entnehmen. Die Streifen sollten innerhalb von 5 Wochen nach dem Öffnen und Wiederverschließen des Beutels verwendet werden. Nach der Verdünnung ist die Arbeitswaschlösung bei einer Lagerung bei +2-8 C bis zu 14 Tage haltbar. Alle anderen Reagenzien sind nach dem Öffnen bis zum Verfallsdatum haltbar. Die mitgelieferten Reagenzien reichen aus für 96 Tests in maximal 6 Testreihen. Concentrated Washing Solution (10x) Negative Control Serum Konzentrierte Waschlösung (10x) : - Tris NaCl-Puffer (ph 7,4) - 1% Tween 20 - Konservierungsmittel: 0,01% Thiomersal Negative Kontrollserum : - Humanserum, negativ für Anti-Mannan- Antikörper - Als negativ für Anti-HIV1-, Anti-HIV2- und Anti-HCV-Antikörper sowie HBs-Antigen getestet - Konservierungsmittel: < 0,1% Natriumaz 1 x 100 ml 1 x 0,250 ml 51

4 Composant Contenu Quantité R4 Calibrator Serum Kalibratorserum : - Lösung mit humanen Anti-Mannan-Antikörper aus einem als negativ für Anti-HIV1-, Anti- HIV2- und Anti-HCV-Antikörper sowie HBs- Antigen getesteten Serum, zur Verwendung für die Erstellung der Bereichspunkte (siehe 10. Testverfahren ) - Konservierungsmittel: < 0,1% Natriumazid 1 x 0,250 ml R5 Positive Control Serum Positive Kontrollserum : - Humanserum mit Anti-Mannan-Antikörper - Als negativ für Antikörper gegen HIV-1, HIV-2 und HCV sowie HBs-Antigen getestet - Konservierungsmittel: < 0,1% Natriumazid R6 Conjugate Konjugat (gebrauchsfertig) : - Anti-Human-Ig-Ziegenantikörper/Peroxidase markiert - Konservierungsmittel: 0,01% Thiomersal R7 R8 R9 R10 Sample Diluent TMB Substrate Buffer Chromogen: TMB Solution Stopping Solution Beispielverdünnungsmittel (gebrauchsfertig): - Konservierungsmittel: 0,01% Thiomersal TMB Substratpuffer (gebrauchsfertig) : - Zitronensäure und Natriumacetatlösung ph 5,2-0,009% Wasserstoffperoxid - 4% Dimethylsulfoxid (DMSO) Chromogen TMB-Lösung (konzentriert) : - 90% Dimethylsulfoxid (DMSO)-Lösung mit 0,6% Tetra-methylbenzidin (TMB)* Stopplösung (gebrauchsfertig) : - 1,5 N Schwefelsäure (H 2 SO 4 ) Plate sealers Klebefolien : - Klebestreifen für Mikrotiterplatten 1 x 0,250 ml 1 x 12 ml 2 x 100 ml 1 x 60 ml 1 x 1 ml 1 x 12 ml 1 x 4 Streifen * Hinweis: TMB (Tetramethylbenzidin) ist ein nicht-karzinogenes und nichtmutagenes Chromogen für Peroxidase. 52

5 6- WARNHINWEISE FÜR BENUTZER 1. In-vitro-Diagnostikum. 2. Nur zur Verwendung durch Fachpersonal. 3. Dieser Testkit sollte nur mit Humanserumproben verwendet werden. 4. Das Humanmaterial zur Herstellung der Reagenzien wurde getestet und in zugelassenen französischen Tests als negativ für Antikörper gegen HIV-1, HIV-2 und HCV sowie HBs-Antigen befunden. Da mit keiner Testmethode mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden kann, dass infektiöse Erreger vorhanden sind, müssen alle Reagenzien mit Humanmaterial und Patientenproben als potentiell infektiös angesehen und mit entsprechender Sorgfalt behandelt werden. 5. Beim Umgang mit Reagenzien und Patientenproben geeignete Schutzkleidung und Einweghandschuhe tragen. Nach der Durchführung des Tests gründlich die Hände waschen. 6. Nicht mit dem Mund pipettieren. 7. In Bereichen, in denen mit Proben und Reagenzien gearbeitet wird, nicht rauchen, trinken oder essen. 8. Verschütten von Proben oder probenhaltigen Lösungen vermeiden. 9. Nicht-säurehaltige verschüttete Flüssigkeiten biologischen Ursprungs müssen sorgfältig mit einem effizienten Desinfektionsmittel abgewischt werden. Als Desinfektionsmittel kann eine Lösung aus 10%iger Bleiche (0,5% Natriumhypochlorit-lösung), 70% Ethanol oder 0,5% Wescodyne verwendet werden. Verschüttete Säure muss mit Papiertüchern abgewischt oder mit Natriumbicarbonat neutralisiert und mit einem chemischen Desinfektionsmittel gereinigt werden. Das zum Reinigen verwendete Material muss in einem Behälter für infektiösen Abfall entsorgt werden. VORSICHT: Natriumhypochlorithaltige Lösungen nicht in den Autoklaven stellen. 10. Alle Proben und Materialien, die für die Durchführung des Tests verwendet wurden, müssen als potentiell infektiös behandelt werden. Die Abfälle müssen entsprechend den geltenden Bestimmungen entsorgt werden. 11. Einige Reagenzien enthalten Natriumazid als Konservierungsmittel. Natriumazid kann zur Bildung von Blei- oder Kupferaziden in Rohrleitungen führen. Solche Azide können explosiv sein. Um die Azidbildung zu vermeiden, Leitungen mit reichlich Wasser nachspülen, wenn die azidhaltigen Lösungen nach Inaktivierung über den Abfluss entsorgt werden. 53

6 12. VORSICHT : Schwefelsäure (H 2 SO 4 ) 1,5 N und DMSO (Dimethylsulfoxid) 90% R36/38: Reizt die Augen und die Haut. Xi-reizend S: : Darf nicht in die Hände von Kindern gelangen. Bei Berührung mit den Augen sofort gründlich mit Wasser abspülen und Arzt konsultieren. Niemals Wasser hinzugießen. 13. Jeglicher Kontakt des Substratpuffers, des Chromogens und der Stopplösung mit den Augen, der Haut und den Schleimhäuten ist zu vermeiden (Vergiftungs-, Reizungs- und Verbrennungsgefahr). 14. Das Materialsicherheitsdatenblatt (MSDS) ist auf Anfrage erhältlich. 7- VORSICHTSMASSNAHMEN FÜR BENUTZER 1. TIEFGEFRORENE SERUMPROBEN, DIE UNTER NICHT BEKANNTEN BEDINGUNGEN AUFBEWAHRT WURDEN, KÖNNEN AUFGRUND EINER KONTAMINATION MIT PILZEN BZW. BAKTERIEN ZU FALSCH POSITIVEN ERGEBNISSEN FÜHREN. 2. Kits oder Kitreagenzien nach Ablauf des angegebenen Verfallsdatums nicht mehr verwenden. 3. Mit Ausnahme der 10fach konzentrierten Waschlösung (R2) und der Stopplösung (R10) dürfen keine Reagenzien anderer Kits mit unterschiedlichen Chargennummern gemischt werden. 4. Alle Reagenzien mindestens 15 Minuten vor der Verwendung auf Raumtemperatur bringen. 5. Die Reagenzien während der Rekonstitution sorgfältig unter Vermeidung mikrobieller Kontamination mischen. 6. Den Test nicht durchführen, wenn Staub oder reaktive Dämpfe (saure, alkalische, Aldehyd-Dämpfe) vorhanden sind, die zu Veränderungen der Enzymaktivität des Konjugats führen können. 7. Zur Zubereitung der Substrat-Chromogen-Reaktionslösung saubere Einweg-Polypropylen-Gefäße verwenden. Bei Verwendung von Glasgefäßen diese sorgfältig mit 1N-Salzsäurelösung waschen, mit destilliertem Wasser spülen und trocknen. 8. Zum manuellen Pipettieren von Kontrollen und Proben Einweg-Pipettenspitzen zur Vermeidung einer Verschleppung von Proben verwenden. 9. Um adäquate Waschgänge der Vertiefungen sicherzustellen, die empfohlene Anzahl an Waschzyklen beachten. Es muss gewährleistet sein, dass alle Vertiefungen vollständig befüllt und anschließend vollständig geleert werden. Die Waschgänge sollten nicht mit einer Dosierflasche durchgeführt werden. 54

7 10. Die Mikrotiterplatte darf nach dem Waschgang und vor der Zugabe der Reagenzien nicht austrocknen. 11. Für die Konjugat- und Substratlösungen nicht das gleiche Gefäß verwenden. 12. Die Konjugat- und die Substrat-Chromogen-Reaktionslösung dürfen nicht in Berührung mit Metallen oder Metallionen kommen. 13. Das Chromogen oder die Substrat-Chromogen-Reaktionslösung während der Aufbewahrung und der Inkubation keiner starken Lichteinstrahlung aussetzen. Die Chromogenlösungen nicht mit Oxidationsmitteln in Berührung bringen. 14. Die Stopplösung nicht mit Oxidationsmitteln in Berührung bringen. Die Stopplösung nicht mit Metallen oder Metallionen in Berührung bringen. 15. Exposition der Lösungen (Seren, Behandlungslösung, Konjugat) oder offener Gefäße (Platten, Röhrchen, Pipetten usw.) gegenüber der Luft auf ein Minimum reduzieren. 16. Unbenutztes Konjugat nicht wieder in das Originalfläschchen zurückgeben. 17. Die Substrat-Chromogen-Reaktionslösung muss farblos sein. Ist nach der Verdünnung eine Blaufärbung sichtbar, ist das Reagenz kontaminiert und darf nicht verwendet werden. Das Reagenz entsorgen und frisches zubereiten. 8- VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN Streifenplatte mit Mikrovertiefungen (R1) Nach dem Öffnen des Plattenbeutels sind die Streifen mit den Mikrovertiefungen 5 Wochen haltbar, sofern sie in dem sorgfältig wieder verschlossenen Originalbeutel mit Trockenmittel bei +2-8 C aufbewahrt werden. Waschlösung (R2) Ein ausreichendes Volumen an Arbeitswaschlösung durch Zugabe von 1 Teil konzentrierter Waschlösung zu 9 Teilen sterilem destilliertem Wasser geben. Für die Durchführung der Messreihe ein ausreichendes Volumen an Arbeitswaschlösung zubereiten (80 ml für einen Streifen: 8 ml R ml destilliertes Wasser). Die Arbeitswaschlösung kann bei 2-8 C 14 Tage lang aufbewahrt werden. Nach dem Öffnen kann die konzentrierte Waschlösung bei C ohne Kontamination bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum aufbewahrt werden. 55

8 Substrat-Chromogen-Reaktionslösung (R8+R9) Die Substrat-Chromogen-Reaktionslösung durch Zugabe eines Teils konzentrierter Chromogen: TMB-Lösung, R9, zu 50 Teilen TMB-Substratpuffer, R8, zubereiten. 2 ml Substrat-Chromogen-Reaktionslösung pro Streifen zubereiten: 40 µl R9 + 2 ml R8. Die Lösung ist bei lichtgeschützter Lagerung bei Raumtemperatur ( C) 6 Stunden haltbar. Nach dem Öffnen sind die bei +2-8 C gelagerten Reagenzien R8 und R9 ohne Kontamination bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum haltbar. Negatives Kontrollserum (R3), Kalibrator (R4), Positives Kontrollserum (R5), Konjugat (R6), Serumverdünnungsmittel (R7) und Stopplösung (R10) Nach dem Öffnen sind die bei +2-8 C gelagerten Reagenzien R3, R4, R5, R6, R7 und R10 ohne Kontamination bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum haltbar. 9- PROBENGEWINNUNG Die Gewinnung der Blutproben erfolgt gemäß der Standardlaborvorgehensweise. Der Test kann nur mit in Trockenröhrchen gesammelten Serumproben durchgeführt werden. Die Serumproben dürfen nicht mit Pilzsporen bzw. Bakterien kontaminiert sein. Die Proben dürfen beim Transport und der Lagerung in versiegelten Röhrchen nicht der Luft ausgesetzt werden. Nach dem ersten Öffnen können die Proben vor dem Test bis zu 24 Stunden bei +2-8 C gelagert werden. Für eine längere Lagerung das Serum bei - 70 C lagern. Die Serumproben dürfen nur einmal eingefroren und wieder aufgetaut werden. Zuvor tiefgefrorene Proben sollten nach dem Auftauen und vor dem Test gründlich gemischt werden. Die Proben nicht erhitzen. Eine Interferenz aufgrund von Albumin, Bilirubin, Lipiden und Hämoglobin wurde nicht nachgewiesen. Die Seren nicht dekomplementieren. 10- TESTDURCHFÜHRUNG Geliefertes Material Siehe Abschnitt Reagenzien. 56

9 Zusätzlich benötigtes Material 1. Steriles destilliertes oder entionisiertes Wasser für die Verdünnung der konzentrierten Waschlösung. 2. Saugfähige Papiertücher 3. Einweghandschuhe. 4. Schutzbrille. 5. Natriumhypochlorit und Natriumbicarbonat. 6. Einstellbare oder feste Pipetten oder Multipipetten zum Abmessen und Pipettieren von 2 µl, 100 µl und 400 µl. 7. Röhrchen zur Verdünnung von Serumproben. 8. Vortex-Mischer. 9. Mikrotiterplatten-Inkubator, auf 37 ± 1 C eingestellt. 10. Halbautomatisches oder automatisches Waschsystem für Mikrotiterplatten. 11. Mikrotiterplatten-Lesegerät, ausgestattet mit 450 nm- und 620 nm-filtern. 12. Behälter für infektiösen Abfall. Anmerkungen zur Testdurchführung Um die Testergebnisse zu validieren, müssen die negativen und positiven Kontrollen sowie die Bereichspunkte in jeder Messreihe mitgetestet werden. Vorbereitung der Bereichspunkte Die Anti-Mannan-Antikörperkonzentration wird in AU/mL (Arbitrary Units/mL) ausgedrückt: 20 AU/mL-Punkt: 1/441-Verdünnung des Kalibratorserums R4 in Probenverdünnungsmittel R7: zwei aufeinanderfolgende 1/21-Verdünnungen (40 µl R µl R7). 10 AU/mL-Punkt: 1/2-Verdünnung des 20 AU/mL-Punktes in Probenverdün-nungsmittel R7 (200 µl µl R7). 5 AU/mL-Punkt: 1/4-Verdünnung des 20 AU/mL-Punktes in Probenverdünnungsmittel R7 (100 µl µl R7). 2,5 AU/mL-Punkt: 1/8-Verdünnung des 20 AU/mL-Punktes in Probenverdün-nungsmittel R7 (50 µl µl R7). Vorbereitung der Testproben und Kontrollseren Zwei aufeinanderfolgende 1/81-Verdünnungen (10 µl µl R7). 57

10 58 EIA-Verfahren Bitte das Testverfahren strikt befolgen. Es sollten die GLP-Richtlinien beachtet werden. 1. Alle Reagenzien mindestens 15 Minuten vor der Verwendung auf Raumtemperatur ( C) bringen. 2. Arbeitswaschlösung, Substrat-Chromogen-Reaktionslösung, Testproben und negative und positive Kontrollen sowie die Bereichspunkte vorbereiten. 3. Zur Identifizierung der Kontrollseren, Bereichspunkte und Testproben in der Mikrotiterplatte ein Pipettierschema erstellen. Die Kontrollseren und Bereichspunkte (2,5, 5, 10 und 20 AU/mL) können gemäß folgendem Plan pipettiert werden: - A1: Negatives Kontrollserum (R3) - B1: 2,5 AU/mL-Bereichspunkt - C1: 5 AU/mL-Bereichspunkt - D1: 10 AU/mL-Bereichspunkt - E1: 20 AU/mL-Bereichspunkt (R4) - F1: Positives Kontrollserum (R5) - G1: Positives Kontrollserum (R5) 4. Plattenhalter und Streifen der Mikrotiterplatte (R1) aus dem Schutzbeutel nehmen. Streifen, die nicht verwendet werden, wieder in den Beutel mit Trockenmittel stecken und den Beutel wieder verschließen µl des verdünnten Serums in jede Vertiefung geben, einschließlich der Kontrollseren und der Bereichspunkte. 6. Die Platte mit Folie oder Ähnlichem abdecken, um eine Verdunstung zu vermeiden. Sicherstellen, dass die gesamte Oberfläche wasserdicht abgedeckt ist. 7. Die Mikrotiterplatte bei 37 C (± 1 C) in einem Trockeninkubator für die Dauer von 60 ± 5 Minuten inkubieren. 8. Folie abnehmen. Den Inhalt aller Vertiefungen in einen Behälter für infektiöse Abfälle (mit Natriumhypochlorit) absaugen. Die Platte viermal waschen. Nach dem letzten Waschgang die Mikrotiterplatte umdrehen und vorsichtig auf Saugpapier ausklopfen, um die verbleibende Flüssigkeit zu entfernen. 9. Vor der Verwendung den Inhalt des Konjugatfläschchens (R6) durch Umdrehen homogenisieren µl Konjugat (R6) in jede Vertiefung geben. 11. Die Platte mit Folie oder Ähnlichem abdecken, um eine Verdunstung zu vermeiden. Sicherstellen, dass die gesamte Oberfläche wasserdicht abgedeckt ist. 12. Die Mikrotiterplatte bei 37 C (± 1 C) in einem Trockeninkubator für die Dauer von 60 ± 5 Minuten inkubieren.

11 13. Folie abnehmen. Den Inhalt aller Vertiefungen in einen Behälter für infektiöse Abfälle (mit Natriumhypochlorit) absaugen. Die Platte viermal waschen. Nach dem letzten Waschgang die Mikrotiterplatte umdrehen und vorsichtig auf Saugpapier ausklopfen, um die verbleibende Flüssigkeit zu entfernen. 14. Rasch 200 µl Substrat-Chromogen-Reaktionslösung (R8 + R9), abseits von starker Lichteinwirkung, in jede Vertiefung pipettieren. 15. Die Mikrotiterplatte lichtgeschützt bei Raumtemperatur ( C) 30 ± 5 Minuten lang inkubieren. Während diesem Inkubationsschritt keine Klebefolie verwenden µl Stopplösung (R10) in der gleichen Reihenfolge wie die Substrat- Chromogen-Reaktionslösung zusetzen. Gründlich mischen. 17. Den Boden jeder Platte sorgfältig abwischen. 18. Die optische Dichte (OD) jeder Vertiefung bei 450 nm ablesen (Referenzfilter 620 nm). Die Mikrotiterplatten müssen innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stopplösung abgelesen werden. 11- QUALITÄTSKONTROLLE (GÜLTIGKEITSKRITERIEN) Für einen gültigen Test müssen folgende Kriterien erfüllt sein: Extinktionswerte: 0,400 < OD des 5 AU/mL-Bereichspunktes < 1,200 Verhältnis: OD (20 AU/mL-Bereichspunkt) / OD (5 AU/mL-Bereichspunkt) > 2 OD (10 AU/mL-Bereichspunkt) / OD (5 AU/mL-Bereichspunkt) > 1,4 OD (2,5 AU/mL-Bereichspunkt) / OD (5 AU/mL-Bereichspunkt) < 0,8 Anti-Mannan-Antikörperkonzentration: Konzentration von R3: < 2,5 AU/mL. Konzentration von R5: gleich der auf dem Fläschchen angegebenen Konzentration ± 2,5 AU/mL. 12- INTERPRETATION DER ERGEBNISSE Erstellung der Standardkurve Die Standardkurve wird mittels der 4 Bereichspunkte gezogen: 2,5, 5, 10 und 20 AU/mL, die mit Hilfe des Kalibratorserums R4 erstellt wurden. Die positive (R5) und die negative (R3) Kontrolle werden nicht in der Kurve berücksichtigt. Um eine maximale Präzision zu erreichen, eine S-Kurve mit Extrapolation durch Auftragen der Konzentration in AU/mL auf der x-achse (logarithmische Skala) und der optischen Dichte auf der y-achse (lineare Skala) erstellen. Ermöglicht der Plattenleser diese Art der Darstellung nicht, die Kurve durch Verbinden der verschiedenen Bereichspunkte erstellen. 59

12 Bestimmung der Anti-Mannan-Antikörperkonzentration (AU/mL) in den Testseren Die Kalibrierungskurve kann zur Bestimmung der Anti-Mannan-Antikörperkonzentration, ausgedrückt in AU/mL, für jede Testprobe verwendet werden. Interpretation der Ergebnisse Seren mit einer Anti-Mannan-Antikörperkonzentration unter 5 AU/mL (K < 5) werden als "negativ" für das Vorliegen von Anti-Mannan- Antikörper betrachtet. Seren mit einer Anti-Mannan-Antikörperkonzentration zwischen 5 und 10 AU/mL (5 K < 10) werden als "mäßig" für das Vorliegen von Anti- Mannan-Antikörper betrachtet. Seren mit einer Anti-Mannan-Antikörperkonzentration gleich oder über 10 AU/mL (K 10) werden als "positiv" für das Vorliegen von Anti- Mannan-Antikörper betrachtet. Die zur Erstellung der Kalibrierungskurve verwendeten Bereichspunkte ermöglichen keine präzise Bestimmung von Konzentrationen über 20 AU/mL. Vor der Verdünnung gemäß Anleitung (siehe Abschnitt 10 Testdurchführung ) sollte der Test mit dem im Verhältnis 1/4 mit Probenverdünnungsmittel (R7) verdünnten Serum wiederholt werden, um eine präzisere Bestimmung der Konzentration in stark positiven Seren zu erreichen: Die in diesem Test ermittelte Konzentration muss mit 4 multipliziert werden. Die Ermittlung der Anti-Mannan-Antikörperkonzentration im Serum ist ein bedeutender Bestandteil zur Bestimmung des Immunstatus des Patienten hinsichtlich Candida. Anti-Mannan-Antikörper weisen auf ein Vorliegen von Hefen des Genus Candida beim Wirt hin und müssen als zusätzlicher Risikofaktor für invasive Candidiasis bei Patienten mit hohem Risiko betrachtet werden. 5,13 Eine plötzliche Schwankung der Antikörperkonzentration kann ein Zeichen für das Fortschreiten einer aktiven Infektion darstellen. Dies muss jedoch im Zusammenhang mit den klinischen Daten des Patienten interpretiert werden. Für die Diagnose einer invasiven Candidiasis muss die Überwachung der Antikörperkonzentration mit der Bestimmung der Konzentration des zirkulierenden Antigens kombiniert werden. Eine regelmäßige serologische Untersuchung liefert bessere Daten als ein einziges Testergebnis und ermöglicht die Überwachung von Patienten mit hohem Risiko. 7,12 Zur Erhöhung der Sensitivität und um gegebenenfalls möglichst früh ein positives Ergebnis zu erzielen, wird eine regelmäßige Überwachung von Patienten mit hohem Risiko empfohlen. 60

13 13- GRENZEN DES VERFAHRENS 1. Aufgrund eines negativen Testergebnisses kann eine Diagnose einer invasiven Candidiasis nicht völlig ausgeschlossen werden. Bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem kann das Fehlen von Antikörpern nur schwierig nachgewiesen werden. 2. Ein negatives Testergebnis für Anti-Mannan-Antikörper muss in Zusammenhang mit den Ergebnissen von Mannan-Antigen-Tests interpretiert werden: Selbst bei invasiver Candidiasis ist das Antigen nur sehr schwierig bei für Anti-Mannan-Antikörper positiven Patienten nachzuweisen (siehe Abschnitt 14: Spezifische Leistungsmerkmale ). 3. Beim Nachweis von Anti-Mannan-Antikörpern muss das Verfahren des Platelia Candida Ab/Ac/Ak und der Interpretation der Ergebnisse befolgt werden. Vor der Durchführung des Tests sollten Benutzer dieses Kits die Packungsbeilage sorgfältig lesen. Insbesondere muss das Testverfahren für die Pipettierung der Proben und Reagenzien, der Plattenwaschgänge und der Inkubationszeiten genau beachtet werden. 4. Wird die Probe oder das Reagenz nicht gemäß der Testanleitung zugegeben, kann dies zu einem falsch negativen Ergebnis führen. Bei fehlerhafter Testdurchführung sollte erneut getestet werden. 5. Bei einer schlechten Handhabung der Mikrotiterplatte oder einer schlechten Pipettiertechnik bei der Zugabe der Reagenzien kann es zu einer Kontamination der Vertiefungen mit negativer Probe durch Flüssigkeitsspritzer mit positiver Kontrolle/Patientenprobe aus anderen Vertiefungen kommen. 14- SPEZIFISCHE LEISTUNGSMERKMALES 14.1 Reproduzierbarkeitsstudien Die in Intraassay-Studien (30fach-Bestimmung) und Interassay-Studien (über 5 Tage) errechneten Variationskoeffizienten bestätigen eine gute Reproduzierbarkeit des Tests (Variationskoeffizienten (AU/mL) < 10% bei positiven Proben in Intraassay-Studien und Variationskoeffizienten < 17,5% bei positiven Proben in Interassay-Studien). Intraassay-Varianz: 4 Seren (1 negatives Serum, 2 mäßige Seren mit Konzentrationen von 8,5 AU/mL und 9,7 AU/mL und 1 positives Serum mit einer Konzentration von 14,4 AU/mL) wurden 30fach getestet. Die Variationskoeffizienten lagen bei 3,6%, 4,8% 6,9% bzw. 5,4%. 61

14 Interassay-Varianz: 4 negative Seren, 1 mäßiges Serum und 2 positive Seren wurden in 5 Serien über mehrere Tage getestet. Die Variationskoeffizienten lagen für die Seren mit Konzentrationen im positiven bzw. mäßigen Bereich bei < 17,5% Klinischer Test SPEZIFITÄT Der klinische Test zur Evaluierung der Sensitivität des Platelia Candida Ab/Ac/Ak wurde mit Serumproben von 700 hospitalisierten Patienten durchgeführt und ergab eine Korrelation von 83% (Spearman-Koeffizient) mit dem Immunfluoreszenz-Antikörpernachweis.10 Die Ergebnisse verschiedener Populationen sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. Mit Platelia Candida Ab/Ac/Ak erzielte Anti-Mannan-Antikörperkonzentrationen der verschiedenen getesteten Patientenpopulationen: Patientenkategorie Anzahl der Patienten (Anzahl der Seren) Nicht ausgewählt 173 (173) Hospitalisiert, nicht kolonisiert Hospitalisiert, mit Candida kolonisiert 33 (62) 102 (221) Invasive Candidiasis 117 (384) K< 2,5 2,5 K < 5 82,1% (142) 84,9% (28) 20,6% (21) 25,6% (30) Konzentration (AU/mL) 11% (19) 9,1% (3) 11,8% (12) 8,5% (10) 5 K < 10 4,6% (8) 3,0% (1) 31,4% (32) 20,5% (24) 10 K < 20 1,7% (3) 22,5% (23) 16,2% (19) K 20 0,6% (1) 3,0% (1) 13,7% (14) 29,2% (34) SENSITIVITÄT Der klinische Test zur Evaluierung der Sensitivität des Platelia Candida Ab/Ac/Ak wurde in vier Universitätskliniken in Frankreich durchgeführt. Die Studie wurde retrospektiv unter Verwendung von insgesamt 377 Serumproben von 117 Patienten unterschiedlicher Stationen durchgeführt: Chirurgie, Hämatologie, Intensivstation, Verbrennungen... Candida-Hefen wurden aus Blutkulturen oder tiefen Proben dieser Patienten.6, 9, 10 isoliert 62

15 In dieser Patientenpopulation lag die Gesamt-Sensitivität von Platelia Candida Ab/Ac/Ak bei 60% (ausschließlich der Seren mit einer Anti- Mannan-Antikörperkonzentration zwischen 5 und 10 AU/mL, die als mäßig für das Vorliegen von Anti-Mannan-Antikörper betrachtet werden: 16% der Patienten). Je nach isolierter Candida-Spezies variierte die Sensitivität gemäß der folgenden Tabelle: Isolierte Candida-Spezies Anzahl der Patienten (Anzahl der Seren) K 10 Sensitivität K 10 und 5 K < 10 C. tropicalis 10 (72) 66,7 % 76,7 % C. glabrata 12 (31) 30,0 % 46,7 % C. albicans 75 (219) 71,0 % 88,3 % C. kefyr 2 (5) 50,0 % 50,0 % C. parapsilosis 10 (29) 25,0 % 45,0 % C. krusei 8 (21) 42,9 % 62,9 % Durch diese klinischen Studien wurde auch die Bedeutung der Kombination des Nachweises von Anti-Mannan-Antikörpern mit Platelia Candida Ab/Ac/Ak mit dem Nachweis von Mannan-Antigen mittels Platelia Candida Ag gezeigt. Durch Kombination des serologischen Nachweises von Mannan-Antigen und 9, 10 Anti-Mannan-Antikörpern bei 106 Patienten mit invasiver Candidiase wird eine Sensitivität von 84,8% erzielt (einschließlich der 6,6% Patienten mit mäßiger Reaktion: Diese Tests erwiesen sich nicht nur als komplementär bei Populationen mit hohem Risiko, sondern es konnte auch ein ausgeglichenes Verhältnis der positiven Ergebnisse der beiden Tests bei dem gleichen Patienten im gleichen Stadium einer Candida -Infektion, das womöglich mit der Prognose der Infektion korreliert, beobachtet werden QUALITÄTSKONTROLLE DES HERSTELLERS Alle von der Firma Bio-Rad hergestellten Reagenzien unterliegen einem Qualitätssicherungssystem vom Rohstoffeingang bis zur Vermarktung der Fertigprodukte. Jede Fertigproduktcharge wird einer Qualitätskontrolle unterzogen und nur dann verkauft, wenn sie den Freigabekriterien entspricht. Die Unterlagen bezüglich Herstellung und Kontrolle der einzelnen Chargen werden bei Bio-Rad aufbewahrt. 63

16 16- BIBLIOGRAPHY 1. FRIDKIN, S. K. and W. R. JARVIS Epidemiology of nosocomial fungal infections. Clin. Microbiol. Rev. 9: p FUKAZAWA, Y Antigenic structure of Candida albicans. Immunochemical basis of the serologic specificity of the mannans in yeasts. Immunol. Ser. 47: p HERENT, P., D. STYNEN, F. HERNANDO, J. FRUIT, and D. POULAIN Retrospective evaluation of two latex agglutination tests for detection of circulating antigens during invasive candidosis. J. Clin. Microbiol. 30: p PONTON, J., M. MORAGUES, and G. QUINDOS Non-Culture- Based Diagnostics, p In R. Calderone (ed.), Candida and Candidiasis. ASM Press, Washington, D.C. 5. POULAIN, D Physiopathologie et diagnostic des candidoses systémiques. La Lettre de l'infectiologue 15: p RODIER, M.H., C. KAUFFMAN-LACROIX, P. GAUTRET, D. MAYET and J.L. JACQUEMIN Evaluation of a mettalopeptidase antigen from Candida albicans in serodiagnosis of candidosis : comparison of technics. Journal Mycologie Médicale 9: p RUCHEL, R Diagnosis of invasive mycoses in severely immunosuppressed patients. Ann. Hematol. 67: p RUHNKE, M. and G. MASCHMEYER Management of mycoses in patients with hematologic disease and cancer - review of the literature. Eur. J. Med. Res. 7: p SENDID, B., J. L. POIROT, M. TABOURET, A. BONNIN, D. CAILLOT, D. CAMUS, and D. POULAIN Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species. J. Med. Microbiol. 51: p SENDID, B., M. TABOURET, J. L. POIROT, D. MATHIEU, J. FRUIT, and D. POULAIN New enzyme immunoassays for sensitive detection of circulating Candida albicans mannan and antimannan antibodies: useful combined test for diagnosis of systemic candidiasis. J. Clin. Microbiol. 37: p

17 11. TIRABOSCHI, I. N., J. E. BENNETT, C. A. KAUFFMAN, J. H. REX, C. GIRMENIA, J. D. SOBEL, and F. MENICHETTI Deep Candida infections in the neutropenic and non-neutropenic host: an ISHAM symposium. Med. Mycol. 38 Suppl 1: p VAN DEVENTER, A. J., W. H. GOESSENS, J. H. VAN ZEIJL, J. W. MOUTON, M. F. MICHEL, and H. A. VERBRUGH Kinetics of anti-mannan antibodies useful in confirming invasive candidiasis in immunocompromised patients. Microbiol. Immunol. 40: p VERWEIJ, P. E., D. POULAIN, T. OBAYASHI, T. F. PATTERSON, D. W. DENNING, and J. PONTON Current trends in the detection of antigenaemia, metabolites and cell wall markers for the diagnosis and therapeutic monitoring of fungal infections. Med. Mycol. 36 Suppl 1: p YERA, H., B. SENDID, N. FRANCOIS, D. CAMUS, and D. POULAIN Contribution of serological tests and blood culture to the early diagnosis of systemic candidiasis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 20: p

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