Anti-ASCA ORG Tests. Immunometrischer Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von Antikörpern gegen Saccharomyces cerevisiae (ASCA)

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1 ORGENTEC Diagnostika GmbH Carl-Zeiss-Straße Mainz Tel.: Fax: Anti-ASCA ORG Tests Immunometrischer Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von Antikörpern gegen Saccharomyces cerevisiae (ASCA) August 2003

2 INHALT KURZBESCHREIBUNG... 3 EINLEITUNG... 3 METHODIK... 3 HINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN... 4 LIEFERUMFANG DES TESTS... 5 LAGERUNG UND STABILITÄT... 5 ERFORDERLICHE LABORGERÄTE... 5 PROBENENTNAHME UND LAGERUNG... 5 ALLGEMEINE HINWEISE... 6 VORBEREITUNG DER REAGENZIEN... 6 ASSAYDURCHFÜHRUNG... 7 AUSWERTUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE... 7 TESTCHARAKTERISTIKA... 8 GRENZEN DES VERFAHRENS... 9 INTERFERENZEN... 9 LITERATUR...10 KURZANLEITUNG

3 KURZBESCHREIBUNG Anti-Sachharomyces cerevisiae Antikörper ELISA ist ein indirekter Enzymimmunoassay für den Nachweis von ASCA (Anti-Saccharomyces cerevisiae Mannan Antikörper) in humanem Serum als eine Hilfe bei der Diagnose von Morbus Crohn. Dieser Assay ist ausschliesslich für den diagnostischen in-vitro Gebrauch bestimmt. EINLEITUNG Zu den häufigsten chronisch entzündlichen Darmerkrankungen gehören Morbus Crohn (MC) und Colitis ulcerosa (CU). Die CU bewirkt eine Entzündung und die Bildung von Geschwüren der inneren Schicht (Mukosa) die auf den Dickdarm und das Rektum beschränkt sind. Der Morbus Crohn verursacht eine Entzündung, die sich bis in tiefere Schichten der Dickdarmwände ausbreiten kann. Diese Entzündungen sind asymmetrisch und segmentiell über den gesamten Darm verteilt, mit Bereichen von gesundem und erkranktem Gewebe. Beim Morbus Crohn kann es darüber hinaus zur Bildung von Fisteln kommen [1]. Differentialdiagnostisch wird die Unterscheidung zwischen Morbus Crohn und Colitis Ulcerosa durch den Nachweis von ANCA (Anti-Neutrophile-Cytoplasmatische Antikörper) und ASCA (Anti- Saccharomyces cervisiae Antikörper) unterstützt. ASCA sind gegen Mannan, ein Mannosehaltiges Phosphopeptid der Zellmembran von S. cerevisiae, gerichtet [2]. Anti-S. cereviasiae IgGoder IgA-Antikörper haben eine Spezifität für Morbus Crohn von %. Das Vorkommen von ASCA ist beim Morbus Crohn im Vergleich zu Colitis ulcerosa signifikant erhöht. Bei Patienten mit Colitis ulcerosa zeigten erste Studien 5% erhöhte IgG- und 7% IgA-ASCAs, während bei Morbus Crohn ASCAs eine Sensitivität für IgG und IgA von 75% bzw. 60% ermittelt wurde [3, 4] Das Auftreten atypischer ANCA (aanca) beim MC ist hingegen seltener. Die Prävalenz der ANCAs für CU liegt bei 50-90% während sie bei Morbus Crohn lediglich 10-20% beträgt [5]. Mit Hilfe der Kombination beider Ergebnisse lässt sich die Differentialdiagnose von Morbus Crohn und Colitis ulcerosa in ihrem Frühstadium verbessern. METHODIK Anti-ASCA ELISA ist ein indirekter Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von Autoantikörpern gegen Mannan aus Saccharomyces cerevisiae. Die Kavitäten der Mikrotiterplatte sind mit Mannan, einem Mannose-haltigen Zellwandphosphopeptid, beschichtet. Im Serum vorhandene Antikörper können an das immobilisierte Antigen binden. Durch Waschen werden nicht gebundene Serum-Antikörper entfernt. Enzym-markierte Detektions-Antikörper (HRPkonjugierte Anti-human IgG- oder IgA-Antikörper) heften sich anschließend an die Oberflächengebundenen Autoantikörper. Überschüssige Detektionsantikörper werden durch Waschen entfernt. Ein Enzymsubstrat wird in Anwesenheit von gebundenen Detektionsantikörpern zu einem blauen Reaktionsprodukt hydrolysiert. Die Zugabe von Säure stoppt die Reaktion ab und das Reaktionsprodukt verfärbt sich gelb. Die Intensität der Gelbfärbung kann photometrisch bei 450 nm bestimmt werden. Die Farbentwicklung ist direkt proportional zur gesuchten Autoantikörper- Konzentration. Auf einer Mikrotiterplatte können 96 Bestimmungen durchgeführt werden. Jede Mikrotiterplatte setzt sich aus 12 einzelnen Streifen mit jeweils 8 Kavitäten zusammen. Bei Bedarf können die Streifen in einzelne Kavitäten zerteilt werden. 3

4 HINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1. Alle Reagenzien dieser Testpackung sind ausschließlich für den diagnostischen in-vitro Gebrauch bestimmt 2. Einzelne Komponenten verschiedener Chargen und Testbestecke sollten nicht ausgetauscht werden. Die auf der Verpackung und den Etiketten der einzelnen Komponenten angegebenen Verfallsdaten sind zu beachten. 3. Der Testkit enthält Reagenzien, die aus humanen Serum- oder Plasmabestandteilen hergestellt sind. Die Ausgangsreagenzien wurden mit Immunoassaymethoden auf Antikörper gegen HIV 1, HIV 2, HCV und auf das Hepatitis B Oberflächenantigen untersucht. Alle getesteten Parameter wurden für negativ befunden. 4. Das Substrat TMB (3,3`,5,5`-Tetramethylbenzidin) ist toxisch bei Verschlucken und bei Hautkontakt. Bei Hautkontakt sofort mit viel Wasser und Seife abwaschen. 5. Ein Kontakt mit der Salzsäure enthaltenden Stopp-Lösung ist zu vermeiden. Bei Hautkontakt unverzüglich und kräftig mit Wasser abwaschen. Alle Geräte sofort nach Gebrauch gründlich reinigen. 6. Einige Reagenzien dieses Testbestecks enthalten zum Schutz gegen bakterielles Wachstum Natriumazid als Konservierungsmittel; daher ist der Kontakt mit der Haut und/oder Schleimhäuten zu vermeiden. 7. Handschuhe tragen und Kontakt mit Reagenzien, Kontrollproben und Untersuchungsmaterial vermeiden. 8. Nicht mit dem Mund pipettieren 9. Nicht Essen, Trinken oder Rauchen 10. Vermeiden Sie den Kontakt der Peroxidlösung mit leicht oxidierbaren Materialien. Extreme Temperaturschwankungen können zum spontanen Zerfall des Peroxids führen. 4

5 LIEFERUMFANG DES TESTS Bestimmungen 12 x 8 Menge 1 Eine Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten. Jede Kavität ist mit dem Phosphopeptid Mannan beschichtet 6 Fläschchen à 1.5 ml Kombinierte Standardreihe mit Anti-ASCA Antikörpern (IgG und IgA) in Serum/Puffer Matrix (PBS, NaN3 <0,1% (w/w)). IgG: 0; 12.5, 25, 50; 100; 200 U/ml, IgA:0; 7.5;.15; 30; 60; 120 U/ml. Gebrauchsfertig 2 Fläschchen à 1,5 ml Anti-ASCA Positivkontrolle (1) und Negativkontrolle (2) in Serum/Puffer Matrix (PBS, NaN3 <0,1% (w/w)). Gebrauchsfertig 1 Flasche à 20 ml Probenpuffer (Tris, NaN3 <0,1% (w/w)), gelb, Konzentrat (5x) 1 Flasche à 15 ml Konjugat; anti-human IgG, Peroxidase konjugiert, rosa (PBS, PROCLIN 300 <0,5% (v/v)): Gebrauchsfertig 1 Flasche à 15 ml Konjugat; anti-human IgA, Peroxidase konjugiert, rosa (PBS, PROCLIN 300 <0,5% (v/v)): Gebrauchsfertig 1 Flasche, à 15 ml TMB Substratlösung, 3,3`,5,5`-Tetramethylbenzidin. Gebrauchsfertig 1 Flasche, à 15 ml Stopplösung (1 M Salzsäure). Gebrauchsfertig 1 Flasche, à 20 ml Waschpuffer (PBS, NaN3 <0,1% (w/w)), Konzentrat (50x) LAGERUNG UND STABILITÄT 1. Lagerung bei 2-8 C im Kühlschrank 2. Kavitäten/Streifen sollten in einem luftdicht verschlossenen Beutel mit Trockenmittel gelagert werden 3. Die Testreagenzien sind bei sachgemässer Lagerung bis zum Verfalldatum des Test Kits verwendbar 4. Testreagenzien vor Hitze und direktem Sonnenlicht schützen 5. Verdünnter Probenpuffer und Waschpuffer sind bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar ERFORDERLICHE LABORGERÄTE - Plattenphotometer mit einem optischen Filter der Meßwellenlänge 450 nm (ggf. Referenzwellenlänge von 620 nm) - Mehrkanalpipette oder Multipette - Vortex Mixer - Mikropipetten mit Einmalspitzen für 10 µl, 100 µl and 1000 µl - destilliertes oder entionisiertes Wasser - Meßzylinder für 100 ml und 1000 ml - Gefäß zur Aufbewahrung der Waschlösung PROBENENTNAHME UND LAGERUNG 1. Blutproben sind nach den geltenden Richtlinien und Verfahren zu gewinnen. 5

6 2. Blut gerinnen lassen und Serum durch Zentrifugation gewinnen 3. Die zu testenden Seren sollten klar und nicht hämolytisch sein. Hämolytische und lipämische sowie Seren mit erhöhten Bilirubinwerten sollten vermieden werden. 4. Serum- und Plasmaproben können gekühlt bei 2-8 C bis zu 5 Tage aufbewahrt werden. Ist eine längere Lagerung beabsichtigt, sollten die Proben aliquotiert und bei -20 C tiefgefroren werden. 5. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden! 6. Die Verwendung hitze-inaktivierter Seren wird nicht empfohlen. ALLGEMEINE HINWEISE 1. Komponenten dieses Tests dürfen nicht nach Ablauf des Verfallsdatums benutzt werden. 2. Einzelne Komponenten verschiedener Chargen und Testbestecke dürfen nicht ausgetauscht werden 3. Vor Gebrauch sind alle Reagenzien auf Raumtemperatur (20-28 C) zu bringen. 4. Alle Reagenzien und Proben sollten vor Beginn des Testansatzes bereitgestellt sein. Nach Beginn muss der Test ohne Unterbrechung durchgeführt werden, um verlässliche und konstante Ergebnisse zu liefern. 6. Immer frische Probenverdünnungen verwenden 7. Alle Reagenzien und Proben auf den Boden der Kavitäten pipettieren. Um Verschleppung zu verhindern sollten Proben und die verschiedenen Kontrollen jeweils mit einer frischen Pipettenspitze pipettiert werden. 8. Die Inkubationszeiten sollten eingehalten werden 9. Zur laufenden Kontrolle der Richtigkeit wird empfohlen, jeden Ansatz anhand von Kontrollseren zu überprüfen 10. Die Kavitäten der Mikrotiterplatten sind nicht wiederverwendbar.do not use kit components beyond their expiration dates VORBEREITUNG DER REAGENZIEN Probenpuffer Jede Flasche des Probenpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 100 ml zu verdünnen. Der verdünnte Probenpuffer ist bei einer Lagerung bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. Waschlösung Jede Flasche des Waschpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml (1 Liter) zu verdünnen. Die verdünnte Waschlösung ist bei einer Lagerung bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. Probenvorbereitung Die Bestimmung der Autoantikörper wird im Serum oder Plasma durchgeführt. Die Serum- bzw. Plasmaproben werden vor der Messung 1:100 mit Probenpuffer verdünnt, d.h. 10 µl Probe plus 990 µl Probenpuffer. 6

7 Mikrotiterplatte Es werden je nach Probenaufkommen die nötige Anzahl von Streifen bzw. Kavitäten in den Rahmen der Mikrotiterplatte eingesetzt. Es sollte unbedingt darauf geachtet werden, daß die verpackte Mikrotiterplatte bereits Raumtemperaur angenommen hat, ehe die Folienverpackung geöffnet wird. Die nicht benötigten Streifen und Kavitäten werden in dem wiederverschließbaren Beutel bei 2-8 C im Kühlschrank aufbewahrt. Achtung: Werden bei einem Assayansatz nicht alle Kavitäten/Streifen benötigt, muss der Rahmen der Mikrotiterplatte aufbewahrt werden. Nach Beendigung eines Testansatzes sollten die verbrauchten Kavitäten/Streifen verworfen und der Rahmen der Mikrotiterplatte in den Kit zurück gelegt werden. ASSAYDURCHFÜHRUNG 1. Eine ausreichende Anzahl von Kavitäten bzw. Mikrotiterplatten-Module zum Ansatz von Kalibrator, Kontrolle und Patientenproben vorbereiten. Doppelbestimmungen werden empfohlen. 2. Jeweils 100 µl, Kontrollen und vorverdünnte Patientenproben entsprechend der Plattenbelegung in die Mikrotiterplatte pipettieren. Vorschlag für ein Pipettierschema: 1. Inkubation: 30 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) 3. Kavitäten entleeren und insgesamt 3 Mal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen. Einwirkzeit des Waschpuffers: mindestens 25 sec. Waschpufferreste müssen vollständig aus den Kavitäten entfernt werden. Hierzu sollte die Mikrotiterplatte mehrere Male kräftig mit der Öffnung nach unten auf eine saugfähige Unterlage ausgeschlagen werden. 4. Jeweils 100 µl Enzymkonjugatlösung in die Kavitäten der Mikrotiterplatte pipettieren. 2. Inkubation:15 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) 5. Kavitäten entleeren und insgesamt 3 Mal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen. Einwirkzeit des Waschpuffers: mindestens 25 sec. Waschpufferreste müssen vollständig aus den Kavitäten entfernt werden. Hierzu sollte die Mikrotiterplatte mehrere Male kräftig mit der Öffnung nach unten auf eine saugfähige Unterlage ausgeschlagen werden. 6. Jeweils 100 µl TMB Substratlösung in die Kavitäten pipettieren. 3. Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) µl Stopplösung in jede Kavität pipettieren und die Platte ca. 5 Minuten stehen lassen. 8. Messung der optischen Dichte aller Proben im Plattenphotometer innerhalb von 30 Minuten bei einer Wellenlänge von 450 nm. AUSWERTUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE Qualitätskontrolle Dieser Test ist nur gültig, wenn die optische Dichte bei 450 nm für die Positivkontrolle (1) und die Negativkontrolle (2), sowie Standard A und Standard F in den im Qualitätskontrollzertifikat angegebenen Bereich liegen. Das Qualitätskontrollzertifikat ist dem Kit beigelegt. Sollte eines dieser Kriterien nicht zutreffen, sind die Testergebnisse ungültig und der Test sollte wiederholt werden.this test is only valid if the optical density at 450 nm for Positive Control (1) and Negative Control (2) as well as for the Calibrator A and F complies with the respective range indicated on 7

8 the Quality Control Certificate enclosed to each test kit! If any of these criteria is not met, the results are invalid and the test should be repeated. Auswertung der Ergebnisse Zur Auswertung der Standardkurve und der Berechnung der Testergebnisse ist die Auswertung mittels 4-Parameter Analyse geeignet. Interpretation der Ergebnisse Im Rahmen einer umfangreichen rmbereichstudie wurde anhand von Blutspender-Seren mit Anti-ASCA ELISA die folgenden Werte ermittelt: Anti-ASCA IgG (U/ml) IgA (U/ml) rmal <10 <10 Erhöht >10 >10 TESTCHARAKTERISTIKA Kalibrierung Das quantitative Meßsystem für Anti-ASCA IgG und IgA ist in relativen Einheiten kalibriert. Linearität Für die Bestimmung der Linearität wurden Seren mit hohen Antikörperkonzentrationen in steigenden Verdünnungsstufen (Verdünnung im Probenpuffer) im Assay eingesetzt. Drei Verdünnungen von drei Proben wurden auf Anti-ASCA Kits gemessen. Die folgende Tabelle zeigt die Mittelwerte und die Verdünnungsfaktor korrigierte Wiederfindung. Dilution ASCA IgG Observed Observed/ Expected Dilution ASCA IgA Observed Observed/ Expected 1:100 98,0 100 % 1 1:100 28,7 100% 1:200 43,0 88% 1:200 15,1 105% 1 1:400 20,5 84% 1:400 7,5 105% 1:100 85,8 100% 2 1:100 30,6 100% 1:200 36,1 84% 1:200 16,1 105% 2 1:400 17,4 81% 1:400 8,4 110% 1:100 46,3 100% 3 1:100 37,1 100% 1:200 20,9 90% 1:200 15,3 82% 3 1:400 9,8 85% 1:400 5,8 63% 8

9 Präzision/Reproduzierbarkeit In der untenstehenden Tabelle sind die Variationskoeffizienten (VK %), die für die Intra- und die Inter-Assay-Varianz des Anti-ASCA Kits ermittelt wurden, aufgeführt. Zur Ermittlung der Intra- Assay-Varianz wurden drei Seren mit unterschiedlichen Anti-ASCA Konzentrationen jeweils 9-fach auf einer Platte gemessen. Für die Bestimmung der Inter-Assay-Varianz wurden drei Proben mit unterschiedlichen Anti-ASCA Konzentrationen auf drei Platten jeweils 24fach gemessen. Anti-ASCA IgG Anti-ASCA IgA Intra-Assay Intra-Assay Mean CV [%] Mean CV [%] Inter-Assay Inter-Assay Mean CV [%] Mean CV [%] Sensitivität Die untere Nachweisgrenze für Anti-ASCA wurde mit 1 U/ml ermittelt. GRENZEN DES VERFAHRENS 1. Der Anti-ASCA ELISA ist eine diagnostische Hilfe und sollte nicht als alleiniges diagnostisches Mittel verwendet werden. Die Ergebnisse müssen in Verbindung mit physikalischen Befunden interpretiert werden. 2. Ein negatives ASCA IgG und/oder IgA Ergebnis schließt das Vorhandensein von Morbus Crohn nicht aus 3. Ein positives ASCA IgG und/oder IgA Ergebnis bedeutet nicht notwendigerweise das Vorhandensein von Morbus Crohn INTERFERENZEN Es konnten keine Interferenzen mit hämolytischen (bis 1000 mg/dl), lipämischen (bis 3 g/dl Triglyceride) oder Seren mit erhöhten Bilirubinwerten (bis 40 mg/dl) beobachtet werden. 9

10 LITERATUR 1. Merck Manual of Diagnosis and Therapy Whitehouse Station, NJ. ( 2. Sendid, B., J.F. Colombel, P.M. Jacquinot, C. Faille, J. Fruit, A. Cortot, D. Lucidarme, D. Camus, and D. Poulain. Specific antibody response to oligomannosidic epitopes in Crohn s Disease. Clin. Diag. Lab. Immunol., 1996, 3(2): Main, J., H. McKenzie, G.R. Yeaman, M.A. Kjerr, D. Robson, and C.R. Pennington. Antibody to Saccharomyces cerevisiaev (baker s yeast) in Crohn s disease. Brit. J. Med., 1988, 297: McKenzie, H., J. Main, C.R. Pennington, and D. Parrat. Antibody to selected strains of Saccharomyces cerevisiae (baker s and brewer s yeast) and Candida albicans in Crohn s diasease. Gut, 1990, 31: Quinton, J.-F., B. Sendid, D. Reumaux, P. Duthilleul, A. Cortot, B. Grandbastien, G. Charrier, S.R. Targan, J.-F. Colombel, and D. Poulain. Anti-Saccharomyces cerevisiae mannan antibodies combined with antineutrophil cytoplasmic autoantibodies in inflammatory bowel disease: prevalence and diagnostic role. Gut, 1998, 42: KURZANLEITUNG 10

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