Hygieneuntersuchungen in Tierbeständen
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- Ulrich Siegel
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1 Hygieneuntersuchungen in Tierbeständen Recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guineapig and rabbit breeding colonies Report of the FELASA 'Working Group on Anirnal Health Reprinted from LaboratotyAnimals (1994) 28, 1-12 Published on behalf of Labaratory Anirnals Ltd by Royal Society of Medicine Press 13
2 3. Viral infections 3.1 Mice Table 3a Viral infections to be serologically monitored in mouse breeding units No. Antigens Suitable test methods (alphabetical) 1 Minute Virus of mice (MVM) ELISA, HI, IFA 2 Mouse hepatitis Virus (MHV) ELISA, IFA 3 Pneumonia Virus of mice (PVM) ELISA, HI, IFA 4 Reovirus type 3 (Reo3) ELISA, IFA 5 Sendai Virus ELISA, HI, IFA 6 Theiler's murine encephalomyelitis Virus (TMEV) ELISA, HI, IFA 7 **Ectrornelia Virus ELISA, IFA 8 **Hantaviruses ELISA, HI, IFA 9 **Lactic dehydrogenase Virus (LDV) LDH plasma test 10 **Lymphocytic choriomeningitis Virus (LCM) ELISA, IFA 11 **Mouse adenovirus (MAd) ELISA, IFA 12 **Mouse rotavirus (EDIM) ELISA, IFA 13 **Mouse K Virus (K) ELISA, HI 14 **Mouse polyorna Virus ELISA, HI, IFA 15 **Mouse thymic Virus (MTV) ELISA, IFA 16 **Mouse cytomegalovirus (MCMV) ELISA, IFA **Viruses for which evidence exists of rare infections in European rnouse colonies. However, they should be tested in rederived or restocked colonies and in animals prior to use in Mouse Antibody Production (MAP) testing 3.2 Rats Table 3c Viral infections to be serologically monitored in rat breeding units No. Antigens Suitable test methods (alphabetical) 1 Hantaan virus ELISA, HI, IFA 2 Kilham rat virus (KRV) HI, (ELISA, IFA)** 3 Pneumonia Virus of mice (PVM) ELISA, HI, IFA 4 Reovirus type 3 (Reo3) ELISA, IFA 5 Sendai Virus ELISA, HI, IFA 6 Sialodacryoadenitis (SDA)/Rat coronavirus (RCV) ELISA, IFA 7 Theiler's murine encephalomyelitis Virus (TMEV) ELISA, HI, IFA 8 Toolan (H-1) **In the case of rat parvoviruses (KRV, H-1) antibodies to these viruses may crossreact with antigens in IFA and ELISA. However, these infections can be differentiated by specific HI tests 14
3 4. Bacterial, mycoplasrnal and fungal infections 4. 1 Methodology Cultural methods Bacteriological investigations must always include non-selective media, e.g. blood agar. Selective and enriched media must be used in addition to non-selective media for routine and special or confirmatory investigations. Aerobic culture conditions are sufficient for most bacteria. Where possible, identification of micro-organisms should proceed to the specific name e.g. Pasteurella pneumotropica or Mycoplasma pulmonis Serological methods Serological methods exist for the detection of antibodies to various bacterial pathogens, e.g. Bacillus piliformis, mycoplasmas and Leptospira spp. Treponema cuniculi in rabbits may be monitored using T. pallidum or cardiolipin antigens Pathological methods In certain cases, e.g. CAR bacillosis, histopathology may be the only suitable method of detection. 4.2 Samples to be investigated Samples from the following organs must be cultured. nasal turbinates/nasopharinx, trachea, prepuce/vagina, caecum. In addition, serum is sampled for the detection of antibodies to Bacillus piliformis, mycoplasmas and Leptospira spp. 4.3 Bacterial, mycoplasmal and fungal infections to be monitored in mice and rats Bordetella bronchiseptica Citrobacter freundii (4280) - mouse only Corynebacterium kutscheri *Leptospira (icterohaemorrhagiae, ballum, canicola, hebdomadis)-serology Mycoplasma spp. cultivation in case of positive serology Pasteurella spp Salmonellae Streptobacillus moniliformis Streptocci-?-haemolytic (except D group) (designation of Lancefield Group) Streptococcus pneumoniae Tyzzer's disease (clinical disease/ pathological lesions/serology**) *To be scrcened only once per year **Results of serology are currently controversial Additional considerations Examples of add. microorganisms to be monitored -when associated with lesions, -when associated with clinical signs of disease, -when there is evidence of perturbation of physiological parameters or breeding performance, -when using spontaneously immunodefieient animals. CAR bacillus Dermatophytes Escherichia coli Klebsiella pneumoniae l oxytoca Pneumocystis carinii Proteus spp. Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Yersinia pseudotuberculosis 15
4 An agent must be declared as present if it is identified in one or more of the animals screened. The results must continue to be reported as positive at subsequent screens until the agent has been eradicated by means of e.g. rederivation or restocking. An agent reported as present need not be monitored at subsequent screens but it must be declared in subsequent reports. Hygieneuntersuchungen im Labor Einleitung Die Ergebnisse von Tierversuchen werden durch verschiedene Faktoren beeinflusst. Neben der Versuchsanordnung gehören die Genetik der Tiere und ihre belebte und unbelebte Umwelt dazu. Um Rückschlüsse aus den Resultaten von Tierversuchen auf das Experiment ziehen zu können, müssen die Auswirkungen der Zusatzfaktoren möglichst gering gehalten werden. Zu den Faktoren der unbelebten Umwelt gehören Temperatur, Lichtzyklus, Luftfeuchtigkeit, Fütterung, Käfige usw. Diese Einflüsse sind heute auch in kleineren Tierhaltungen weitgehend standardisiert. Der heute wohl wichtigste Störfaktor in der biomedizinischen Forschung stellt die belebte Umwelt, das heisst der mikrobiologische Status, der Versuchstiere dar. Infektionserreger und fakultativ pathogene Keime können Tierversuche aufs Empfindlichste stören, meist ohne dass es dabei zu Krankheitsausbrüchen kommen muss. Ubiquitär vorkommende Keime führen bei immundefizienten Tieren nicht selten zu schweren Erkrankungen. Es gibt transgene Mäusestämme, die überhaupt nur unter SPF-Bedingungen gehalten und gezüchtet werden können. Inapparente wie apparente Infektionen können zur Kontamination von biologischen Materialien, wie Gewebekulturen, Zellinien, transplantablen Tumoren und biologischen Produkten führen. Einige Krankheiten der Versuchstiere gehören zu den Zoonosen. Somit ist die Hygieneüberwachung von Versuchstieren von grosser Bedeutung. Sie vermindert das Risiko von Zoonosen und trägt zur Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit von Forschungsdaten bei. In Europa sind Bestrebungen für die Vereinheitlichung der Hygieneüberwachung von Versuchstierhaltungen im Gang. Die Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) hat in den letzten Jahren verschiedene Empfehlungen über das Vorgehen bei den einzelnen Tierarten und die zu untersuchenden Keime veröffentlicht. Diese Empfehlungen beinhalten auch Angaben über die Stichprobenauswahl und die Testmethoden. Die FELASA Empfehlungen sind nicht absolut verbindlich. Je nach örtlichen Gegebenheiten und Möglichkeiten des Labors kann das Vorgehen in den verschiedenen Kontrollabors etwas abweichen. 16
5 Die Hygieneüberwachung beinhaltet sowohl die Untersuchung von Tieren als auch die ihrer Umgebung. Tierkontrollen, Hygienestatus Die Routinekontrolle von Tieren umfasst die Untersuchung einer repräsentativen Stichprobe von gesunden Tieren. Für die Hygienekontrolle werden häufig alte Zuchttiere verwendet, da diese wegen ihrer langen Verweildauer im Bestand und ihrer abnehmenden Immunkompetenz ein breites Erregerspektrum aufweisen. Ausser für serologische Untersuchungen sind aber auch frisch abgesetzte Jungtiere gut geeignet. Durch den Wegfall der maternalen Antikörper und das Fehlen eigener Antikörper nach dem Absetzen sind Jungtiere in diesem Alter besonders infektionsanfällig. In Zuchten von transgenen Mäusen werden oft die nach der Genotypisierung überzähligen Tiere für die Hygienekontrolle eingesetzt. Die Tiere werden aus möglichst verschiedenen Tierräumen und Käfigen der gleichen hygienischen Einheit entnommen. Die erforderliche Stichprobengrösse wird nach statistischen Methoden berechnet und kann aus Tabellen abgelesen werden (vgl. Tabelle). Sie richtet sich nach der Grösse des Bestandes, dem Ausbreitungsgrad einer möglichen Infektion und dem Untersuchungsintervall. Bei einem Bestand von über 100 Tieren wird mit der Routineuntersuchung von 10 Tieren eine Infektion mit einer Infektionsrate von 30% mit 97%iger Sicherheit erfasst. Bei 4 Untersuchungen pro Jahr kann eine Infektion mit einer Prävalenz von 10% mit nahezu 99%iger Sicherheit festgestellt werden. Wertvolle Zusatzinformationen liefern ausserdem kranke Tiere. Nach Möglichkeit sollten alle kranken Tiere zur Sektion gelangen, damit auftretende Infektionen frühzeitig erfasst werden können. Auch die Abklärung von nicht infektiösen Krankheiten ist wichtig, da Tiere mit vererbbaren Krankheiten von der Zucht ausgeschlossen werden müssen. Die mikrobiologische Gesundheitsüberwachung umfasst bakteriologische, parasitologische, virologische und histologische Untersuchungen (vgl. Abbildung). Die Ergebnisse der Hygienekontrollen werden im sogenannten Hygienestatus zusammengefasst. Der Hygienestatus liefert dem Forscher wertvolle Informationen über den Gesundheitszustand seiner Tiere. Beim Zukauf von Tieren gibt der mitgelieferte Hygienestatus dem Tierhalter Auskunft, in welcher Hygienezone er die Tiere unterbringen kann. Sentineltiere Sentineltiere sind Anzeigetiere. Sie werden in Bestände eingesetzt, um festzustellen, ob darin Infektionserreger vorhanden sind. Sie kommen dann zum Einsatz, wenn aus dem zu untersuchenden Bestand keine Tiere zur mikrobiologischen Untersuchung abgegeben werden können (z.b. Tiere im Versuch, transgene Tiere, kleine Populationen). Ist der Bestand mit einem Krankheitserreger infiziert, soll der Erreger durch eine Übertragung auf die Sentineltiere nachgewiesen werden. 17
6 Auswahlkriterien für Sentineltiere und Haltungsbedingungen: - Gleiche Tierart wie die des zu untersuchenden Bestandes - SPF-Tiere mit bekanntem Hygienestatus (evtl. keimfreie Tiere) - Stamm: Allgemeine Hygienekontrolle: Auszuchtstamm Nachweis eines best. Erregers: Inzuchtstamm - Gleiche Haltungsbedingungen wie der Rest des Bestandes - Zur Begünstigung einer Infektionsübertragug werden die Sentineltiere auf gebrauchte Einstreu aus anderen Käfigen gesetzt. - Käfige möglichst weit unten auf dem Gestell, gleichmässig über den Raum verteilt - Käfige mit Sentineltieren immer zuletzt wechseln - Verweildauer in dem zu untersuchenden Bestand: mindestens 4 Wochen - Vorsicht: Erregereinschleppung. Opportunistische Keime können bei immundefizienten Tieren eine Erkrankung hervorrufen (z.b. Staph. aureus) Auswirkungen von Mikroorganismen auf Versuchsresultate Die Auswirkungen von Mikroorganismen auf die Tierversuche sind vielfältig. Sie reichen von der Verschiebung einzelner physiologischer Parameter bis zum Tod des Tieres. Ob ein Keim einen Einfluss auf die Ergebnisse hat, hängt vom Tierstamm und von der Fragestellung ab und muss im einzelnen abgeklärt werden. Die langfristigen Versuche, wie sie in der Toxikologie oder in der Gerontologie durchgeführt werden, sind mehr gefährdet als die kurzfristigen, akuten Versuche. Auch für die Infektionsversuche und die immunologisch ausgerichteten Versuche droht von der mikrobiellen Komponente grössere Gefahr als für die Versuche anderer Fragestellungen. Mögliche Auswirkungen mikrobieller Faktoren bei Tierversuchen (Kunstyr L., 1991): 1. Tod der Tiere, dadurch Abbruch des Versuchs 2. Erkrankung der Tiere, dadurch Abbruch des Versuchs 3. Bei infizierten, aber nicht erkrankten Tieren Verfälschung der Ergebnisse durch: - Immunmodulation (Stimulierung oder Suppression) - Interferenz - Antagonismus - Synergismus (Potenzierung) - Organschädigung (bei histologischer Beurteilung) - Sensibilisierung (zu den Versuchsnoxen) - Verdrängung des ursprünglich studierten Erregers durch einen anderen - Verkürzung der Lebensdauer der Versuchstiere (bei Langzeitversuchen) - Veränderungen von hämatologischen Werten - Erhöhung von Plasmaenzymen - Erhöhung oder Senkung der Tumorrate (bei experimenteller Carcinogenese) - Bildung von Immunkomplexen, eventuell deren Ablagerung in den Nieren - Gefährdung des Personals durch Zoonoseerreger - Verunreinigung biologischer Produkte (Transplantationstumoren, monoklonale Antikörper, Zellkulturen, Impfstoffe u.a.) 18
7 Tabelle: Vertrauensintervalle für den Nachweis einer Infektion bei unterschiedlichen Stichprobengrössen und Infektionsraten a 19
8 Literatur Bhatt P.N., Jacoby R.O., Morse A.C. III, New A.E. Ed. (1986): Viral and mycoplasmal infection of laboratory rodents: Effects on biomedical research. Academic Press, San Diego, Ca. Boot R., Koopman J.P., Kunstyr I. (1993): Microbiological standardization. In: Principles of laboratory animal science. A contribution to the humane use and care of animals and to the quality of experimental resul ts. Ed. L.F.M. van Zutphen, V. Baumans, A.C. Beynen. Verlag Elsevier, Amsterdam-London-New York-Tokio, Friedhoff K.T., Kunstyr I., Maess J., Bonath K. (1983): Parasitologische Probleme in Versuchstierbeständen. In: Schwerpunkte der Infektionsüber wachung in Versuchstierbeständen. Ed. K. Bonath. Schriftenreihe Versuchstierkunde Nr. 10. Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg, Gesellschaft für Versuchstierkunde (1973): Nr. 3, Liste von Nachweismethoden zur Ueberprüfung von SPF-Versuchstieren auf Freisein von Erregern. Veröffentlichungen der Gesellschaft für Versuchstierkunde, Basel. Gesellschaft für Versuchstierkunde (1985): Nr. 2, Liste von Erregern zur Spezifizierung bei SPF -Versuchstieren, 3. Aufl., Veröffentlichungen der Gesellschaft für Versuchstierkunde, Basel. Gesellschaft für Versuchstierkunde (1989): Nr. 11, Mikrobiologische Diagnostik bei Laboratoriumstieren, 1. Aufl., Verlag GV -SOLAS, Biberach a. d. Riss. Güttner J. (1989): Postmortale Untersuchung der Versuchstiere. In: Angewandte Versuchstierkunde. Ed. H. Heinecke. Verlag Gustav Fischer, Stuttgart -New York, Hamm, T.E. Jr., Ed. (1986): Complications of viral and Mycoplasmal infections in rodent toxicology research and testing. Hemisphere Publishing Corporation. Jacoby R.O., Fox J.G. (1984): Viral Diseases. In: Laboratory Animal Medicine. Ed. J.G. Fox, B.J. Cohen, F.M. Loew. Academic Press, Kraft V., Deeny A.A., Blanchet H.M., Boot R., Hansen A.K., Hem A., van Herck H., Kunstyr I., Milite G., Needham J.R., Nicklas W., Perrot A., Rehbinder C., Richard Y., De Vroey G. (1994): Recommendations for health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit breeding colonies. Lab. Anim. 28, Kunstyr I. (1983): Schwerpunkte der bakteriologischen Ueberwachung von Versuchstierbeständen. In: Schwerpunkte der Infektionsüberwachung in Versuchstierbeständen. Ed. K. Bonath. Schriftenreihe Versuchstierkunde Nr. 10. Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg, Kunstyr I. (1991): Mikrobielle Faktoren als Variationsquelle bei Versuchstieren. In: Qualitätskriterien der Versuchstierforschung. Ed. K. Gärtner. Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG, Sonderforschungsbereiche. VCH Verlagsgesellschaft Weinheim Deutschland,
9 Laber-Laird K., Proctor M. (1993): An example of a rodent health monitoring program. Lab. Animal 22, Loew F.M., Fox J.G. (1983): Animal health surveillance and health delivery systems. In: The mouse in biomedical research, Vol III. Ed. H.L. Foster, J.D. Small, J.G. Fox. Academic Press, New York, Lussier G. (1991): Detection methods for identification of rodent viral and mycoplasmal infections. Lab. Anim. Sci. 41, Merkenschlager M. (1971): Anforderungen an den mikrobiologischen Status von Versuchstieren. In: Grundinformationen über Versuchstierfragen, Mitteilung I. Ed. Kommission für Versuchstierforschung, Deutsche Forschungsgesellschaft DFG. Boldt Druck Boppard, Militzer K., Pittermann W. (1983): Pathologisch-diagnostische Aspekte bei der Ueberwachung von Versuchstierbeständ en - Arbeitsmethoden und Ergebnisse. In: Schwerpunkte der Infektionsüberwachung in Versuchstierbeständen. Ed. K. Bonath. Schriftenreihe Versuchstierkunde Nr. 10. Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg, Rehbinder C., Baneux P., Forbes D., van Herck H., Nicklas W., Rugaya Z., Winkler G. (1995): FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, gerbil, guinea pig and rabbit experimental units. Lab. Anim. 30, Schwanzer V., Maess J. (1983): Virologische Ueberwachung von Versuchstierbeständen - Maus und Ratte. In: Schwerpunkte der Infektionsüberwachung in Versuchstierbeständen. Ed. K. Bonath. Schriftenreihe Versuchstierkunde Nr. 10. Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg, Small J.D. (1984): Rodent and lagomorph health surveillance - Quality assurance. In: Laboratory animal medicine. Ed. J.G. Fox, B.J. Cohen, F.M. Loew. Academic Press, New York, Wyss-Spillmann S., Homberger F.R. (1995): Vorgehen bei der Hygiene - Überwachung in einer Zuchtanlage für spezifiziert pathogen freie Mäuse und Ratten. Schweiz. Arch. Tierheilk. 137,
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