Anti-SS-A 52 ORG Tests Immunometrischer Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von Autoantikörpern gegen SS-A 52. Gebrauchsanweisung

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1 ORGENTEC Diagnostika GmbH Carl-Zeiss-Straße Mainz Tel.: Fax: Anti-SS-A 52 ORG Tests Immunometrischer Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von Autoantikörpern gegen SS-A 52 Gebrauchsanweisung

2 INHALTSVERZEICHNIS Inhaltsverzeichnis... 2 Einleitung... 3 Methodik... 3 Lieferumfang des Tests... 4 Technische Daten... 4 Erforderliche Laborgeräte... 4 Vorbereitung der Reagenzien... 5 Probenentnahme und Probenvorbereitung... 5 Technische Hinweise... 5 Assaydurchführung... 6 Auswertung der Ergebnisse... 7 Normalwerte... 7 Sensitivität... 7 Spezifität... 7 Kalibrierung... 7 Linearität... 7 Literatur... 8 Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen... 9 Kurzanleitung

3 EINLEITUNG Autoimmunerkrankungen des rheumatischen Formenkreises sind häufig mit dem Auftreten von Autoantikörpern assoziiert, die gegen die verschiedensten Antigene des Zellkernes bzw. Zytoplasmas gerichtet sind. Die Antigene werden als antinukleäre Antigene bezeichnet und lassen sich in drei Gruppen zusammenfassen: 1. Antinukleäre Antikörper (ANA) im eigentlichen Sinne - gerichtet gegen: dsdna, ssdna, Histone, nukleoläre RNA und DNP, 2. extrahierbare nukleäre Antigene - gerichtet gegen Sm, n-rnp, Scl 70 und PM-1 und 3. zytoplasmatische Antigene - gerichtet gegen SS-A (Ro), SS-B (La) und Jo-1. Die unterschiedlichen Antikörperklassen führen zu variablen Immunfluoreszens-Mustern. Die ermittelten Titerstufen korrelieren zwar mit der quantitativen IgG-Bestimmung, jedoch gibt es innerhalb einer Titerstufe bisweilen erhebliche Konzentrationsunterschiede. Gegen die Antigene sind, je nach Erkrankung, unterschiedliche Autoantikörperprofile nachweisbar. Wichtigste Erkrankungen, die mit dem Auftreten von Autoantikörpern gegen diese Antigene assoziiert sind, sind systemischer Lupus erythematodes, Mischkollagenosen (Sharp Syndrom), Rheumatoide Arthritis, Sjögren-Syndrom, Sklerodermie, Dermato/Polymyositis sowie der medikamenteninduzierte SLE. Anti-Ro wurde zuerst bei SLE beobachtet, später als SS-A (Sjögren-Syndrom Antikörper A) identifiziert, wohingegen La identisch mit SS-B ist. Anti-SS-A präzipitiert Zellpartikel, die aus zwei Proteinen (MG: 60 und 52 kda) und 4 bis 5 kleinen RNS-Ketten bestehen. Das 60 kda Protein zeigte eine ausgesprochenen Homologie zu dem Calcium-bindenden Protein Calretikulin. Bei Untersuchungen von SLE und Sjögren-Syndrom Kollektiven konnte beobachtet werden, daß bei Patienten mit Antikörper ausschließlich gegen SS-A 52 ohne Antikörper gegen SS-A 60 ein Sjögren-Syndrom vorliegt und im umgekehrten Fall, wenn nur Antikörper gegen SS-A 60 vorliegen, ein SLE diagnostiziert werden konnte. Weiterhin wurden im Sjögren-Syndrom Kollektiv SS-A 52 Antikörper nur in Verbindung mit SS-B Antikörpern gefunden, wohingegen SS-A 60 Antikörper beim SLE auch ohne SS-B Antikörper auftraten. METHODIK Der vorliegende Test ist ein indirekter Enzymimmunoassays zum quantitativen Nachweis von Autoantikörpern gegen das 52 kda Protein des SS-A Komplexes. Die Kavitäten der Mikrotiterplatte sind mit hochgereinigtem SS-A 52 Protein beschichtet. Auf einer Mikrotiterplatte können 96 Bestimmungen durchgeführt werden. Jede Mikrotiterplatte setzt sich aus 12 einzelnen Streifen mit jeweils 8 Kavitäten zusammen. Bei Bedarf können die Streifen in einzelne Kavitäten zerteilt werden. Die drei Reaktionsschritte stellen sich wie folgt dar: 1. Reaktionsschritt Die Antikörper in Standards, Kontrollen und Patientenproben werden an die immobilisierten Antigene in den Kavitäten gebunden. 2. Reaktionsschritt Das zugegebene Enzymkonjugat (anti-human-igg Meerrettich-Peroxidase) erkennt spezifisch die gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexe. 3. Reaktionsschritt Die gebundene Peroxidase setzt ein zugegebenes Substrat (TMB) in ein gefärbtes Produkt um. Auswertung Die optische Dichte der Proben wird in einem ELISA-Photometer bei 450 nm gemessen. Die Farbentwicklung ist direkt proportional zur gesuchten Autoantikörper-Konzentration. 3

4 LIEFERUMFANG DES TESTS Mikrotiterplatte mit 96 abbrechbaren Kavitäten, die mit...1 hochgereinigtem SS-A 52 (Ro 52) Antigen beschichtet sind Probenpuffer, Konzentrat, (gelb)...1 Fläschchen, 20 ml Waschpuffer, Konzentrat...1 Fläschchen, 20 ml Konjugat...1 Fläschchen, 15 ml anti-human IgG, Peroxidase konjugiert, gebrauchsfertig (rosa), TMB Substratlösung, 3,3`, 5,5`-Tetramethylbenzidin, gebrauchsfertig...1 Fläschchen, 15 ml Stopplösung, 1M HCl, gebrauchsfertig...1 Fläschchen, 15 ml Kontrollen, gebrauchsfertig...je 1 Fläschchen, 1,5 ml - Kontrolle 1 Positivkontrolle - Kontrolle 2 Negativkontrolle Standards A bis F, gebrauchsfertig mit den Konzentrationen:...je 1 Fläschchen, 1,5 ml 0 6,3 12, U/ml Arbeitsanleitung/Qualitätskontroll-Zertifikat TECHNISCHE DATEN Untersuchungsmaterial Serum oder Plasma Erforderliche Probenmenge 10 µl Probe für eine 1 : 101 Probenvorverdünnung 100 µl verdünnte Probe pro Einzelbestimmung Gesamt-Inkubationszeit 60 Min. bei Raumtemperatur (20-28 C) Meßbereich: U/ml Empfindlichkeit: 0,5 U/ml Meßwellenlänge 450 nm Lagerung bei 2-8 C im Kühlschrank ERFORDERLICHE LABORGERÄTE Geräte/Reagenzienvorbereitung - Plattenphotometer mit einem optischen Filter der Meßwellenlänge 450 nm (ggf. Referenzwellenlänge von 620 nm) - Wirbelmischer (Vortex) - Mikropipetten mit Einmalspitzen für 10 µl, 100 µl und 1000 µl, evtl. Multipette - destilliertes Wasser - Meßzylinder für 100 ml und 1000 ml - Gefäß zur Aufbewahrung der Waschlösung 4

5 VORBEREITUNG DER REAGENZIEN Alle Komponenten dieses Testbesteckes liegen bis auf den Probenpuffer und den Waschpuffer gebrauchsfertig vor. Die Lösungen sind nach dem Öffnen der Fläschchen und bei Lagerung im Kühlschrank bei 2-8 C bis zum aufgedruckten Verfallsdatum haltbar. Waschlösung Jede Flasche des Waschpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml (1 Liter) zu verdünnen. Die verdünnte Waschlösung ist bei einer Lagerung bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. Probenpuffer Jede Flasche des Probenpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 100 ml zu verdünnen. Der verdünnte Probenpuffer ist bei einer Lagerung bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. Mikrotiterplatte Es werden je nach Probenaufkommen die nötige Anzahl von Streifen oder Einzelkavitäten in den Rahmen der Mikrotiterplatte eingesetzt. Es sollte unbedingt darauf geachtet werden, daß die verpackte Mikrotiterplatte bereits Raumtemperatur angenommen hat, ehe die Folienverpackung geöffnet wird. Die nicht benötigten Streifen bzw. Kavitäten werden in dem wiederverschließbaren Beutel bei 2-8 C aufbewahrt. Achtung: Werden bei einem Assayansatz nicht alle Streifen bzw. Kavitäten benötigt, muß der Rahmen der Mikrotiterplatte aufbewahrt werden. Nach Beendigung eines Testansatzes sollten die verbrauchten Kavitäten verworfen und der Rahmen der Mikrotiterplatte in den Kit zurück gelegt werden. PROBENENTNAHME UND PROBENVORBEREITUNG Die Bestimmung der Autoantikörper wird im Serum oder Plasma durchgeführt. Die Serum- bzw. Plasmaproben werden vor der Messung 1 : 101 mit Probenpuffer verdünnt. 10 µl Probe plus 1000 µl Probenpuffer Serum- und Plasmaproben können gekühlt bei 2-8 C bis zu 5 Tage aufbewahrt werden. Ist eine längere Lagerung beabsichtigt, sollten die Proben aliquotiert und bei -20 C tiefgefroren werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden. Seren und Plasmen mit erhöhten Bilirubinwerten, hämolytische oder lipämische Proben stören die Bestimmung nicht. TECHNISCHE HINWEISE Zur laufenden Kontrolle der Richtigkeit wird empfohlen, jeden Ansatz anhand von Kontrollseren zu überprüfen. 5

6 ASSAYDURCHFÜHRUNG Vor Testbeginn müssen alle Reagenzien sowie die Patientenseren Raumtemperatur angenommen haben. 1. Eine ausreichende Anzahl von Kavitäten bzw. Mikrotiterplatten-Module zum Ansatz von Standards, Kontrollen und Patientenproben vorbereiten. Doppelbestimmungen werden empfohlen. 2. Jeweils 100 µl Standards, Kontrollen und vorverdünnte Patientenproben entsprechend der Plattenbelegung in die Mikrotiterplatte pipettieren. Vorschlag für ein Pipettierschema: A SA SE P1 P5 B SA SE P1 P5 C SB SF P2 P.. SA - SF: Standards A bis F D SB SF P2 P.. P1, P2... Pantientenprobe 1, 2... E SC K1 P3 K1: Positivkontrolle F SC K1 P3 K2: Negativkontrolle G SD K2 P4 H SD K2 P4 1. Inkubation: 30 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) 3. Kavitäten entleeren und insgesamt 3 Mal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen. Einwirkzeit des Waschpuffers: mindestens 25 sec. Waschpufferreste müssen vollständig aus den Kavitäten entfernt werden. Hierzu sollte die Mikrotiterplatte mehrere Male kräftig mit der Öffnung nach unten auf eine saugfähige Unterlage ausgeschlagen werden. 4. Jeweils 100 µl Enzymkonjugatlösung in die Kavitäten der Mikrotiterplatte pipettieren. 2. Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) 5. Kavitäten entleeren und insgesamt 3 Mal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen. Einwirkzeit des Waschpuffers: mindestens 25 sec. Waschpufferreste müssen vollständig aus den Kavitäten entfernt werden. Hierzu sollte die Mikrotiterplatte mehrere Male kräftig mit der Öffnung nach unten auf eine saugfähige Unterlage ausgeschlagen werden. 6. Jeweils 100 µl TMB Substratlösung in die Kavitäten pipettieren. 3. Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) µl Stopplösung in jede Kavität pipettieren und die Platte ca. 5 Minuten stehen lassen. 8. Messung der optischen Dichte aller Proben im Plattenphotometer innerhalb von 30 Minuten bei einer Wellenlänge von 450 nm. Bitte beachten Sie: Alle angegebenen Inkubationszeiten müssen eingehalten werden. Alle Pipettierschritte sind bei allen Inkubationen in einheitlicher Reihenfolge und einheitlichem Zeittakt durchzuführen. 6

7 AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE Eine Standardkurve erhält man durch Auftragen der gemessenen optischen Dichte gegen die vorgegebene Standardkonzentration. NORMALWERTE Im Rahmen einer umfangreichen Normbereichsstudie wurde anhand von Blutspender-Seren mit dem Anti-SS-A 52 ELISA die folgenden Werte ermittelt: Normal < 10 U/ml Erhöht > 10 U/ml SENSITIVITÄT Die untere Nachweisgrenze beträgt 0,5 U/ml. SPEZIFITÄT Die Mikrotiterplatte ist mit dem hochgereinigtem 52 kda Protein des SS-A-Komplexes beschichtet. Der Anti-SS-A 52 Kit erfaßt spezifisch die gegen das genannte Protein gerichteten Autoantikörper der IgG Klasse. KALIBRIERUNG Das quantitative Meßsystem Anti-SS-A 52 ist in relativen Einheiten kalibriert. LINEARITÄT Für die Verdünnungsexperimente wurden Seren/Plasmen mit hohen Antikörperkonzentrationen in steigenden Verdünnungsstufen (Verdünnung im Probenpuffer) im Assay eingesetzt. Die Ergebnisse sind über den gesamten Meßbereich linear. 7

8 LITERATUR 1. Buyon JP. Autoantibodies reactive with Ro(SSA) and La(SSB) and pregnancy. J.Rheumatol., Vol. 24 Suppl 50, 12-16, Dörner T, Chaoui R, Feist E, Goldner B, Yamamoto K, Hiepe F. Significantly increased maternal and fetal IgG autoantibody levels to 52 kd Ro (SS-A) and La(SS-B) in complete congenital heart block. J.Autoimmun., Vol. 8, , Dörner T, Feist E, Wagenmann A, et al. Anti-52 kda Ro(SSA) autoantibodies in different autoimmune diseases preferentially recognize epitopes on the central region of the antigen. Rheumatol., Vol. 23, , Huang SC, Scofield RH, Kurien BT, Harley JB. Human anti-ro autoantibodies bind multiple conformational epitopes of 60-kD Ro autoantigen. J.Clin.Immunol., Vol. 17, , Kato T, Sasakawa H, Suzuki S, et al. Autoepitopes of the 52-kd SS-A/Ro molecule. Arthritis Rheum., Vol. 38, , Keech CL, Gordon TP, McCluskey J. Structural differences between the human and mouse 52-kD Ro autoantigens associated with poorly conserved autoantibody activity across species. Clin.Exp.Immunol., Vol. 104, , Lee LA, Pickrell MB, Reichlin M. Development of complete heart block in an adult patient with Sjogren's syndrome and anti- Ro/SS-A autoantibodies. Arthritis Rheum., Vol. 39, , McCauliffe DP, Wang L, Satoh M, Reeves WH, Small D. Recombinant 52 kda Ro(SSA) ELISA detects autoantibodies in Sjogren's syndrome sera that go undetected by conventional serologic assays. J.Rheumatol., Vol. 24, , Ricchiuti V, Pruijn GJ, Thijssen JP, van Venrooij WJ, Muller S. Accessibility of epitopes on the 52-kD Ro/SSA protein (Ro52) and on the RoRNP associated Ro52 protein as determined by anti-peptide antibodies. J. Autoimmun., Vol. 10, , Slobbe RL, Pruijn GJ, Damen WG, van der Kemp JW, van Venrooij WJ. Detection and occurrence of the 60- and 52-kD Ro (SS-A) antigens and of autoantibodies against these proteins. Clin.Exp.Immunol. 1991;86: van Venrooij WJ, Slobbe RL, Pruijn GJ. Structure and function of La and Ro RNPs. Mol.Biol.Rep. 1993;18:

9 HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN Alle Reagenzien dieser Testpackung dürfen ausschließlich zur in vitro-diagnostik verwendet werden. Die Einhaltung des vorgeschriebenen Protokolls zur Durchführung des Tests ist unbedingt erforderlich. Die Richtlinien zur Durchführung der Qualitätskontrolle in medizinischen Laboratorien sind zu beachten (Mitführen von Kontrollen, Poolseren). Einzelne Komponenten verschiedener Chargen und Testbestecke sollten nicht ausgetauscht werden. Die auf der Verpackung und den Etiketten der einzelnen Komponenten angegebenen Verfallsdaten sind zu beachten. Der Testkit enthält Reagenzien, die aus humanen Serum- oder Plasmabestandteilen hergestellt sind. Die Ausgangsreagenzien wurden mit Immunoassaymethoden auf Antikörper gegen HIV 1, HIV 2, HCV und auf das Hepatitis B Oberflächenantigen untersucht. Alle getesteten Parameter wurden für negativ befunden. Für den Umgang mit Kitreagenzien, Kontroll- und Serumproben sind die Vorschriften zur Unfallverhütung für den Gesundheitsdienst beim Umgang mit potentiell infektiösem Material einzuhalten. Das Untersuchungsmaterial ist stets als potentiell infektiös einzustufen. Unter den gleichen Sicherheitsvorkehrungen sind ebenso Kitreagenzien und Kontrollproben zu handhaben. Die Reagenzien dieses Testbestecks enthalten zum Schutz gegen bakterielles Wachstum Konservierungsmittel; daher ist die Berührung mit der Haut und/oder Schleimhäuten zu vermeiden. Das Substrat TMB (3,3`,5,5`-Tetramethylbenzidin) ist toxisch bei Verschlucken und bei Berührung mit der Haut. Bei Berührung mit der Haut sofort mit viel Wasser und Seife abwaschen. Vermeiden Sie den Kontakt der Peroxidlösung mit leicht oxidierbaren Materialien. Extreme Temperaturschwankungen können zum spontanen Zerfall des Peroxids führen. Ein Kontakt mit der Salzsäure enthaltenden Stopp-Lösung ist zu vermeiden. Bei Hautkontakt unverzüglich und kräftig mit Wasser abwaschen. Alle Geräte sofort nach Gebrauch gründlich reinigen. 9

10 KURZANLEITUNG 10

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