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1 bioelisa HBsAg tests tests ELISA-Test zur Bestimmung des Oberflächenantigens der Hepatitis B (HBsAg) in Humanserum oder -plasma, zur Verwendung in klinischen Labors sowie als Screening-Test in Blutbanken. Zusammenfassung Die Hepatitis B ist eine durch Virusinfektion verursachte Krankheit. Im Verlauf der Infektion treten verschiedene serologische Marker auf, unter anderem das HBsAg bestimmten Blumberg und Mitarb. 1 zum ersten mal ein Antigen im Serum eines australischen Aborigine, welches mit einem Antikörper des Serums eines hämophilen New-Yorker Patienten reagierte. Später wurde dieses Antigen als das Oberflächenantigen der Hepatitis B identifiziert. Die Entdeckung des HBsAg war ein entscheidender Schritt für die Kenntnis und Differenzierung der Virushepatitis. Die Anwesenheit des HBsAg im Serum oder im Plasma ist der wichtigste Marker für die Diagnose einer Hepatitis-B-Virusinfektion (HBV) beschrieben Engvall und Perlmann 2 sowie van Weemen und Schuurs 3 erstmals einen Enzymimmun-Test. Die anschließende Weiterentwicklung der Technik und die Verwendung von Mikroplatten durch Voller und Mitarb. 4,5 haben es ermöglicht, hochpräzise und - sensible Diagnose-Kits zu erstellen. Prinzip bioelisa HBsAg 3.0 ist eine direkte immunenzymatische Methode des "Sandwich"-Typs, bei der die Vertiefungen einer Mikroplatte mit dem Anti-HBs Kaninchenantikörper beschichtet wird, der als Fangantikörper wirkt, wobei mit Peroxidase markierter Anti-HBs Ziegenantikörper als Konjugat verwendet wird. Die zu analysierende Probe wird in einer der Vertiefungen der Mikroplatte inkubiert. Wenn die Probe HBsAg aufweist, wird sich dieses an den Anti- HBs Antikörper binden, der sich mit der Platte verbunden hat. Nach dem Auswaschen zur Beseitigung des unverbundenen Materials wird der mit Peroxidase konjugierte Anti-HBs Ziegenantikörper hinzugegeben, der mit dem bei der ersten Inkubation möglicherweise entstandenen Antigen-Antikörper-Komplex reagieren wird. Nach dieser zweiten Inkubation und dem anschließenden Auswaschen wird das Enzymsubstrat hinzugefügt, das ein Chromogen enthält und eine Blaufärbung erzeugen wird, wenn die Probe positiv für HBsAg ist. Die blaue Farbe wird gelb nachdem die Reaktion mit Schwefelsäure gestoppt worden ist. Die Intensität der Farbe ist proportional zur HBsAg-Konzentration in der Probe. Bestandteile 1. MCPL MIKROTITERPLATTE: 12 x 8 Vertiefungen, beschichtet mit Anti-HBs Kaninchenantikörper. Einzeln trennbare Vertiefungen. 2. CONJ 51x KONZENTRIERTES KONJUGAT: Mit Peroxidase konjugierter Anti-HBs Ziegenantikörper. Enthält roten Farbstoff, Proteinstabilisatoren, 0,02% Bronidox und 0,001% Gentamicinsulfat. Vor Gebrauch mit dem Konjugatverdünnungsmittel auf 1/51 verdünnen. 3. DIL CONJ KONJUGATVERDÜNNUNGSMITTEL: Tris-Puffer, der gelben Farbstoff, Zusatzmittel, 0,02% Bronidox und 0,001% Gentamicinsulfat enthält. Zur Verdünnung des konzentrierten Konjugats. 4. WASH SOLN 10x KONZENTRIERTE WASCHLÖSUNG: Konzentrierter Phosphatpuffer (10x), der 1% Tween 20 und 0,01% Thimerosal enthält. Vor Gebrauch mit destilliertem oder deionisiertem Wasser 1/10 verdünnen. 5. SUBS BUF SUBSTRATPUFFER: Zitrat/Azetat-Puffer mit Wasserstoffperoxid. HERVORGEHOBENE ÄNDERUNGEN LESEN 6. SOLN TMB CHROMOGEN: 3,3', 5,5'- Tetramethylbenzidin (TMB), gelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO). Enthält roten Farbstoff. 7. CONTROL + POSITIVE KONTROLLE: Normales Humanserum, das in Phosphatpuffer mit gereinigtem und inaktiviertem HBsAg und 0,02% Natriumazid verdünnt ist. Enthält grünen Farbstoff. Gebrauchsfertig. 8. CONTROL NEGATIVE KONTROLLE: Für HBsAg negatives Humanserum, das in Phosphatpuffer mit 0,02% Natriumazid verdünnt ist. Enthält gelben Farbstoff. Gebrauchsfertig.

2 9. H 2 SO 4 1N STOPPLÖSUNG (nur in dem Kit mit 1 Platte): 1N Schwefelsäure. Gebrauchsfertig. 10. SEALS HAFTFOLIE: Zum Abdecken der Mikrotiterplatte während der Inkubationsphasen. 11. BAG FOLIENBEUTEL: Zur Aufbewahrung der nicht verwendeten Streifen. Vorsichtsmassnahmen bioelisa HBsAg 3.0 ist ausschließlich für die IN VITRO-Diagnostik bestimmt. Für den ausschließlichen Gebrauch durch Fachpersonal. ACHTUNG: BIOLOGISCH GEFÄHRLICHES MATERIAL. Das gesamte zur Herstellung dieses Produktes verwendete Humanmaterial ist unter Verwendung eines zugelassenen kommerziellen Verfahrens auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen die Viren HIV-1/HIV-2 und HCV sowie auf das Hepatitis-B-Oberflächenantigen getestet und für negativ befunden worden, sofern kein positiver Befund erforderlich ist. Das in der positiven Kontrolle enthaltene HBsAg ist 10 Stunden lang bei 60 C inaktiviert worden. Da kein Nachweisverfahren die Abwesenheit von infektiösen Agenzien garantieren kann, ist dieses Produkt mit entsprechenden Vorsichtsmassnahmen zu handhaben: - Eine Berührung der Reagenzien mit Haut oder Augen vermeiden, bei Berührung mit reichlich Wasser auswaschen. - Handschuhe verwenden. - Die Reagenzien nicht mit dem Mund pipettieren. - Nicht rauchen. - Alle benutzten Materialien sind separat in Behältern für biologische Abfälle zu entsorgen. Die Reste von Proben, Kontrollen, aspirierten Reagenzien und Einweg-Pipettenspitzen müssen in einem dafür vorgesehenen Behälter gesammelt werden und vor dem Entsorgen eine Stunde bei 121 C autoklaviert werden oder mit Natriumhypochlorit in einer Endkonzentration von 10% 30 Minuten lang behandelt werden (Säure enthaltende Reste müssen vor Zugabe des Natriumhypochlorits neutralisiert werden). - Verschiedene Reagenzien in diesem Kit enthalten Natriumazid als Konservierungsmittel. Das Natriumazid kann auf Blei- oder Kupfer-Rohrleitungen und Abflüsse reagieren und zu hoch explosiven Metallaziden führen. Beim Entfernen der Reagenzreste muss genügend Wasser nachgespült werden. Hinweise für die Handhabung: - Für sachgemäßes Auswaschen den Wascher auf den Mikrotiterplattentyp einstellen (flacher Grund). - Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen nicht mischen. - Die Reagenzien nicht über das Verfallsdatum hinaus verwenden. - Verwenden Sie das Reagenz nicht, wenn Sie an irgendeinem zu dem Kit gehörenden Bestandteil irgendeine Änderung des Erscheinungsbilds beobachten. - Es ist besondere Sorgfalt aufzuwenden, um eine Kontamination mit Bakterien und eine Kreuzkontamination zwischen den Reagenzien zu vermeiden. - Zur Pipettierung jeder Probe und jedes Reagenz ist eine neue Einweg-Pipettenspitze zu verwenden. - Es ist sehr wichtig, die TMB-Substratlösung erst 5-10 Minuten vor Gebrauch zuzubereiten. Die Lösung ist in einem gut verschlossenen Gefäss lichtgeschützt aufzubewahren. - Reste von Seifen und/oder Oxidationsmitteln, die in den zur Herstellung der TMB-Substratlösung verwendeten Gefässe zurückgeblieben sind, können die Reaktion beeinflussen. Bei Verwendung von Glasgefäßen sollten diese darum mit 1N Schwefelsäure oder Salzsäure ausgewaschen mit reichlich destilliertem Wasser ausgespült und vor Gebrauch getrocknet werden. Vorzugsweise sind Einweggefäße aus Kunststoff zu verwenden. Lagerung und Stabilität Bei einer Lagerungstemperatur von 2-8 C bleiben die Bestandteile bis zum auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum haltbar. Der Beutel mit der Mikrotiterplatte muss vor dem Öffnen auf Raumtemperatur gebracht werden, um eine Kondensationsbildung in den Vertiefungen zu vermeiden. Nach dem Öffnen des Beutels ist die Mikrotiterplatte bei Lagerung zwischen 2 und 8 C im gut verschlossenen Kunststoffbeutel mit dem Silicagelbeutel 3 Monate haltbar. Die Waschlösung bleibt nach Verdünnung zwei Wochen haltbar, wenn sie bei 2-8 C gelagert wird. Das Konjugat ist nach Verdünnung 7 Tage haltbar bei einer Lagerung zwischen 2 und 8 C. Das Chromogen vor direktem Licht schützen. Die TMB-Substratlösung ist nach Zubereitung nicht stabil, deshalb sind die Gebrauchsanweisungen sorgfältig zu befolgen.

3 Packungsinhalt - Kit mit 1 Platte (96 Tests), REF Enthält: 1 Platte, 1 x 0,4 ml konzentriertes Konjugat, 1 x 16 ml Konjugatverdünnungsmittel, 2 x 50 ml konzentrierte Waschlösung, 1 x 14 ml Substratpuffer, 1 x 1,5 ml Chromogen, 1 x 1,7 ml positive Kontrolle, 1 x 5 ml negative Kontrolle, 1 x 12 ml Stopplösung, 1 Folienbeutel und Haftfolien. - Kit mit 5 Platten (5 x 96 Tests), REF Enthält: 5 Platten, 1 x 1,3 ml konzentriertes Konjugat, 2 x 30 ml Konjugatverdünnungsmittel, 3 x 100 ml konzentrierte Waschlösung, 5 x 14 ml Substratpuffer, 1 x 1,5 ml Chromogen, 1 x 1,7 ml positive Kontrolle, 1 x 5 ml negative Kontrolle, 1 Folienbeutel und Haftfolien. Erforderliches, nicht mitgeliefertes Material - Destilliertes oder deionisiertes Wasser. - Mehrkanalpipetten und Mikropipetten (100 µl) und Einwegspitzen. - Inkubator (Trocken oder mit Feuchtigkeit) mit 37 C 1 C. - Stoppuhr. - Mikrotiterplattenmessgerät mit Filter 450 nm. Empfohlen wird ein Referenzfilter 620 bis 630 nm. - Manuelles oder automatisiertes Waschsystem. - Stopplösung (Kit mit 5 Platten): 1N Schwefelsäure. Es kann auch 2N oder 4N Schwefelsäure verwendet werden. Probenmaterial Frisches Serum oder Plasma verwenden (Zitrat/EDTA). Andere Antikoagulantien müssen zuvor evaluiert werden. Die Proben können 3 Tage lang bei 2-8 C gelagert werden. Bei längerer Lagerung müssen die Proben eingefroren werden (-20 C). Mehrmaliges Einfrieren und Auftauen der Proben ist zu vermeiden. Sichtbare suspendierte Partikel sind durch Zentrifugieren zu entfernen. Die Seren oder Plasmen dürfen nicht hitzinaktiviert werden, da es sonst zu falschen Ergebnissen kommen kann. Automatische Verarbeitung Dieser Test kann in seiner automatischen oder halbautomatischen Modalität in unterschiedlichen Instrumenten eingesetzt werden. Beim Einsatz automatischer Systeme muss jedoch unbedingt geprüft werden, ob die erhaltenen Probenergebnisse mit den Ergebnissen des manuellen Tests übereinstimmen. Der Anwender sollte das Instrument in regelmäßigen Abständen validieren. Falls Sie Probleme bei der Programmierung und Einstellung der automatischen Prozessoren von Biokit feststellen sollten, setzen Sie sich bitte mit Ihrem Händler in Verbindung. DURCHFÜHRUNG (Siehe schematischer Ablauf) Vorbereitung Alle Reagenzien müssen vor Beginn des Tests auf Raumtemperatur gebracht worden sein. Flüssige Reagenzien müssen vor Gebrauch vorsichtig gemischt werden. Die konzentrierte Waschlösung ist mit destilliertem oder deionisiertem Wasser auf 1/10 zu verdünnen. Für eine Platte 50 ml konzentrierte Waschlösung mit 450 ml Wasser mischen. Wenn nicht eine ganze Platte verwendet wird, muss die proportional entsprechende Menge der Lösung hergestellt werden. Das konzentrierte Konjugat mit dem Konjugatverdünnungsmittel auf 1/51 verdünnen. Für eine Platte werden 240 µl des konzentrierten Konjugats (Farbe rot) in 12 ml Konjugatverdünnungsmittel (Farbe gelb) hinzugefügt. Vorsichtig mischen. Wenn nicht eine ganze Platte verwendet wird, siehe Hinweise in tabelle 1. DIE ARBEITSKONJUGATLÖSUNG IST ORANGEFARBEN. TABELLE 1 Verwendete Streifen Verdünnungsmittel Konjugat ml 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 Konzentriertes Konjugat µl Monitorisierung der Proben- und Reagenzienzugabe Da die Probe keine Vorverdünnung erfordert und alle Reagenzien und Kontrollen gefärbt sind, ist eine Monitorisierung ihrer Zugabe auf der Mikroplatte mittels spektrophotometrischer Ablesung möglich. Hierbei wird die Platte nach der Beschichtung bei 450 nm (ohne Referenzfilter) abgelesen. Die Extinktionswerte müssen wie folgt sein: SERUM / PLASMA / KONTROLLEN: 0,100 ARBEITSKONJUGAT (orangefarben): 0,500 ARBEITSSUBSTRAT (rosafarben): 0,050

4 Wenn in einer der Vertiefungen die genannten Spezifikationen nicht erfüllt sind, ist das ein Hinweis darauf, dass während des Auftragens etwas nicht korrekt verlaufen ist und nachträglich überprüft werden muss. Versuchsprotokoll 1. Je 100 µl von der positiven und der negativen Kontrolle auf die entsprechenden Vertiefungen überführen. Bei jeder Testdurchführung müssen, unabhängig von der Anzahl zu testender Proben, auf allen Platten oder Teilflächen der Platten mindestens 3 Vertiefungen für die negative Kontrolle, eine Vertiefung für die positive Kontrolle und eine für den Leerwert mit Substrat verwendet werden. Die Vertiefung für den Leerwert freilassen (es wird empfohlen, die Vertiefung A1 für den Leerwert zu reservieren). 2. Je 100 µl der einzelnen zu testenden Proben auf die entsprechenden Vertiefungen übertragen. 3. Die Platte mit einer Haftfolie abdecken und 60 5 Minuten lang bei 37 C inkubieren. 4. Die Haftfolie abnehmen und entsorgen. Den Inhalt aus den Vertiefungen herauspipettieren und diese vollständig (ca. 350 µl) mit verdünnter Waschlösung befüllen. Den Vorgang aus Aspirieren und Auswaschen weitere 3 Mal Stellen Sie sicher, dass jede Vertiefungsreihe mindestens 15 Sekunden einweicht, bevor ein neuer Aspirationszyklus einsetzt. Nach dem letzten Waschen die umgekehrte Platte auf saugfähigem Papier ausklopfen, um überschüssige Flüssigkeitstropfen aus den Vertiefungen zu entfernen µl Konjugat in alle Vertiefungen der Platte zugeben, mit Ausnahme der Vertiefung für die Leerwertsprobe mit Substrat. 6. Die Platte mit einer Haftfolie abdecken und 30 2 Minuten lang bei 37 C inkubieren. 7. Während der letzten 5-10 Minuten dieser Inkubation die Substrat-Chromogen-Lösung zubereiten. Bei Verwendung einer ganzen Platte 280 µl der TMB-Chromogen-Lösung in eine Reagenzflasche mit Substratpuffer (14 ml) einfüllen und gut mischen. DIE ARBEITSSUBSTRATLÖSUNG IST ROSAFARBEN, bei Blaufärbung nicht mehr verwenden. Wird nicht die ganze Platte benötigt, dann die erforderliche Menge gemäß tabelle 2 zubereiten. TABELLE 2 Erforderliche Streifen Substratpuffer ml 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 Chromogen (TMB) µl HINWEIS: Das TMB ist in DMSO gelöst. Da die Schmelzpunkt von DMSO bei 18 C liegt muss das Chromogen vor Gebrauch auf eine Temperatur von C gebracht und gut gemischt werden. 8. Die Haftfolie abnehmen und entsorgen. Die Platte wie unter Punkt 4 beschrieben aspirieren und waschen µl des TMB-Substrats auf alle Vertiefungen sogar des Leerwertes hinzugeben Minuten lang bei Raumtemperatur (20-25 C) inkubieren µl Stopplösung in jede Vertiefung einfüllen, dabei die gleiche Reihenfolge und die gleichen Zeitabstände einhalten wie bei der Zugabe des TMB-Substrats. 12. Das Messgerät anhand der Vertiefung mit der Leerwertsprobe bei 450 nm auf Null stellen und die Extinktion jeder einzelnen Vertiefung innerhalb einer Zeitspanne von maximal 30 Minuten ablesen. Empfohlen wird eine biochromatische Messung mit einem Referenzfilter von nm. Qualitätskontrolle Die Ergebnisse einer Serie sind gültig, wenn folgende Kriterien erfüllt sind: 1. Substratleerwert. Der Extinktionsgrad muss unterhalb oder gleich 0,100 sein.

5 2. Mittelwert der negativen Kontrolle (NKx). Den Mittelwert der für die negative Kontrolle ermittelten Extinktionswerte berechnen. Die ermittelten Einzelwerte müssen gleich oder größer 0,5 x NKx bzw. gleich oder kleiner 1,5 x NKx sein. Wenn einer der Werte außerhalb des Grenzbereichs liegt, muss er ausgeschlossen und der Mittelwert neu berechnet werden. Wenn zwei der Werte außerhalb des Grenzbereichs liegen, muss der Test wiederholt werden. Beispiel: 0,144 NKx = = 0, ,5 x 0,048 = 0,024 1,5 x 0,048 = 0,072 Negative Kontrolle Extinktion 1 0, , ,049 Total 0,144 Bei diesem Beispiel ist kein Wert auszuschließen. Der Mittelwert der Extinktionswerte der negativen Kontrollen muss nach Abzug des Leerwertes kleiner als 0,120 sein. NKx 0, Positive Kontrolle (PK). Der für die positive Kontrolle ermittelte Extinktionswert muss nach Abzug des Leerwertes gleich oder größer 0,700 sein. PK 0,700 Wenn eines der vorstehenden Kriterien nicht erfüllt wird, ist der Test ungültig und muss wiederholt werden. Ergebnisse Die Anwesenheit oder Abwesenheit des HBsAg in den zu analysierenden Proben wird durch das Verhältnis des Extinktionswertes jeder einzelnen Probe zum Schwellenwert bestimmt. 1. Zur Berechnung des Schwellenwertes wird 0,040 zum Mittelwert der negativen Kontrolle addiert. Schwellenwert = NKx + 0, Die Extinktion der Probe durch den Schwellenwert teilen. Positiv: Verhältnis Extinktion/Schwellenwert 1,0 Negativ: Verhältnis Extinktion/Schwellenwert 0,9 Zweifelhaft: Verhältnis Extinktion/Schwellenwert 0,9 1,0 Auswertung der Ergebnisse Ein wiederholt für HBsAg positives Ergebnis ist ein Hinweis auf das Vorliegen einer durch den Virus der Hepatitis B erzeugten Infektion. Um festzustellen, ob es sich um eine akute oder chronische Infektion handelt, müssen zusätzliche serologische Marker der Hepatitis B unter Hinzuziehung des klinischen Krankheitsbildes des Patienten analysiert werden. Begrenzung der Methode Alle Proben, die ein positives oder zweifelhaftes Ergebnis erbracht haben, müssen erneut doppelt geprüft werden. Wenn das Ergebnis erneut positiv oder zweifelhaft ist, sollte die Probe mit einem anderen vergleichbaren Test analysiert werden.

6 Obwohl der vorliegende Test als ein Verfahren der dritten Generation zur Bestimmung des HBsAg klassifiziert ist, muss berücksichtigt werden, dass keine der derzeit existierenden Methoden zur Bestimmung des HBsAg ausreichend sensibel für die Bestimmung aller möglichen Fälle von Hepatitis B ist. Erwartete Ergebnisse Die Prävalenz chronischer HBsAg-Träger ist weltweit sehr unterschiedlich und reicht von hoch (> 8%, z.b. Afrika, Asien und Westpazifik) über mittelhoch (2-7%, z.b. Süd- und Osteuropa) bis niedrig (< 2%, z.b. Westeuropa, Nordamerika und einige Gebiete in Südamerika). In Westeuropa liegt die Prävalenz der HBsAg-Träger bei 0,1 bis 0,5% und in Südeuropa bei 1 bis 5%. 13 Charakteristika des Tests Analytische Sensibilität Die Sensibilität beträgt mindestens 0,100 Einheiten/ml HBsAg für die Subtypen ad und ay, wenn man die HBsAg-Standards benutzt, die sich an denen des Paul-Ehrlich-Instituts (PEI-Deutschland, Ref. 87) orientieren. Wenn man den Zweiten Internationalen HBsAg-Standard Subtyp adw2, Genotyp A der Weltgesundheitsorganisation (NIBSC-Ref.: 00/588) benutzt, beträgt die ermittelte Sensitivität mindestens 0,125 le/ml. Auswertungen - Bei einer Studie zur Auswertungen des Funktionierens des Kits, wurden 416 vermeintlich für HBsAg positive Proben getestet und mit einer Referenzmethode verglichen. In dieser Studie erzielte man eine Sensibilität von 100% Proben von Krankenhauspatienten wurden im Vergleich mit einer Referenzmethode getestet. 196 Proben erwiesen sich mit beiden Methoden als negativ, 3 wurden als positiv bestätigt und 1 war ein falsch positives Ergebnis. Die in dieser Studie ermittelte Spezifität betrug 99,5%. - Es wurden 440 Serumproben einer Blutbank mit drei Chargen des Reagenzes getestet und die Ergebnisse mit der routinemäßig für das Screening von HBsAg verwendeten Methode verglichen. Mit zwei Chargen ermittelte man eine Spezifität von 100% und mit der dritten Charge eine von 99,5%. - In einer Blutbank (EFS Mittelatlantik, Frankreich) wurden 4871 Proben von nicht ausgewählten Spendern parallel mit der routinemäßig benutzten Methode für das Screening von HBsAg analysiert. Von dieser Gesamtheit waren 11 Proben zunächst reaktiv (0,23%), von denen wiederum 3 wiederholt reaktiv ausfielen (0,06%). Die ermittelte Spezifität lag bei 99,94%. Präzision Reproduzierbarkeit innerhalb des Versuchs: Die für die Extinktionswerte von 72 Erwiderungen einer positiven Probe erhaltenen Variationskoeffizienten lagen bei 2,2%, 2,5% und 2,6% in drei getesteten Chargen. Reproduzierbarkeit zwischen Versuchen: Die positive Kontrolle wurde an 5 verschiedenen Tagen mit 3 verschiedenen Chargen bioelisa HBsAg 3.0 nachgeprüft. Die Abweichungskoeffizienten, die für das Verhältnis Extinktion/Schwellenwert der 3 Chargen erhalten wurden, lagen bei 1,2%, 1,0% und 2,4%. Interferenzen Interferenz durch Zusatz Es wurde keine Interferenz durch Hämoglobin (2 mg/ml), Bilirubin (0,2 mg/ml) und Triglyzeride (13 mg/ml) beobachtet. Kreuzreaktionen In einer Studie über mögliche Interferenzen wurden 144 Proben mit einem potenziellen Risiko falsch positive Ergebnisse zu liefern getestet. Von besagten Proben stammten 20 von RPR-positiven Seren, 15 stammten von Mononukleosis-positiven Seren, 18 waren für anti-nukleäre Antikörper (ANA) positiv, 9 waren für Rheumafaktor (RF) positiv, 32 stammten von schwangeren Frauen, 20 waren für Antikörper auf Hepatitis C positiv, 20 waren für HIV-Antikörper positiv und 15 waren für Hepatitis-A-Antikörper positiv. Es wurden 2 positive Proben gefunden, die mit einem Referenztest bestätigt wurden. Alle anderen Proben fielen mit dem bioelisa HBsAg 3.0 negativ aus.

7 bioelisa: Leitfaden zur Problemlösung Problem Mögliche Ursachen Lösung 1. Kontrollen außerhalb der Validierung. 2. Keine oder nur schwache Färbung am Ende des Tests. 1a. Temperatur, Inkubation oder Pipettieren falsch. 1b. Unsachgemäße Vorbereitung der Reagenzien, falsche Verdünnung. Reagenzien nicht richtig durchgemischt. 1c. Kreuzkontamination zwischen Kontrollen. Methode überprüfen. Den Test Methode überprüfen. Den Test Sorgfältig pipettieren. Die Reagenzflascheverschlüsse nicht vertauschen. Den Test 1d. Falscher Lesefilter. Überprüfen, ob ein Lesefilter der Wellenlänge 450 nm eingesetzt ist. Wird kein Referenzfilter mit nm eingesetzt, dann erhöht sich die Extinktion um ca. 0,050. 1e. Interferenz in der Optik. Das Messgerät überprüfen. Den Grund der Vertiefungen reinigen oder trocknen. Prüfen, ob Luftblasen eingeschlossen sind. Die Ablesung 1f. Es wurden Komponenten aus unterschiedlichen Chargen verwendet. Keine Komponenten aus unterschiedlichen Chargen mischen, da diese spezifisch für jeden Chargen zusammengestellt sind. 1g. Reagenzien abgelaufen. Verfallsdatum des Kits und der dazugehörigen Komponenten prüfen. Keine Kits oder Reagenzien verwenden, deren Verfallsdatum abgelaufen ist. 2a. Ein Reagenz oder mehrere nicht oder in der falschen Reihenfolge hinzugefügt. 2b. Konjugat inaktiv: falsche Verdünnung oder unsachgemäße Konservierung. 2c. Mikrotiterplatte inaktiv: unsachgemäße Konservierung. 2d. Substrat inaktiv: unsachgemäße Konservierung oder Verdünnung, der verwendete Behälter beeinträchtigt die Stabilität des Substrats, Kreuzkontamination mit der Stopplösung. Methode überprüfen. Den Test Prüfen, ob es zu einer Kontamination gekommen ist, und Methode überprüfen. Den Test Die nicht verwendeten Streifen sind immer im verschließbaren Folienbeutel zusammen mit dem Trockenmittel aufzubewahren. Den Test Immer eine neu zubereitete TMB-Lösung im Substratpuffer verwenden. Einwegbehälter verwenden oder die Behälter mit Säure oder Ethanol auswaschen und mit desionisiertem Wasser ausspülen. Methode überprüfen. Den Test

8 bioelisa: Leitfaden zur Problemlösung Problem Mögliche Ursachen Lösung 3. Zu starke Färbung in allen Vertiefungen der Mikrotiterplatte. 4. Schlechte Reproduzierbarkeit oder erhöhte Anzahl reaktiver Proben, die sich nicht 3a. Substrat kontaminiert, oxidiert oder unsachgemäß vorbereitet. 3b. Reagenzien kontaminiert oder unsachgemäß zubereitet. 3c. Waschlösung (1x) kontaminiert. 3d. Waschen ungenügend oder nicht konsistent: Füllmenge und/oder Aspirieren ungenügend oder nicht einheitlich, Anzahl der Waschzyklen ungenügend. Wascher kontaminiert. 3e. Es wurde Waschlösung von einem anderen Hersteller verwendet. Prüfen, ob das vorbereitete Substrat rosafarben ist. Bei Blaufärbung nicht mehr verwenden. Vor Verwendung das TMB prüfen und sicherstellen, dass es vollkommen flüssig ist. Für eine vollständige Durchmischung des TMB im Substratpuffer sorgen. Einweg-Reagenzgläser oder Behälter verwenden oder diese mit Säure oder Ethanol auswaschen. Den Test Auf Kontamination prüfen (Trübung). Verdünnungen prüfen. Den Test Die Qualität des destillierten/deionisierten Wassers zur Herstellung der Verdünnung prüfen. Den Test Wascher prüfen. Die Vertiefungen bis zum Rand befüllen und vollständig aspirieren. Die Anzahl der Waschzyklen und die Einweichzeit erhöhen. Die umgekehrte Platte auf saugfähigem Papier ausklopfen. Den Test Nur die Waschlösung von biokit verwenden. 4a. Probleme beim Waschen. Siehe Abschnitte 3c, 3d, 3e. 4b. Pipetten schlecht kalibriert Nur kalibrierte Pipetten mit richtig oder Pipettenspitzen nicht eingesetzten Pipettenspitzen richtig eingesetzt. verwenden. Sorgfältig und ohne Unsachgemäße Blasen und Spritzer pipettieren. Pipettiertechnik. Den Test 4c. Reagenzien und Seren nicht auf Raumtemperatur oder vor Gebrauch nicht richtig gemischt. 4d. Mikrotiterplatten während der Inkubationen der Zugluft ausgesetzt. 4e. Zuviel Zeit bei der Zugabe von Proben und/oder Reagenzien. Inkonsistente Zeitintervalle. Luftblasen. 4f. Interferenzen in der Optik. Siehe 1e. Reagenzien und Seren auf Raumtemperatur bringen und vor Gebrauch gut mischen. Die Mikrotiterplatte vor Zugluft geschützt lagern. Eine einheitliche und konsistente Technik entwickeln.