Anti-SS-A ORG Tests Immunometrischer Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von Autoantikörpern gegen SS-A. Gebrauchsanweisung

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1 ORGENTEC Diagnostika GmbH Carl-Zeiss-Straße Mainz Tel.: Fax: Anti-SS-A ORG Tests Immunometrischer Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von Autoantikörpern gegen SS-A Gebrauchsanweisung

2 INHALTSVERZEICHNIS Inhaltsverzeichnis... 2 Einleitung... 3 Methodik... 4 Lieferumfang des Tests... 5 Technische Daten... 5 Erforderliche Laborgeräte... 5 Vorbereitung der Reagenzien... 6 Probenentnahme und Probenvorbereitung... 6 Technische Hinweise... 6 Assaydurchführung... 7 Auswertung der Ergebnisse... 8 Normalwerte... 8 Sensitivität... 8 Spezifität... 8 Kalibrierung... 8 Linearität... 8 Reproduzierbarkeit... 9 Literatur... 9 Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen Kurzanleitung

3 EINLEITUNG Der serologische Nachweis antinukleärer Antikörper (ANA), im Rahmen der Diagnostik entzündlich-rheumatischer Erkrankungen, ist heute fester Bestandteil eines jeden rheumatologisch-immunologisch ausgerichteten Labors. Unter den entzündlichen Bindegewebserkrankungen werden Erkrankungen unklarer Genese mit Störungen der zellulären und humoralen Immunität, systemischen Organbefall und chronischem Krankheitsverlauf zusammengefaßt. Weiterhin zeichnen sich diese Mischkollagenosen durch eine überlappende Symptomatik aus, so daß die Abgrenzung definierter Krankheitsbilder im Einzelfall äußerst schwierig ist. Zu den Mischkollagenosen werden der systemische Lupus erythematodes (SLE), das Sjögren Syndrom, die progressive systemische Sklerodermie (PSS) zusammen mit ihrer Sonderform, dem CREST-Syndrom sowie das Sharp-Syndrom (Mischkollagenose, MCTD) und die Poly/Dermatomyositis gezählt. Bei aller Diversität der Krankheitsbilder weisen die genannten Kollagenosen ein gemeinsames serologisches Merkmal auf: die Anwesenheit zirkulierender Autoantikörper. Diese Autoantikörper sind gegen Bestandteile des Zellkerns und des Zytoplasmas gerichtet und haben zum Teil Markerfunktion für die einzelnen Bindegewebserkrankungen. Bei einem Verdacht auf eine systemische Autoimmunerkrankung wird i.d.r. zuerst ein allgemeiner Test, ein Screening, auf antinukleäre Antikörper durchgeführt. Die indirekte Immunfluoreszenztechnik auf kultivierten HEp-2 Zellen ist hierfür eine weit verbreitete Methode. Der zweite Schritt der ANA-Stufendiagnostik besteht anschließend in dem isolierten Nachweis der krankheitsspezifischen Antikörper. Anti-RNP/Sm Antikörper gegen das 70 kda Protein (oftmals auch U1 70 kda oder RNP-68 genannt) des U1- snrnp-komplexes sind sehr spezifische Marker für das Sharp-Syndrom. Bis zu 100% der Patienten mit dieser speziellen Form der Mischkollagenose zeigen Autoantikörper gegen dieses Zielantigen. Sharp-Syndrom-Patienten weisen Merkmale eines systemischen Lupus erythematodes, einer systemischen Sklerose und einer Poly/Dermatomyositis auf, Nieren und ZNS-Beteiligungen sind jedoch recht selten. Der U1-snRNP-Komplex enthält neben dem 70 kda Antigen und dem kompletten Sm-Protein-Set auch die Proteine A und C. Diese beiden Proteine, inklusive des 70 kda Antigens werden von Autoantikörpern erkannt, die bei der Mischkollagenose und beim systemischen Lupus erythematodes auftreten. Allerdings weisen SLE Patienten im Gegensatz zu MCTD Patienten in der Regel niedrigere Titer gegen das 70 kda Protein auf. Anti-Sm Autoantikörper gegen die Sm-Proteine haben pathognomonische Bedeutung bei der Diagnostik des SLE, d.h. ein positiver Antikörperbefund ist in diesem Falle gleichbedeutend mit der Diagnose SLE. Ein negativer Befund schließt jedoch einen Lupus keinesfalls aus. Die Prävalenzen für Anti- Sm schwanken zwischen 7 und 40%. Der Nachweis von Antikörpern gegen Sm gehört zu den Kriterien für die Diagnostik eines SLE, die im Jahre 1982 vom American College of Rheumatology (ACR) veröffentlicht worden sind. Anti-SS-A Autoantikörper gegen das SS-A-Antigen können bei 70 bis 100 % aller Patienten mit primärem Sjögren Syndrom nachgewiesen werden. Aber auch SLE-Patienten mit Sicca-Symptomatik zeigen zu einem hohen Prozentsatz SS-A Antikörper (60-90%). Weiterhin spielt die Bestimmung von Anti- SS-A bei der Diagnostik des subacut cutanen LE sowie des Lupus mit C2 Mangel eine wichtige Rolle. Auch in der pränatalen Diagnostik ist der Nachweis von Anti-SS-A von entscheidender Wichtigkeit bei der Vorhersage eines kongenitalen Herzblockes. 3

4 Anti-SS-B Antikörper gegen SS-B treten ebenfalls beim primären Sjögren-Syndrom auf (40 bis 94%), sind jedoch oft auch bei SLE-Patienten mit Sicca-Symptomatik nachweisbar. Ein isolierter Anti-SS-B Befund ist sehr selten, Anti-SS-A und Anti-SS-B treten meistens gemeinsam auf. Anti-SS-B werden beim Sjögren Syndrom verstärkt mit Leukopenien, Lymphopenien, Hypergammaglobulinämien und einer schwereren Beteiligung der exokrinen Drüsen in Verbindung gebracht. Anti-Scl-70 Autoantikörper gegen das Enzym DNA Topoisomerase I (Topo I) sind ein hochspezifischer Marker für die progressive Systemsklerose (70%). Sklerodermiepatienten mit Anti-Scl-70 tendieren eher zu Hautmanifestationen und Beteiligungen des Herzens und der Nieren sowie zu Lungenfibrosen als Patienten, die diesen Antikörper nicht aufweisen. Anti-Jo-1 Antikörper gegen das Jo-1 Antigen, die Histidyl-tRNA-Synthetase, finden sich bei etwa 30 bis 40% aller Patienten mit Polymyositis. Viele dieser Patienten zeigen zusätzlich Anzeichen einer fibrosierenden Alveolitis und eines Raynaud-Phänomens sowie Manifestationen einer Sklerodermie. Indikationen: Entzündlich-rheumatische Erkrankungen METHODIK Das vorliegende Testbesteck ist ein indirekter Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von Autoantikörpern, die gegen SS-A (Ro) gerichtet sind. Die farbcodierten Kavitäten der Mikrotiterplatte sind jeweils mit hochgereinigtem SS-A (Ro) Autoantigen (52 und 60 kda) beschichtet. Auf einer Mikrotiterplatte können 96 Bestimmungen durchgeführt werden. Jede Mikrotiterplatte setzt sich aus 12 einzelnen Streifen mit jeweils 8 Kavitäten zusammen. Bei Bedarf können die Streifen in einzelne Kavitäten zerteilt werden. Die drei Reaktionsschritte stellen sich wie folgt dar: 1. Reaktionsschritt Die Antikörper in Standards, Kontrollen und Patientenproben werden an die immobilisierten Antigene in den Kavitäten gebunden. 2. Reaktionsschritt Das zugegebene Enzymkonjugat (anti-human-igg Meerrettich-Peroxidase) erkennt spezifisch die gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexe. 3. Reaktionsschritt Die gebundene Peroxidase setzt ein zugegebenes Substrat (TMB) in ein gefärbtes Produkt um. Auswertung Die optische Dichte der Proben wird in einem ELISA-Photometer bei 450 nm gemessen. Die Farbentwicklung ist direkt proportional zur gesuchten Autoantikörper-Konzentration. 4

5 LIEFERUMFANG DES TESTS Mikrotiterplatte mit 96 abbrechbaren Kavitäten, die mit...1 hochgereinigtem SS-A (Ro) Antigen (52 und 60 kda Protein) beschichtet sind Farbcode: Rot Probenpuffer, Konzentrat, (gelb)... 1 Fläschchen, 20 ml Waschpuffer, Konzentrat... 1 Fläschchen, 20 ml Konjugat... 1 Fläschchen, 15 ml anti-human IgG, Peroxidase konjugiert, gebrauchsfertig (rosa), TMB Substratlösung, 3,3`, 5,5`-Tetramethylbenzidin, gebrauchsfertig... 1 Fläschchen, 15 ml Stopplösung, 1M HCl, gebrauchsfertig... 1 Fläschchen, 15 ml Kontrollen, gebrauchsfertig... je 1 Fläschchen, 1,5 ml - Kontrolle 1 Positivkontrolle - Kontrolle 2 Negativkontrolle Standards A bis F, gebrauchsfertig mit den Konzentrationen:...je 1 Fläschchen, 1,5 ml 0-12, U/ml Arbeitsanleitung/Qualitätskontroll-Zertifikat TECHNISCHE DATEN Untersuchungsmaterial Serum oder Plasma Erforderliche Probenmenge 10 µl Probe für eine 1 : 101 Probenvorverdünnung 100 µl verdünnte Probe pro Einzelbestimmung Gesamt-Inkubationszeit 60 Min. bei Raumtemperatur (20-28 C) Meßbereich: U/ml Empfindlichkeit: 1 U/ml Meßwellenlänge 450 nm Lagerung bei 2-8 C im Kühlschrank ERFORDERLICHE LABORGERÄTE Geräte/Reagenzienvorbereitung - Plattenphotometer mit einem optischen Filter der Meßwellenlänge 450 nm (ggf. Referenzwellenlänge von 620 nm) - Wirbelmischer (Vortex) - Mikropipetten mit Einmalspitzen für 10 µl, 100 µl und 1000 µl, evtl. Multipette - destilliertes Wasser - Meßzylinder für 100 ml und 1000 ml - Gefäß zur Aufbewahrung der Waschlösung 5

6 VORBEREITUNG DER REAGENZIEN Alle Komponenten dieses Testbesteckes liegen bis auf den Probenpuffer und den Waschpuffer gebrauchsfertig vor. Die Lösungen sind nach dem Öffnen der Fläschchen und bei Lagerung im Kühlschrank bei 2-8 C bis zum aufgedruckten Verfallsdatum haltbar. Waschlösung Jede Flasche des Waschpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml (1 Liter) zu verdünnen. Die verdünnte Waschlösung ist bei einer Lagerung bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. Probenpuffer Jede Flasche des Probenpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 100 ml zu verdünnen. Der verdünnte Probenpuffer ist bei einer Lagerung bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. Mikrotiterplatte Es werden je nach Probenaufkommen die nötige Anzahl von Streifen oder Einzelkavitäten in den Rahmen der Mikrotiterplatte eingesetzt. Es sollte unbedingt darauf geachtet werden, daß die verpackte Mikrotiterplatte bereits Raumtemperatur angenommen hat, ehe die Folienverpackung geöffnet wird. Die nicht benötigten Streifen bzw. Kavitäten werden in dem wiederverschließbaren Beutel bei 2-8 C aufbewahrt. Achtung: Werden bei einem Assayansatz nicht alle Streifen bzw. Kavitäten benötigt, muß der Rahmen der Mikrotiterplatte aufbewahrt werden. Nach Beendigung eines Testansatzes sollten die verbrauchten Kavitäten verworfen und der Rahmen der Mikrotiterplatte in den Kit zurück gelegt werden. PROBENENTNAHME UND PROBENVORBEREITUNG Die Bestimmung der Autoantikörper wird im Serum oder Plasma durchgeführt. Die Serum- bzw. Plasmaproben werden vor der Messung 1 : 101 mit Probenpuffer verdünnt. 10 µl Probe plus 1000 µl Probenpuffer Serum- und Plasmaproben können gekühlt bei 2-8 C bis zu 5 Tage aufbewahrt werden. Ist eine längere Lagerung beabsichtigt, sollten die Proben aliquotiert und bei -20 C tiefgefroren werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden. Seren und Plasmen mit erhöhten Bilirubinwerten, hämolytische oder lipämische Proben stören die Bestimmung nicht. TECHNISCHE HINWEISE Zur laufenden Kontrolle der Richtigkeit wird empfohlen, jeden Ansatz anhand von Kontrollseren zu überprüfen. 6

7 ASSAYDURCHFÜHRUNG Vor Testbeginn müssen alle Reagenzien sowie die Patientenseren Raumtemperatur angenommen haben. 1. Eine ausreichende Anzahl von Kavitäten bzw. Mikrotiterplatten-Module zum Ansatz von Standards, Kontrollen und Patientenproben vorbereiten. Doppelbestimmungen werden empfohlen. 2. Jeweils 100 µl Standards, Kontrollen und vorverdünnte Patientenproben entsprechend der Plattenbelegung in die Mikrotiterplatte pipettieren. Vorschlag für ein Pipettierschema: A SA SE P1 P5 B SA SE P1 P5 C SB SF P2 P.. SA - SF: Standards A bis F D SB SF P2 P.. P1, P2... Pantientenprobe 1, 2... E SC K1 P3 K1: Positivkontrolle F SC K1 P3 K2: Negativkontrolle G SD K2 P4 H SD K2 P4 1. Inkubation: 30 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) 3. Kavitäten entleeren und insgesamt 3 Mal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen. Einwirkzeit des Waschpuffers: mindestens 25 sec. Waschpufferreste müssen vollständig aus den Kavitäten entfernt werden. Hierzu sollte die Mikrotiterplatte mehrere Male kräftig mit der Öffnung nach unten auf eine saugfähige Unterlage ausgeschlagen werden. 4. Jeweils 100 µl Enzymkonjugatlösung in die Kavitäten der Mikrotiterplatte pipettieren. 2. Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) 5. Kavitäten entleeren und insgesamt 3 Mal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen. Einwirkzeit des Waschpuffers: mindestens 25 sec. Waschpufferreste müssen vollständig aus den Kavitäten entfernt werden. Hierzu sollte die Mikrotiterplatte mehrere Male kräftig mit der Öffnung nach unten auf eine saugfähige Unterlage ausgeschlagen werden. 6. Jeweils 100 µl TMB Substratlösung in die Kavitäten pipettieren. 3. Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) µl Stopplösung in jede Kavität pipettieren und die Platte ca. 5 Minuten stehen lassen. 8. Messung der optischen Dichte aller Proben im Plattenphotometer innerhalb von 30 Minuten bei einer Wellenlänge von 450 nm. Bitte beachten Sie: Alle angegebenen Inkubationszeiten müssen eingehalten werden. Alle Pipettierschritte sind bei allen Inkubationen in einheitlicher Reihenfolge und einheitlichem Zeittakt durchzuführen. 7

8 AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE Eine Standardkurve erhält man durch Auftragen der gemessenen optischen Dichte gegen die vorgegebene Standardkonzentration. NORMALWERTE Im Rahmen einer umfangreichen Normbereichsstudie wurde anhand von Blutspender-Seren mit dem vorliegend Test die folgenden Werte ermittelt: Normal < 15 U/ml Grenzwertig U/ml Erhöht > 25 U/ml SENSITIVITÄT Die untere Nachweisgrenze beträgt 1,0 U/ml. SPEZIFITÄT Die Kavitäten der Mikrotiterplatte sind mit affinitätschromatographisch aufgereinigtem SS-A (Ro) Antigen beschichtet. Der Assay erfaßt daher nur spezifisch Autoantikörper der IgG-Klasse, die gegen das genannte Antigen gerichtet sind. KALIBRIERUNG Die Kalibrierung des Assays erfolgt unter Berücksichtigung der CDC-Seren. LINEARITÄT Für die Verdünnungsexperimente wurden Seren/ Plasmen mit hohen Antikörperkonzentrationen in steigenden Verdünnungsstufen (Verdünnung im Probenpuffer) im Assay eingesetzt. Die Ergebnisse sind über den gesamten Meßbereich linear. 8

9 REPRODUZIERBARKEIT In den untenstehenden Tabellen sind die Variationskoeffizienten (VK %), die für die Intra- und die Inter-Assay-Varianz des Anti-SS-A Assays ermittelt wurden, aufgeführt. Zur Ermittlung der Intra-Assay-Varianz wurden drei Seren mit unterschiedlichen Autoantikörper- Konzentrationen jeweils 24-fach auf einer Platte gemessen. Für die Bestimmung der Inter-Assay-Varianz wurden drei Proben mit unterschiedlichen Autoantikörper- Konzentrationen auf fünf Platten jeweils sechsfach gemessen. Proben Nr. Intra-Assay Mittelwert [U/ml] Variationskoeffizient (%) Proben Nr. Inter-Assay Mittelwert [U/ml] Variationskoeffizient (%) 1 32,2 2,7 1 33,8 6,4 2 73,2 2,6 2 71,1 6, ,0 3, ,1 1,1 LITERATUR Barland, P., Lipstein, E. Selection and use of laboratory tests in the rheumatic diseases. Am. J. Med. Vol. 100 (suppl 2A), 16s-23s, Feltkamp, T.E.W. Antinuclear antibody determination in a routine laboratory. Ann. Rheum. Dis. Vol. 55, , Fritzler, M.J. Clinical relevance of autoantibodies in systemic rheumatic diseases. Mol. Biol. Rep. Vol. 23, , Hiepe, F., Burmester, G.R. Klinik und Diagnostik des systemischen Lupus erythematodes. Dtsch. med. Wschr. Vol.121, , Hietarinta M, Lassila, O. Clinical significance of antinuclear antibodies in systemic rheumatic disease. Ann. Med. Vol. 28, , Nakamura, R.M., Tan, E.M. Update on autoantibodies to intracellular antigens in systemic rheumatic diseases. Clin. Lab. Med. Vol. 12, 1-23, Sanchez-Guerrero, J., Lew, R.A., Fossel, A.H. Schur, P.H. Utility of anti-sm, anti-rnp, anti-ro/ss-a, and anti-la /SS-B (extractable nuclear antigens) detected by enzyme linked immunosorbent assay for the diagnosis of systemic lupus erythematodes. Arthitis Rheum. Vol. 39, ,

10 HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN Alle Reagenzien dieser Testpackung dürfen ausschließlich zur in vitro-diagnostik verwendet werden. Die Einhaltung des vorgeschriebenen Protokolls zur Durchführung des Tests ist unbedingt erforderlich. Die Richtlinien zur Durchführung der Qualitätskontrolle in medizinischen Laboratorien sind zu beachten (Mitführen von Kontrollen, Poolseren). Einzelne Komponenten verschiedener Chargen und Testbestecke sollten nicht ausgetauscht werden. Die auf der Verpackung und den Etiketten der einzelnen Komponenten angegebenen Verfallsdaten sind zu beachten. Der Testkit enthält Reagenzien, die aus humanen Serum- oder Plasmabestandteilen hergestellt sind. Die Ausgangsreagenzien wurden mit Immunoassaymethoden auf Antikörper gegen HIV 1, HIV 2, HCV und auf das Hepatitis B Oberflächenantigen untersucht. Alle getesteten Parameter wurden für negativ befunden. Für den Umgang mit Kitreagenzien, Kontroll- und Serumproben sind die Vorschriften zur Unfallverhütung für den Gesundheitsdienst beim Umgang mit potentiell infektiösem Material einzuhalten. Das Untersuchungsmaterial ist stets als potentiell infektiös einzustufen. Unter den gleichen Sicherheitsvorkehrungen sind ebenso Kitreagenzien und Kontrollproben zu handhaben. Die Reagenzien dieses Testbestecks enthalten zum Schutz gegen bakterielles Wachstum Konservierungsmittel; daher ist die Berührung mit der Haut und/oder Schleimhäuten zu vermeiden. Das Substrat TMB (3,3`,5,5`-Tetramethylbenzidin) ist toxisch bei Verschlucken und bei Berührung mit der Haut. Bei Berührung mit der Haut sofort mit viel Wasser und Seife abwaschen. Vermeiden Sie den Kontakt der Peroxidlösung mit leicht oxidierbaren Materialien. Extreme Temperaturschwankungen können zum spontanen Zerfall des Peroxids führen. Ein Kontakt mit der Salzsäure enthaltenden Stopp-Lösung ist zu vermeiden. Bei Hautkontakt unverzüglich und kräftig mit Wasser abwaschen. Alle Geräte sofort nach Gebrauch gründlich reinigen. 10

11 KURZANLEITUNG 11