LIPOPRINT - LDL Subfraktionen Test (FDA-approved) - HDL Subfraktionen Test (Research use only)

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1 - LDL Subfraktionen Test (FDA-approved) - HDL Subfraktionen Test (Research use only) Nemo Muniz, Quantimetrix Corp., Redondo Beach, USA, Andreas Corell, Alphascience GmbH, Riedstadt. überarbeitet Juli 2014

2 INZIDENZ VON ATHEROGENEN RISIKEN Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die häufigste Todesursache in Deutschland. Jedes Jahr leiden mehr als eine Million Deutsche an den Folgen eines Herzinfarktes starben Menschen ( Männer und Frauen) in Deutschland an Herz- Kreislauf-Erkrankungen. Dies entspricht rund 40,2 % der gesamten Todesfälle. (Quelle: Statistisches Bundesamt, ) 2

3 INZIDENZ VON ATHEROGENEN RISIKEN Wissenschaftliche Studien haben klar ergeben, das Lipide und Lipoproteine neben genetischen Ursachen und Umwelteinflüssen deutlich atherogenen Krankheitsbildern assoziiiert sind. 3

4 HERKÖMMLICHES LIPID - PROFIL NCEP* ATP** III Richtlinien für akzeptable Lipidwerte: Gesamt-Cholesterin < 200 mg/dl Triglyzeride < 150 mg/dl LDL Cholesterin < 130 mg/dl (Ideal < 100 mg/dl) HDL Cholesterin > 40 mg/dl (Ideal > 60 mg/dl) *National Cholesterol Educational Program (USA); **Adult Treatment Panel III von 2004(Panel IV in Vorbereitung) 4

5 GUTES UND SCHLECHTES CHOLESTERIN Bislang war die folgende Sichtweise üblich: LDL Cholesterin (Schlecht) HDL Cholesterin (Gut) 5

6 DAS PROBLEM... Bislang berücksichtigte Risikofaktoren geben nicht die ganze Wahrheit wieder: Es steht fest, das etwa 50% der atherogenen Erkrankungen mit normalen Lipidwerten einhergehen Nur etwa 30% der Herzinfarkte können alleine durch Bestimmung des Gesamtcholesterins erklärt werden 6

7 LIPIDTRANSPORT Lipide findet man nicht frei im Blutkreislauf Cholesterin, Triglyzeride und Phospholipide werden in als Lipoproteine bezeichneten Partikeln transportiert Die Lipoproteine unterscheiden sich in Größe, Dichte und chemischer Zusammensetzung 7

8 LIPOPROTEIN Klassen Man unterscheidet, ausgehend von ihrer Größe und Dichte, 5 verschiedene Klassen von Lipoproteinen Chylomikronen (engl. Chylomicrons) VLDL (very low density lipoprotein) IDL (intermediate density lipoprotein) LDL schlechtes (low density lipoprotein) HDL gutes (high density lipoprotein) 8

9 LDL PARTIKEL LDL- Partikel sind die primären Transportpartikel für Cholesterin im Körper und damit lebensnotwendig. Triglycerides Bioch.szote.u-szegedhu/astrojan/Prot/Ld.jpg 9

10 HDL PARTIKEL HDL Partikel sind für das Entfernen von überschüssigem Cholesterin aus dem Körper verantwortlich A, C and E 10

11 LIPOPROTEIN KLASSEN UND Subfraktionen Chylomikronen: kontinuierliche Partikelgrößen VLDL: kontinuierliche Partikelgrößen IDL: Drei Subfraktionen LDL: Sieben Subfraktionen HDL Bis zu zehn Subfraktionen 11

12 Gutes und schlechtes LDL Large Buoyant LDL Subfraktionen 1 und 2 enthalten das gute oder normale LDL, das für den Transport von Cholesterin im Körper zuständig ist. Small Dense LDL Subfraktionen 3 bis 7 umfassen das schlechte oder anormale LDL, das leicht oxidiert werden kann und atherogene Erkrankungen fördert. 12

13 Risiko kardiovaskulärer Erkrankungen Normale LDL-Werte garantieren nicht in allen Fällen für ein niedriges Risiko von atherogenen Erkrankungen. Das Vorherrschen von Small Dense LDL (Subfraktionen 3 bis 7) kann zu einem dreifach erhöhten Risiko für Herzinfarkte führen. (Austin M A, et al, JAMA,1988). 13

14 Methoden zur Bestimmung von LDL- Subfraktionen 14

15 Methoden zur Bestimmung von Lipoprotein-Subfraktionen Kontinuierliche Gradienten Ultrazentrifugation (sogenannter Gold Standard ) Verteilung verschiedener Lipoprotein- Partikel aufgrund ihrer Dichte Wird vor allem in der Grundlagenvorschung angewandt Technisch sehr aufwändig Gradienten Gel Electrophoresis (GGE, übliche Methode) LDL Subfraktionen und vorherrschende Partikelgröße Nur Qualitative Analyse der LDL-Subfraktionen 15

16 Inhouse Methoden (ohne FDA Zulassung) Kernmagnetresonanz (NMR) Verteilung der LDL-Partikelgrößen aufgrund mathematischer Auswertung desnmr-signals Bestimmung der LDL-Partikelanzahl Technisch sehr aufwändig 16

17 LIPOPRINT TEST FDA zugelassen LIPOPRINT - LDL Der einzige Test zur Bestimmung der Cholesterinwerte in allen Lipoprotein- Subfraktionen mit FDA-Zulassung 17

18 LIPOPRINT TEST FDA zugelassen Das Quantimetrix Lipoprint System LDL Subfractions dient der Bestimmung von Lipoprotein-Cholesterinwerten (Lipopotein-Fraktionen und Subfraktionen von VLDL bis HDL) in Serum oder Plasma bei Gesamt- Cholesterinwerten von 100 mg/dl und höher. 18

19 Der LIPOPRINT LDL TEST Anwendung: Die Bestimmung der Werte für Lipoprotein - Subfraktionen dient zusammen mit anderen Lipid- Testen dazu, Fehlfunktionen des Lipid-Metabolismus zu erkennen, das individuelle Patientenrisiko zu behandeln, zu klinischen Evaluierungen. 19

20 Testprinzip: Genutzt wird eine nicht-denaturierende, lineare Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE) zur Bestimmung der Lipoproteinklassen und ihrer Subfraktionen aus Serum oder Plasma. Die Auftrennung erfolgt nach den jeweiligen, unterschiedlichen Größen der Lipoproteinpartikel. 20

21 Testprinzip: Ein lipophiler* Farbstoff bindet vor der Elektrophorese an das Cholesterin der Lipoprotein-Partikel. Die Elektrophoreseröhrchen werden zur Bestimmung des relativen Anteils jeder Lipoprotein-Subfraktion gescannt. Der jeweils dazugehörige Wert wird aufgrund des Gesamt-Cholesterinwerts der Probe errechnet. (*= fett liebenden ) 21

22 LIPOPRINT LDL SYSTEM Systemkomponenten: 22

23 LIPOPRINT LDL SYSTEM Systemkomponenten: Elektrophoresekammer 23

24 LIPOPRINT LDL SYSTEM Systemkomponenten: Elektrophoresekammer Prep. Ständer 24

25 LIPOPRINT LDL SYSTEM Systemkomponenten: Elektrophoresekammer Prep. Ständer Prep. Lampe 25

26 LIPOPRINT LDL SYSTEM Systemkomponenten: Elektrophoresekammer Prep. Ständer Prep Lampe Netzgerät 26

27 LIPOPRINT LDL SYSTEM Systemkomponenten: Elektrophoresekammer Prep. Ständer Prep Lampe Netzgerät Digitaler Scanner 27

28 LIPOPRINT LDL SYSTEM Systemkomponenten: Elektrophoresekammer Prep. Ständer Prep Lampe Netzgerät Digitaler Scanner imac + Software 28

29 LIPOPRINT LDL SYSTEM Systemkomponenten: Elektrophoresekammer Prep. Ständer Prep Lampe Netzgerät Digitaler Scanner imac + Software Drucker 29

30 LIPOPRINT LDL REAGENTIEN KIT Lipoprint Kit: 30

31 LIPOPRINT LDL REAGENTIEN KIT Lipoprint Kit: Gel Röhrchen (gebrauchsfertig) 31

32 LIPOPRINT LDL REAGENTIEN KIT Lipoprint Kit: Gel Röhrchen (gebrauchsfertig) Lade-Gel (gebrauchsfertig) 32

33 LIPOPRINT LDL REAGENTIEN KIT Lipoprint Kit: Gel Röhrchen (gebrauchsfertig) Lade-Gel (gebrauchsfertig) Puffer (vorgemischt) 33

34 Probenmaterialien Es sollten nur Proben nüchterner Patienten (Nahrungskarenz mindestens 12 Stunden) verwendet werden. Es können sowohl Serum- als auch EDTA-Proben verwendet werden Es darf kein Heparin als Antikoagulanz zugesetzt sein! Proben können bis zu 7 Tagen bei 2 8 C aufbewahrt werden. 34

35 Testablauf Die vier Schritte des Lipoprint Tests: Elektrophorese Scan Analyse Ergebnis-Report 35

36 Testablauf Laden der Probe Entsprechende Anzahl Gelröhrchen in den Ständer stellen. Je 25µl Probe in die Gelröhrchen geben. 200µl Ladegel hinzu pipettieren 36

37 Testablauf Mischen der Probe Gelröhrchen mit Parafilm abdecken, Deckel aufstecken. Probe mit dem Ladegel mischen (Ständer 5-7mal langsam umkippen). 37

38 Testablauf Photo- Polymerisierung Ständer mit den Gelröhrchen möglichst dicht vor die Präparationslampe stellen. Gelröhrchen für mindestens 30, maximal 40 Minuten photopolymerisieren lassen. Der Farbstoff bindet an die Lipoproteinpartikel 38

39 Testablauf Laden der Kammer Gelröhrchen aus dem Probenvorbereitungsständer entnehmen. Gelröhrchen in die obere Elektrophoresekammer laden. 39

40 Testablauf Elektrophorese Elektrolytpuffer in die untere und die obere Kammer geben. Elektrophorese für 1 Stunde bei 3mA pro Gelröhrchen. 40

41 Die Lipoprotein-Subfraktionen sind getrennt large LDL small LDL VLDL MID bands LDL bands HDL 41

42 Testablauf Scannen der Gelröhrchen Elektrophoreseröhrchen für 30min im Probenständer in der Dunkelheit ruhen lassen. Elektrophoreseröhrchen in den Scanner laden. Scannen 42

43 Digitale Bilderzeugung Es wird ein digitalisiertes Bild der Elektrophoreseröhrchen gewonnen. 43

44 Analyse der erzeugten Bilder Automatische Analyse einer Patientenprobe Eingabe des Patientennamens bzw. der Patientennummer und des Gesamt-Cholesterinwerts. Analyse der Scans Erstellen des Patientenprofils. Ausdruck der Profile. 44

45 Die Lipoproteinbanden sind aufgetrennt Bis zu 12 Lipoproteinbanden können ihrer Größe entsprechend getrennt werden (1 VLDL, 3 Mittlere Banden, 7 LDLs and 1 HDL) VLDL wandert nur bis zum oberen Rand des Trenngels, Rf = 0, und HDL wandert bis zur Front Rf = 1 Mittlere Banden und LDL Subfraktionen wandern mit spezifischen Geschwindigkeiten zwischen VLDL and HDL 45

46 LIPOPRINT PROFIL Es wird eine leicht zu interpretierende Kurve des Lipoproteinprofils des betreffenden Patienten erstellt und ausgedruckt. 46

47 Erstellen einer Tabelle der Testergebnisse Analyse der Scans Die Lipoware Software analysiert die Proben Sie berechnet die relative Fläche jeder Subfraktion Der Cholesterinwert für jede Subfraktion wird berechnet Es wird eine Tabelle mit allen Ergebnissen erstellt 47

48 Interpretation des Profils 48

49 Normales Typ A Profil VLDL: Enthält vorwiegend Triglyzeride Mid Band C, B, A: Intermediate density lipoprotein (IDL) LDL Subfraktionen s 1 and 2: Findet sich in den meisten Seren, large, buoyant LDL (Gelb) Phänotyp: Typ A HDL Das Gute Cholesterin Gesamtcholesterin, mit anderer Methode bestimmt 49

50 Anormales Profil Typ B Cholesterol mg/dl: Quantifizierung der Cholesterinwerte für jede Lipoproteinfraktion und ihresubfraktionen Subfraktionen 3 7: Small dense LDL, gefährliches LDL HDL: Direkte Bestimmung des HDL (Grün) Phänotyp: Kein Typ A (Small LDL herrscht vor) Referenzwerte: Alle Parameter mit oberhalb des Normalbereiches (auf ATP III basierend) werden markiert 50

51 Andere atherogen wirksame Lipoproteine Triglyzeride anreichernde Lipoproteine Chylomikronen-Überreste VLDL Überreste Intermediate Density Lipoproteins (=Lipoproteine mittlerer Dichte) 51

52 TYP III Dislipidämie (erhöhtes IDL) 52

53 Vergleich mit anderen Methoden Welche Bande entspricht welcher Fraktion? 53

54 Chylomikronen, VLDL und jeweilige Überreste LDL > 30 nm nm Potenziell atherogen HDL 9 15 nm Potenziell antiinflammatorisch 54

55 Anordnung der Banden im Gelröhrchen VLDL MID C, B, A Banden(von oben nach unten, VLDL-remnants (= -Überreste) in MID C, Ap (a) kann in B und A sein) LDL 1-7 Banden HDL 55

56 Zuordnung der Banden im Lipoprint-Profil und in der UZ Lipoprint-Bande UZ-Fraktion VLDL MID-C MID-B MID-A VLDL VLDL-Überreste IDL, Lipoprotein (a) IDL, Lipoprotein (a) LDL 1-7 LDL 1-3 HDL HDL 56

57 Zusammenfassung der jeweiligen Zuordnungen: 1) Die Ulltrazentrifugation unterscheidet rein nach der Dichte der Fraktionen zwischen Chylomikronen, VLDL, VLDL-remnants, IDL, großen LDL-Partikeln, kleinen LDL-Partikeln, Apolipoprotein (a) und HDL 2) Chylomikronen sammeln sich im Lipoprint-Profil oberhalb der VLDL-Bande. Sie werden nicht quantifiziert, es besteht kein Zusammenhang zwischen Färbung und Partikelzahl 3) VLDL-remnants finden sich in der MID-C-Bande 4) Die IDL-Fraktion der UZ entspricht den MID-A und B Banden 5) Lipoprotein (a) ist zwar dichter als LDL, aber gleichzeitig größer, daher befindet es sich ebenfalls in der MID-B und der MID-A-Bande im Lipoprint-Profil 57

58 Vergleich Frederickson-Klassifikation und Lipoprint: Normal: Alle Fraktionen und Subfraktionen im Normalbereich Typ I: Vorwiegend Chylomicronen; kein oder wenig VLDL, LDL und HDL Typ IIA: Normales VLDL and IDL; meistens erhöhtes LDL-1 and LDL-2 Typ IIB: Manchmal Erhöhung des VLDL; erhöhte IDL und anderer LDL Subfraktionen Typ III: Erhöhtes VLDL; starke Erhöhung des IDL und reduzierte LDL Subfraktionen Typ IV: Erhöhtes VLDL, normales IDL und erhöhte kleine LDL- Subfraktionen (3-7) Typ V: Erhöhte Chylomicronen und VLDL; niedriges LDL, möglicherweise mit einigen kleinen LDL Subfraktionen 58

59 Warum sollten die LDL-Subfraktionen gemessen werden? 59

60 Screening Das Testen der LDL- Subfraktionen kann das Risiko atherogener Erkrankungen weit besser abklären als herkömmliche Lipidprofile Das Risiko kann bei normalen Lipid-Gesamtwerten bestehen. 60

61 Behandlungsentscheidungen Unterschiedliche Profile erfordern unterschiedliche Behandlungen Statine reduzieren den Gesamtcholesterinwert und die Anzahl von Lipoproteinpartikeln Niacin and Fibrate ändern die Verteilung von kleinen atherogenen Partikeln hin zu großen, weniger atherogenen Kombinierte Therapie Das Gleiche gilt für diätische Therapien 61

62 Theapiebegleitung Das Profil hilft dem Arzt und dem Patienten den Erfolg der Behandlung zeitlich zu verfolgen: Vor der Behandlung: Nach 3 Monaten Behandlung: 62

63 Fallbeispiele 63

64 Normales Profil 64

65 Dislipidämie 65

66 PATIENT 1 GB, ein 65-jähriger, kaukasischer Mann, Lipoprint Profil von Januar 2001 (Abb. 1). Das Profil zeigt kleine, dichte LDL Partikel (Rot), eine Dislipämie anzeigend. Figure 1. GB s Baseline Lipoprint Profile 66

67 PATIENT 1 (Forts.) Nach 3 Monaten Behandlung mit Niacin, kombiniert mit diätischen Maßnahmen und mehr körperlicher Bewegung, zeigte der Patient ein wesentlich verbessertes Profil (Abb. 2). Die Lipoprotein-Verteilung war normal, lediglich zwei Cholesterinwerte waren leicht außerhalb des Normalbereichs. Figure 2. GB s after 3 Months of Intervention 67

68 PATIENT 2 Ein 42 jähriger, indianischer Mann hatte im Juni 2003 das Lipoprint Profil auf Abb. 3. Das Profil zeigte in vielen Fraktionen hohe Cholesterinwerte und eine Verteilung hin zu kleineren, dichteren Partikeln (orange und rot), eine Dislipämie aufzeigend. Figure 3. JS s Baseline Lipoprint Profile 68

69 PATIENT 2 (Forts.) Nach zwei Monaten einer vorwiegend vegetarischen Diät mit Zufuhr von Sojaproteinen und verstärkter Bewegung zeigte der Patient ein weitgehend normales Profil mit lediglich leicht erhöhtem LDL-2 (Abb. 4). Figure 4. JS s after 2 Months of Diet and Exercise 69

70 PATIENT 3 Das Lipoprint Profil auf Abb.5 entstand 6 Wochen vor dem tödlichen Herzinfarkt eines auf den ersten Blick gesunden, 50jährigen Mannes hispanischer Abstammung (Nichtraucher!). Figure 5. RP s Baseline Profile, 6 Weeks before His Fatal Infarct 70

71 Wer sollte ein LIPOPRINT PROFIL erhalten? 71

72 Wer sollte ein LIPOPRINT Profil erhalten? Jeder mit zwei oder mehr der folgenden Risikofaktoren 1 Fortgeschrittenes Alter: 84 % der an koronarer Herzerkrankung Sterbenden ist 65 Jahre alt oder älter Geschlecht: Männer (45 Jahre oder älter) haben ein höheres Infarktrisiko als Frauen (55 Jahre oder älter) 2 Abstammung (einschl. ethnischer Herkunft): Familiäre Geschichte von frühen Herzerkrankungen (Vater oder Bruder vor einem Alter von 55 betroffen, Mutter oder Schwestern vor einem Alter von 65 betroffen 65) 2 Afroamerikaner, Mexicoamerikaner, amerikanische Indianer, gebürtige Hawaiianer und einige asiatische Amerikaner haben ein höheres Risiko für Herzerkrankungen. 72

73 Wer sollte ein LIPOPRINT Profil erhalten?(forts.) Tabakkonsum Raucher und Tabakrauch-exponierte Nichtraucher haben ein erhöhtes Risiko für Herzerkrankungen Hohe Blutwerte für Cholesterin 2 und Triglyzeride 1 - Gesamtcholesterin (> 200 mg/ dl) - Hohe LDL ( schlechtes") Cholesterin (>100 mg/dl) - Niedrige HDL ("gutes") Cholesterin (<40 mg/dl) - Triglyzeride (> 150 mg/dl) Hoher Blutdruck 3 Blutdruck 140/90 mmhg oder höher Physisch inaktiv Passiver Lebensstil 73

74 Wer sollte ein LIPOPRINT Profil erhalten?(forts.) Adipositas und Übergewicht 2 - Übergewicht = Body Mass Index (BMI) von > Adipositas = BMI von 30 oder mehr Diabetes Mellitus Hoher Alkoholkonsum Stress

75 Wer ordnet das LIPOPRINT PROFIL an? 75

76 An LIPOPRINT interessierte Ärzte Kardiologen Endokrinologen Internisten Präventionsmediziner Allgemeinmediziner Wellness Research Behandlung und Effizienz der Therapie Prävention und Therapiebegleitung bei Diabethes Typ II Identifizieren, leiten Behandlung ein und beobachten Therapiefortschritt Prävention kardiovaskulärer Erkrankungen und damit einhergehender Begleiterscheinungen Vorabklärung Vorsorge Klin. u. Pharmazeut. Forschung 76

77 Ergänzende TESTS Andere, ergänzende Lipid Tests Triglyzeride OX-LDL Lipoprotein (a) Apolipoprotein A I Apolipoprotein B Homozystein High Sensitive C-Reactive Protein (hscrp) 77

78 Andere Anwendungen Tierversuche bzw. Veterinärmedizin (Normale Ernährung versus stark fetthaltige Diät) 78

79 LIPOPRINT HDL Nur für die Forschung Nicht für diagnostische Zwecke 79

80 Lipoprint HDL Bis zu zehn Subfraktionen können identifiziert werden: Large HDL (Subfraktionen 1 bis 3) Intermediate HDL (Subfraktionen 4 to 7) Small HDL (Subfraktionen 8 to 10) 80

81 Lipoprint HDL Subfraktionen For Research Use Only VLDL/LDL > Large HDL > Intermediate HDL --> Small HDL > Albumin > 81

82 Normales HDL-Profil 82

83 Noch normal, aber höherer Anteil intermediärer HDL-Partikel 83

84 Abnormales HDL-Profil Vorläufige Bewertung: Verhältnis Small : Large 84

85 Vorwiegend große HDL Partikel Verhältnis small : large = 0,095 85

86 Vorwiegend mittlere HDL Partikel Verhältnis small : large = 1 (Sollte max. 0,6 sein) 86

87 Vorwiegend kleine HDL Partikel Verhältnis small : large = 1,71 87

88 - LDL Subfraktionen Test (FDA-approved) - HDL Subfraktionen Test (Research use only) Nemo Muniz, Quantimetrix Corp., Redondo Beach, USA, Andreas Corell, Alphascience GmbH, Riedstadt. überarbeitet Juli 2014