E L I S A. ENA 8 Profil. zur qualitativen Bestimmung von Autoantikörpern gegen. dsdna, RNP, Sm, SS-A/Ro, SS-B/La, Scl-70, CENP-B und Jo-1

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1 1408AE30.FWD E L I S A ENA 8 Profil zur qualitativen Bestimmung von Autoantikörpern gegen dsdna, RNP, Sm, SS-A/Ro, SS-B/La, Scl-70, CENP-B und Jo-1 Gebrauchsinformation Art.-No Vita Diagnostika GmbH Im Großacker 2b D Merzhausen/Frbg. (FRG) Tel (0)761/ Fax 0049 (0)761/ Vita-Diagnostika@online.de

2 Inhalt 1. Einführung und Hintergrund 2. Sicherheitshinweise und Vorsichtsmaßnahmen 3. Testprinzip 4. Inhalt des Testkits 5. Benötigte, aber nicht mitgelieferte Materialien 6. Aufbewahrung des Testkits 7. Reagenzien- und Probenvorbereitung / Anforderungen an die Proben 8. Durchführung des Tests 9. Auswertung und Qualitätskontrolle 10. Interpretation der Ergebnisse / Grenzen der Methode 11. Testcharakteristika 12. Garantie und Haftung 13. Kurzanleitung Das hier (Dokument-Id. / Ver.-No. / Datum: 1408AE30.FWD / 1101F / 11. Januar 2006) beschriebene Produkt wurde in Übereinstimmung mit IVD- Direktive 98/79/EG hergestellt von: Steffens Biotechnische Analysen GmbH Baumgartenstr. 5 D Ebringen (FRG) Die technische Dokumentation des Produktes liegt beim Hersteller vollständig vor und wird bei einem Zwischenfall mit dem Produkt oder bei einer offiziellen Anfrage ohne Verzug übermittelt

3 1. Einführung und Hintergrund Zirkulierende Antikörper gegen vielfältige zelluläre Antigene sind charakteristisch für systemische Autoimmun-Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises. Zu diesen zählen: Systemischer Lupus Erythematodes (SLE), Mischkollagenose (Mixed Connective Tissue Disease, MCTD), Sjögren- Syndrom (SS), progressive systemische Sklerodermie (PSS) bzw. CREST- Syndrom, rheumatoide Arthritis (RA) und Polymyositis (PM). Oft lassen sich diese Krankheiten anhand der Autoantikörper identifizieren, die mit ihnen assoziiert sind. 8 der von diesen Antikörpern erkannten Antigene sind auf der Festphase des vorliegenden Tests immobilisiert: Zeile Antigen Quelle Erkrankung A dsdna Plasmid SLE B RNP (Proteine A, C, 68kDa) rekombinant MCTD, SLE, RA, PSS C Sm (Proteine B, B', D) Rinderthymus SLE D SS-A/Ro (60kDa-Protein) Rinderthymus SS, SLE E SS-B/La rekombinant SS, SLE F Scl-70 (DNA-Topoisomerase 1) rekombinant PSS G CENP-B rekombinant PSS (CREST) H Jo-1 (Histidyl-tRNA-Synthetase) rekombinant PM Der vorliegende Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) ist dazu bestimmt, die individuellen Autoantikörper der IgG-Klasse in menschlichem Serum qualitativ zu bestimmen; zur Eingangsdiagnose bei Verdacht auf eine der o.g. Erkrankungen. Die Festphase kann in 12 8er-Streifen (Spalten) unterteilt werden und gestattet so eine freie Wahl der Analysenzahl (1-12). Der Test ist schnell; die Inkubationszeit beträgt Minuten. Die Reagenzien sind z.t. farbcodiert und gebrauchsfertig. Eine negative und eine positive Kontrolle prüfen die Test-Performance; die Positivkontrolle dient gleichzeitig als Kalibrator für die Testauswertung. 2. Sicherheitshinweise und Vorsichtsmaßnahmen Der Test ist ausschließlich für die in vitro-diagnostik bestimmt. Der Probenpuffer und die Kontrollen enthalten Na-Azid als Stabilisator. Der Waschpuffer enthält Bromonitrodioxan als Stabilisator und das Konjugat Methylisothiazolon/Bromonitrodioxan. Das Substrat enthält 3,3',5,5' - 2 -

4 Tetramethylbenzidin (TMB) und Wasserstoffperoxid (H2O2). Die Stoplösung, 0,5 M Schwefelsäure (H2SO4), ist sauer und ätzend. Diese Reagenzien sind giftig. Daher müssen die üblichen Vorsichtsmaßnahmen bei der Handhabung gefährlicher Chemikalien getroffen werden. Jeden Körperkontakt vermeiden, Handschuhe und Schutzbrille tragen. Sollte dennoch Haut (oder Schleimhaut) von einem Reagenz benetzt werden, die betroffene Stelle mit viel Wasser abspülen. Nicht mit dem Mund pipettieren. Na-Azid kann mit Kupfer- und Bleirohren reagieren und explosive Metallazide bilden. Beim Entsorgen mit Wasser nachspülen, um ein Akkumulieren von Azid zu verhindern. Die Kontrollen enthalten Komponenten menschlichen Ursprungs. Sie wurden daraufhin geprüft, ob Human Immunodeficiency Virus (HIV)-Ag, Hepatitis B- Oberflächen (HBs)-Ag und Antikörper gegen HIV 1/2 und Hepatitis C-Virus (HCV) vorliegen und zeigten negative Resultate; entweder in einem FDAzugelassenen Test oder einem Test mit CE-Zeichen, entsprechend der Europäischen Richtlinie 98/79/EC. Allerdings kann kein Test garantieren, daß Material humanen Ursprungs tatsächlich nicht infektiös ist. Die Präparate sollten daher als potenziell infektiös behandelt und entsprechend entsorgt werden. 3. Testprinzip Die Kavitäten der Festphase sind zeilenweise beschichtet mit den 8 oben genannten Antigenen. An ihrer Oberfläche laufen die folgenden immunologischen Reaktionen ab: 1. Inkubationsschritt: Affine Autoantikörper aus dem Patientenserum binden an das jeweilige immobilisierte Antigen; es bildet sich der Antigen-Antikörper- Komplex. Nicht-gebundene Probenbestandteile werden anschließend von der Festphase gewaschen. 2. Inkubationsschritt: Ein Enzym-markiertes, gegen human-igg gerichtetes Antikörper-Präparat (Konjugat) wird zugesetzt. Es bindet seinerseits an den Antigen-Antikörper-Komplex. Überschüssiges Konjugat wird anschließend von der Festphase gewaschen. 3. Inkubationsschritt: Substrat für das Enzym wird zugegeben. Durch den gebundenen, Enzym-markierten Antigen-Antikörper-Komplex wird das farblose Substrat in ein farbiges Produkt umgesetzt. Das Ausmaß der Farbentwicklung spiegelt die Menge des jeweiligen Autoantikörpers (IgG) in der Probe wider

5 4. Inhalt des Testkits a. 1 Kavitätenplatte im Mikrotiter-Format, zeilenweise beschichtet mit 8 individuellen Autoantigenen (s. o.). Die Platte kann beliebig in 1-12 Einzelstreifen (Spalten) geteilt werden und ist in einem Beutel aus laminierter Metallfolie hermetisch verpackt. Der Beutel enthält zusätzlich Trockenmittel. b. negative Kontrolle und positive Kontrolle (= Kalibrator); jeweils 3,0 ml; gebrauchsfertig; gelb (in Fläschchen mit blauen Deckeln). Milieu: endverdünnter Probenpuffer. c. 100 ml Waschpuffer-15x-Konzentrat; farblos. Enthält Tris-gepufferte Saline (Tris-buffered saline, TBS), Tween und Bromonitrodioxan. d. 20,0 ml Probenpuffer-10x-Konzentrat; gelb. Enthält TBS, Rinderserum- Albumin (bovine serum albumin, BSA), Tween und Na-Azid. e. 14 ml anti-human-igg Peroxidasekonjugat; gebrauchsfertig; grün. Gepufferte Lösung mit Stabilisator-Protein, Methylisothiazolon und Bromonitrodioxan. f. 14 ml Substratlösung; gebrauchsfertig; farblos; in einem Lichtundurchlässigen Gefäß. Gepufferte Lösung, enthält TMB und H2O2. g. 14 ml Stoplösung; farblos; gebrauchsfertig. 0,5 M H2SO4: Vorsicht ätzend! h. Gebrauchsinformation (auf CD-ROM) i. Chargen-spezifisches Analysenzertifikat 5. Benötigte, aber nicht mitgelieferte Materialien a. Deionisiertes oder destilliertes Wasser b. Meßzylinder für 250 und 2000 ml c. Reagenzröhrchen für die Probenverdünnung (Transfer-Röhrchen im Mikrotiterplatten-Format empfohlen) - 4 -

6 d. Pipetten für µl (1- und Mehr-Kanalpipetten empfohlen) e. Mikrotiterplatten-Wascher (optional) f. Mikrotiterplatten-Photometer mit 450 nm-filter g. ELISA Auswertungs-Software (empfohlen) 6. Aufbewahrung des Testkits Der Testkit muß bei 2-8 C gelagert werden. Er ist bis zum Verfallsdatum einsetzbar, das auf dem Etikett der Verpackung angegeben ist; danach nicht mehr verwenden. 7. Reagenzien- und Probenvorbereitung / Anforderungen an die Proben Wegen möglicherweise unterschiedlichen Lagerungs- und Transport- Bedingungen dürfen korrespondierende Komponenten aus verschiedenen Kits nicht vermischt oder gegeneinander ausgetauscht werden. a. Den Beutel mit der Kavitätenplatte akklimatisieren lassen, erst dann öffnen. Die für den aktuellen Test evtl. nicht benötigten Mikrotiter-Streifen (Spalten) sofort aus dem Gitterrahmen nehmen und zusammen mit dem Trockenmittel in den Folienbeutel zurücklegen. Diesen mit Klebeband hermetisch verschließen und bis zur künftigen Verwendung weiter bei 2-8 C lagern. b. Das Waschpuffer-15x-Konzentrat (100 ml, farblos) wird mit 1400 ml deionisiertem Wasser verdünnt und durchmischt. Gekühlt bei 2-8 C ist diese Lösung für mehrere Wochen stabil. Für 8 Kavitäten (1 Streifen) werden 2,00 ml Konzentrat benötigt, die auf 30,0 ml aufgefüllt werden. c. Das Probenpuffer-10x-Konzentrat (20,0 ml, gelb) wird mit 180 ml deionisiertem Wasser verdünnt und durchmischt. Gekühlt bei 2-8 C ist diese Lösung für mehrere Wochen stabil. Für 8 Kavitäten (1 Streifen) wird 1,00 ml Konzentrat benötigt, das auf 10,0 ml aufgefüllt wird. d. Präparation der Proben: Serenproben als potenziell infektiös betrachten und entsprechend vorsichtig handhaben. Sie werden mit dem Probenpuffer 1:100 in Reagenzröhrchen verdünnt; bspw. 10 µl Serum µl Probenpuffer. Die Verdünnungen gut durchmischen

7 Zum schnellen Dispensieren während des Assays empfiehlt es sich, die Kontrollen und die verdünnten Proben in Transferröhrchen (Microplate- Format) vorzulegen. Dann kann mit einer 8-Kanal-Pipette gearbeitet werden. Proben, die nicht sofort analysiert werden können, müssen bei 2-8 C gelagert und innerhalb von 3 Tagen gemessen werden. Ist eine längere Lagerung vorgesehen, so müssen sie eingefroren werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist zu vermeiden. Aufgetaute Proben vor dem Verdünnen durchmischen. Anforderungen an die Proben: Stark lipämische oder hämolysierte Proben sowie mikrobiell verunreinigte Seren können falsche Ergebnisse liefern und sollten daher vermieden werden. 8. Durchführung des Tests Bevor der Test gestartet wird, müssen alle Kitkomponenten Raumtemperatur (23 ± 3 C) angenommen haben. Um das bestmögliche Ergebnis (d.h. ein maximales Verhältnis zwischen spezifischem und Hintergrund-Signal) zu erreichen, ist sorgfältiges Waschen ganz wesentlich (Schritte a, c und e). Insbesondere ist es wichtig, die Waschlösung vollständig aus den Kavitäten zu entfernen. Dazu klopft man die Festphase auf mehrlagigem Saugpapier kräftig aus. Automatische Wascher müssen daraufhin geprüft werden, ob ihre Ergebnisse mit denen vergleichbar sind, die mit manuellem Waschen erzielt werden. a. Unmittelbar vor Testbeginn die Kavitäten mit je 300 µl Waschpuffer füllen, ca. 10 Sekunden einwirken lassen und wieder entleeren. b. Die Kavitäten der Streifen (Spalten) jeweils mit den beiden Kontrollen und den Proben befüllen; 100 µl/kavität (s. Abbildung). 30 Minuten bei Raumtemperatur (23 ± 3 C) inkubieren

8 c. Die Kavitäten 4x wie in Schritt a. waschen. d. Je 100 µl Konjugat (14 ml, grün, gebrauchsfertig) zügig (am besten mit einer Mehrkanal-Pipette) in die Kavitäten pipettieren. Inkubieren wie in Schritt b. e. Waschschritt c. wiederholen. f. Je 100 µl Substrat (14 ml, farblos, gebrauchsfertig) zügig (am besten mit einer Mehrkanal-Pipette) in die Kavitäten pipettieren. Inkubieren wie in Schritt b. Das Substrat ist lichtempfindlich; direkte Belichtung vermeiden. g. Je 100 µl Stoplösung (14 ml, farblos, gebrauchsfertig. Vorsicht ätzend!) zügig (am besten mit einer Mehrkanal-Pipette) in die Kavitäten pipettieren; in derselben Reihenfolge wie beim Substrat: Farbumschlag von blau nach gelb. Zur Durchmischung von Substrat und Stoplösung die Festphase für ca. 10 Sekunden vorsichtig agitieren, am besten auf einem Schüttler. h. Die Platte im Mikrotiterplatten-Photometer bei 450 nm messen. Überschüssige Reagenzien weiter bei 2-8 C lagern, wenn sie später noch einmal verwendet werden sollen. 9. Auswertung und Qualitätskontrolle Bei der (qualitativen) Testauswertung wird die optische Dichte (OD) der Proben mit der grenzwertigen OD (= Cut Off-OD) verglichen, Parameter für Parameter. Diese errechnet sich mit Hilfe der positiven Kontrolle (= Kalibrator) nach folgender Formel: - 7 -

9 OD Grenzwert = OD Kalibrator x Faktor Der Faktor hängt von der Kit-Charge ab und ist im Chargen-spezifischen Analysen-Zertifikat angegeben; individuell für jeden Parameter. Das Analysen- Zertifikat liegt jedem Kit bei. Beispiel: OD Kalibrator = 1250 mod Faktor = 0,35 OD Grenzwert = 1250 mod x 0,35 = 438 mod Um einen Eindruck zu gewinnen, wie hoch positiv eine bestimmte Probe ist, kann man nach folgender Formel ihre Ratio berechnen: Ratio = OD Probe / OD Grenzwert Beispiel: OD Grenzwert = 438 mod OD Probe = 1480 mod Ratio = 1480 mod / 438 mod = 3,4 Qualitätskontrolle: Die positive und die negative Kontrolle dienen der Überprüfung des Tests. Ihre Sollwerte lauten: positive Kontrolle (Kalibrator) negative Kontrolle > 0,6 OD 450nm < 0,3 OD 450nm Die Meßwerte der Kontrollen müssen diese Bedingungen erfüllen; ansonsten sind die Ergebnisse des Tests nicht gültig. Sie gelten einheitlich für alle 8 Parameter. 10. Interpretation der Ergebnisse / Grenzen der Methode Auf der Basis einer Serienmessung von Blutspenderseren (n = 80) schlagen wir für die Beurteilung von Patientenseren vor: Ratio normaler (neg.) Bereich < 0,80 Cut Off 1,0 grenzwertiger Bereich 0,80-1,25 positiver Bereich > 1,25-8 -

10 Diese Spezifikationen gelten einheitlich für alle 8 Parameter. Sie sind jedoch nur als Anhaltspunkt zu verstehen. Zu ihrer Überprüfung sollten in jedem Test Normalseren mitgeführt werden. Ein negatives Ergebnis zeigt an, daß der Patient keinen abnormen Titer an IgG- Antikörpern gegen das betreffende Antigen aufweist. Das Vorliegen der jeweils assoziierten Autoimmun-Erkrankung (wie eingangs ausgeführt) ist daher eher unwahrscheinlich, aber nicht ausgeschlossen. Ein positives Ergebnis sollte als Hinweis auf die betreffende Krankheit verstanden werden. Proben mit grenzwertigen Resultaten sollten als zweifelhaft betrachtet und als solche berichtet werden. Es empfiehlt sich, nach ein paar Tagen eine weitere Probe zu messen, parallel mit der zuerst entnommenen, um eine mögliche Änderung des Antikörper-Titers zu erfassen. Der grenzwertige Bereich wurde beim vorliegenden Test absichtlich weiter gefaßt als bei quantitativen ELISAs, die anhand einer Standardkurve ausgewertet werden. Wie bei jedem serologischen Test sollten dessen Resultate nicht isoliert interpretiert werden, sondern im Zusammenhang mit den Symptomen des Patienten und anderen diagnostischen Kriterien. 11. Testcharakteristika Standardisierung: Der Test wird mit einem gereinigten Serumpräparat standardisiert, das IgG-Antikörper gegen jedes der 8 Antigene enthält. Es bildet das Ausgangsmaterial beider Testkontrollen. Das Verhältnis der Antikörper wurde so eingestellt, daß das Präparat auf allen 8 Festphasen (Zeilen) des Tests ungefähr dasselbe Signal erzeugt. Es wurde seinerseits an einem internen Referenzpräparat kalibriert, das ausschließlich für diesen Zweck reserviert ist. Der Grad der Reaktivität einer Probe wird als Ratio angegeben, wie oben ausgeführt; individuell für jeden der 8 Parameter. Analytische Spezifität: Der Test weist spezifisch und differenziell humane IgG- Antikörper nach, die gegen eines der angegebenen Antigene gerichtet sind. Er wurde u.a. anhand der allgemein zugänglichen, humanen Referenzseren des "Center of Disease Control" (CDC, Atlanta, USA) validiert. Folgende Resultate (Ratio-Werte) sind typisch: - 9 -

11 Serum CDC- ds- SS-B -- U1- Sm -- SS-A -- Scl- Jo- Resultat DNA /La RNP /Ro 70 1 Immun- homo- speck- speck nuc- -- cen Fluoreszenz gen led led leolar tro- /rim mere dsdna 3,5 0,2 0,2 0,2 0,4 0,1 0,4 0,2 0,4 0,1 RNP 0,8 0,2 5,0 3,9 5,3 1,0 0,3 0,2 0,3 0,2 Sm 1,8 0,2 1,6 0,2 5,4 0,2 0,2 0,1 0,2 0,2 SS-A/Ro 0,4 2,9 4,2 0,4 1,0 0,2 5,7 0,2 0,7 0,2 SS-B/La 0,2 6,6 5,6 0,2 0,3 0,6 0,2 0,2 0,3 0,2 Scl-70 0,3 0,2 0,3 0,3 0,6 1,0 0,2 0,2 5,6 0,2 CENP-B 0,3 0,2 0,2 0,2 0,3 0,2 0,2 4,4 0,3 0,2 Jo-1 0,3 0,2 0,3 0,3 0,3 0,2 0,3 0,2 0,3 7,7 Nachweisgrenze (analytische Sensitivität): Die Nachweisgrenze ist definiert als diejenige Konzentration des Analyten, die dem OD-Mittelwert des Probenpuffers entspricht, zu dem die 3-fache Standardabweichung (s) addiert wurde. Sie wurde zu < 0,2 (Ratio; n = 12) für jeden der 8 Parameter bestimmt. Empfohlener Meßbereich: 0,2 < Ratio < 7 (für jeden der 8 Parameter) Häufigkeitsverteilung der AK (IgG): In einem Serenkollektiv von 80 Blutspendern, gleichmäßig nach Geschlecht und Alter ausgesucht, wurde die folgende Verteilung der Analyten ermittelt (angegeben als Ratio): Parameter Mittelwert Mittelwert + 2s Median 95%-Percentile dsdna 0,28 0,75 0,21 0,63 RNP 0,32 0,57 0,29 0,55 Sm 0,18 0,23 0,18 0,22 SS-A/Ro 0,25 0,35 0,25 0,33 SS-B/La 0,31 0,87 0,24 0,66 Scl-70 0,40 0,83 0,33 0,72 CENP-B 0,25 0,41 0,23 0,38 Jo-1 0,28 0,51 0,25 0,43 Präzision: Um die Präzision des Tests zu ermitteln, wurde die Variabilität der Ergebnisse unter folgenden Bedingungen ermittelt: a. innerhalb eines Assays und zwischen 3 Assays, b. zwischen 3 Anwendern und c. zwischen 2 Kit-Chargen. Ratio- und Variationskoeffizient (VK)-Werte wurden über alle 8 Antigene gemittelt

12 a. Intra- und inter-assay Variabilität (n = 3 bzw. 9) Probe Ratio Variabilität (VK, %) intra-assay inter-assay 1 1,2 3,7 4,5 2 1,9 1,5 2,4 3 2,9 1,5 2,0 b. Operator-zu-Operator Variabilität (n = 2) Probe Ratio Variabilität (VK, %) 1 1,1 2,4 2 1,8 1,8 3 2,7 1,8 c. Variabilität zwischen 2 Kit-Chargen (n = 2) Probe Ratio Variabilität (VK, %) 1 1,1 5,3 2 1,8 3,3 3 2,8 6,0 12. Garantie und Haftung Steffens biotechnische Analysen GmbH (SBA) garantiert, daß das ausgelieferte Produkt gründlich getestet wurde, um sicherzustellen, daß es seine Spezifikationen erfüllt und der hier gegebenen Beschreibung entspricht. Weitergehende Garantien werden nicht gegeben. Die hier genannten Testcharakteristika wurden mit der angegebenen Methode ermittelt. Jede Änderung der Methode kann die Ergebnisse beeinflussen. In einem solchen Fall verweigert SBA jede Haftung, ob ausgesprochen, impliziert oder gesetzlich. Darüber hinaus kann SBA keinerlei Haftung für Schäden übernehmen, die aufgrund einer unkorrekten Lagerung oder Anwendung des Produktes entstanden sind; direkt, indirekt oder als Konsequenz

13 13. Kurzanleitung a. Das 15x-Konzentrat des Waschpuffers (100 ml, farblos) mit Wasser verdünnen und durchmischen. b. Das 10x-Konzentrat des Probenpuffers (20,0 ml, gelb) mit Wasser verdünnen und durchmischen. c. Die Serenproben 1/100 in Probenpuffer verdünnen und durchmischen. d. Unmittelbar vor Testbeginn die Kavitäten der Festphase mit je 300 µl Waschpuffer füllen, ca. 10 Sekunden einwirken lassen und wieder entleeren. e. Die Kavitäten mit den beiden Kontrollen (je 3,0 ml, gelb, gebrauchsfertig) und den verdünnten Proben befüllen: pro Kontrolle bzw. Probe je 1 Spalte; 100 µl/kavität. 30 Minuten bei Raumtemperatur (23 ± 3 C) inkubieren. f. Die Kavitäten 4x wie in Schritt d. waschen. g. Je 100 µl Konjugat (14 ml, grün, gebrauchsfertig) zügig in die Kavitäten pipettieren. Inkubieren wie in Schritt e. h. Waschschritt f. wiederholen. i. Je 100 µl Substrat (14 ml, farblos, gebrauchsfertig, in schwarzem Fläschchen) zügig in die Kavitäten pipettieren. Inkubieren wie in Schritt e. Direkte Belichtung vermeiden. j. Je 100 µl Stoplösung (14 ml, farblos, gebrauchsfertig. Vorsicht ätzend!) zügig in die Kavitäten pipettieren. Die Festphase anschließend kurz agitieren. k. Die Platte im Mikrotiterplatten-Photometer bei 450 nm messen. l. Auswertung (für jeden der 8 Parameter separat durchzuführen): Die grenzwertige optische Dichte ermitteln, indem die optische Dichte der positiven Kontrolle mit dem Faktor multipliziert wird, der im Analysen- Zertifikat angegeben ist. Dann die Ratio-Werte der Proben berechnen, indem ihre optische Dichte durch die grenzwertige optische Dichte dividiert wird