Das endogene Lysophospholipid Sphingosylphosphorylcholin ist ein potenter Aktivator der endothelialen NO-Synthase.
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- Anneliese Grosse
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1 Aus der Klinik für Nephrologie und Endokrinologie der Medizinischen Fakultät der Charité Universitätsmedizin Berlin DISSERTATION Das endogene Lysophospholipid Sphingosylphosphorylcholin ist ein potenter Aktivator der endothelialen NO-Synthase. zur Erlangung des akademischen Grades Doctor medicinae (Dr. med.) vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité Universitätsmedizin Berlin von Marco Maudrich aus Leipzig
2 Gutachter: 1. Prof. Dr. med. M. van der Giet 2. Prof. Dr. med. G. Schönfelder 3. Prof. Dr. med. B. Levkau Datum der Promotion:
3 Erlaubnis für die Durchführung von Tierexperimenten: Aktenzeichen: O 0086/ 01 Datum der behördlichen Genehmigung:
4 I.Inhaltsverzeichnis Seite I I. Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Die endotheliale Funktion NO-Synthasen Pathogenese der endothelialen Dysfunktion Sauerstoffradikalspezies NAD(P)H Oxidasen Atherosklerose Ätiologie Pathophysiologie HDL (High Density Lipoprotein) Epidemiologie Effekte des HDL auf die LDL Oxidation Antiatherosklerotische und antiinflammatorische Funktionen des HDL Lysophospholipide Lysophospholipide Bestandteil von HDL Fragestellung Material und Methoden Material Verwendete Pufferlösungen und Substanzen Substanzen Tiere zur Explantation Verwendete technische Materialien Geräte und Hilfsmittel Verbrauchsmaterial Software Firmenverzeichnis Der Kleingefäß-Myograph: Allgemeine Arbeitsweise des Myographen: Die allgemeinen physiologischen Gegebenheiten: Aufbau des Kleingefäß-Myographen: Der Versuchsablauf: Eichung des Kraftmessers:...25
5 I.Inhaltsverzeichnis Seite II Die Standardisierung des normalisierten Lumendurchmesser Beweise für die Vitalität der Gefäße: Dosiswirkungskurven verschiedener Agonisten: Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Versuchsergebnisse: Deendothelialisierung der Gefäße: Statistik: Ergebnisse Dosisabhängige Vasokonstriktion an thorakalen Aorten von WKY Ratten durch Phenylephrin Dosisabhängige Vasodilatation durch Acetylcholin an vorkontrahierten thorakalen Aorten von WKY-Ratten Dosisabhängige Vasodilatation an vorkontrahierten thorakalen Aorten von WKY-Ratten durch SNP Vasodilatation an mit L-NAME vorbehandelten und PE vorkontahierten thorakalen Aortenringen von WKY-Ratten mittels ACh und SNP Dosisabhängige Wirkung von Ach und SNP auf vorkontrahierte Aortenringe der in dieser Arbeit eingesetzten Tierstämme Wirkung einzelner HDL-Komponenten auf den Vasotonus von thorakalen Aortenringen von WKY-Ratte Vasodilatation an PE vorkontahierten thorakalen Aortenringen von WKY-Ratten mittels SPC Dosisabhängige Wirkung von SPC auf thorakale Aortenringe von enos defizienten- Mäusen und C57BL/6-Mäusen Wirkung von SPC und ACh auf die Vasodilatation unter enos Inhibition durch L-NAME und chemischer Endothelentfernung von thorakalen Aortenringen von WKY-Ratten Dosisabhängige Wirkung des Lysophospholipids SPC an thorakalen Aortenringen von WKY-Ratten unter basalen Bedingungen Diskussion Zusammenfassung Literaturverzeichnis Danksagung Curriculum vitae...63 Erklärung...64
6 II. Abbildungsverzeichnis Seite IV II. Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Geräteanordnung des Kleingefäß-Myographen (aus Procedure for investigation of small vessel using small vessel myograph, Mulvany M.J., 1996)...22 Abbildung 2: Darstellung der Kalibrierungswaage bei Eichung des Kraftmessers...25 Abbildung 3: Darstellung eines Normalisationsvorganges...27 Abbildung 4: Dargestellt ist die nicht kumlative DWK von PE in der Anwendung an thorakalen Aortenringen von WKY-Ratten am Kleingefäßmyographen...31 Abbildung 5: Dargestellt ist eine kumlative DWK von ACh an durch PE vorkontrahierten thorakalen Aortenringen von WKY-Ratten am Kleingefäßmyographen...32 Abbildung 6: Dargestellt ist die kumlative DWK von SNP an thorakalen Aortenringen von WKY-Ratte am Kleingefäßmyographen...33 Abbildung 7: Dargestellt ist die Wirkung von ACh und SNP auf mit PE vorkontrahierte thorakale Aortenringe von WKY-Ratten, sowie nach enos Inhibition durch L-NAME am Kleingefäßmyographen Abbildung 8: Dargestellt sind kumulative Dosis-Wirkungskurven von ACh und SNP an unterschiedlichen thorakalen Aortenringen von WKY-Ratten am Kleingefäßmyographen Abbildung 9: Dargestellt sind kumulative DWK von ACh und SNP an unterschiedlichen thorakalen Aortenringen von C57BL/6-Mäusen am Kleingefäßmyographen Abbildung 10: Dargestellt sind kumulative Dosiswirkungskurven von ACh und SNP an thorakalen Aortenringen von enos defizienten-mäusen am Kleingefäßmyographen Abbildung 11: DWK von ACh und SNP an thorakalen Aortenringpräparaten von S1P 3 defizienten Mäusen am Kleingefäßmyographen...38 Abbildung 12: Wirkung der aufgereinigten Lipid- und Proteinfraktion des HDL-Moleküls auf den Gefäßtonus thorakaler Aortenringe von WKY-Ratten am Kleingefäßmyographen Abbildung 13: Dargestellt ist der Einfluss von SPC auf den Gefäßtonus von verschiedenen vorkontrahierten thorakalen Aortenringen von WKY-Ratten am Kleingefäßmyographen Abbildung 14: Dargestellt sind kumulative DWK des HDL-assoziierten Sphingolipids SPC an verschiedenen vorkontrahierten thorakalen Aortenringen von enos defiziente-mäusen und C57BL/6-Mäusen am Kleingefäßmyographen Abbildung 15: Wikrung von SPC auf thorakale Aorten von WKY-Ratten unter verschiedenen Bedingungen...42 Abbildung 16: Wirkung von SPC auf die thorakalen Aortenringe von S1P 3 -Rezeptor +/+ und S1P 3 -Rezeptor -/- Mäusen am Kleingefäßmyographen....43
7 II. Abbildungsverzeichnis Seite V Abbildung 17: Dargestellt ist eine kumulative DWK der Wirkung des Lysosphospolipides SPC ohne Vorkontraktionsbedingungen an thorakaen Aortenringen von WKY-Ratten...44
8 III. Tabellenverzeichnis Seite VI III. Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Deutsche Todesursachenstatistik von 1999 (Quelle: Statistisches Bundesamt)...5 Tabelle 2: PSS (Tyrodelösung)...15 Tabelle 3: HBSS (HEPES modifizierte Salzlösung)...15
9 IV.Abkürzungsverzeichnis Seite VII IV. Abkürzungsverzeichnis Abkürzungen: ACh Acetylcholin Ang II Angiotensin II Antiphospholipid-Ak Antiphospholipid-Antikörper apoa-i Apolipoprotein A-I CaCl 2 Calciumchlorid camp cyclisches Adenosin-Mono-Phosphat cgmp zyklisches Guanosinmonophosphat CO 2 Kohlendioxid DNA (engl) Deoxyribonucleid Acid (Deoxyribonukleotid Säure) DPI Diphenylene iodonium DWK Dosis-Wirkungs-Kurve ECAT (engl.) European Concerted Action on Thrombosis and Disabilities Angina Pectoris Study EDG (engl.) Endothelial Differentiation Gene (endotheliales Differenzierungsgen) enos (engl.) endothlial Nitric Oxide Synthase (endotheliale Stickstoffmonoxid Synthase) FAD Flavin Adenin Dinuclteotid FMN Flavin-Mono-Nukleotid g Gramm G2A (engl.) G2 accumulation protein (G2 Akkumulationsprotein) GC Guanylatcyclase GMP Guanosin-Mono-Phosphat GPR-4 (engl.) G-Protein coupled receptor 4 (G-Protein gebundener Rezptor 4) GTP Guanosin-Tri-Phospat H Wasserstoff H + Häm HBSS HDL (engl.) Wasserstoffion Fe-Protorphyrin HEPES modifizierte Salzlösung High Density Lipoprotein (Lipoprotein hoher Dichte)
10 IV.Abkürzungsverzeichnis Seite VIII HDL-C (engl.) High Density Lipoprotein-Cholesterin H 2 O Wasser H 2 O 2 Wasserstoffsuperoxid HLA-DR (engl.) Human Leukocyte Antigen DR (humanes Leukozyten Antigen-DR) HUVEC (engl.) Humane Umbilical Venose Endothel Cells (humane umbilikale venöse Endothelzellen) IC (engl.) Internal Circumference (Innendurchmesser) ICAM-1 (engl.) Intercellular Adhesion Molecule-1 (Interzelluläres Adhäsionsmolekül-1) inos (engl.) induced Nitric Oxide Synthase (induzierbare Stickstoffmonoxid Synthase) γ-inf γ-interferon IUPHAR (engl.) International Union of Pharmacology (Internationale Union für Pharmakologie) K m KCl K 2 HPO 4 Kg KHK l LCAT (engl.) LDL (engl.) L-NAME LPA LPC LPL LPS LSF Michaelis-Menten-Konstante Kaliumchlorid Kaliumhydrogenphosphat Kilogramm Koronare Herzkrankheit Liter Lecithin Cholesterin Azyltransferase Low Density Lipoprotein (Lipoprotein geringer Dichte) L-Nitro-Arginin-N-Methyl-Arginin Lysophosphatidsäure Lysophosphatidylcholin Lysophopholipid Lipopolysaccharid Lysosulfatid MCP-1 (engl.) Monocyte Chemotactic Protein-1 (Chemotaktisches Monozyten Protein- 1) min Minuten ml Milliliter M Mol
11 IV.Abkürzungsverzeichnis Seite IX mm Millimeter mm Millimol µm Mikromol µm Mikrometer mn Millinewton NaCl Natriumchlorid NAD + Nikotinamid-Dinukleotid NADH Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid, reduzierte Form NADP Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat NAD(P)H Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat, protonierte Form NA 2 EDTA Dinatriumethylendiaminetetraessigsäure NaHCO 3 Natriumhydrogencarbonat NaH 2 PO 4 Natriumhydrogenphosphat Na 2 HPO 4 *2H 2 O Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat NE (engl.) Norepinephrin (Noradrenalin) nm Nanomol nnos (engl.) neuronal Nitric Oxide Synthase (neuronale Stickstoffmonooxid Synthase) NO Stickstoffmonoxid NO 2 Stickstoffdioxid NOS Stickstoffmonoxidsynthase O 2 - O 2 OH ONOO - ORG-1 (engl.) oxldl (engl.) P (engl.) PAF (engl.) PAF-AH (engl.) PDGF (engl.) Sauerstoff Superoxidradikal Hydroxygruppe Peroxynitrit Ovarian cancer G-Protein coupled receptor ( ovarial Carzinom gekoppelter G-Protein Rezeptor) oxidierte Form des Low Density Lipoproteins Pressure (Druck) Platlet Activating Factor (Plättchen Aktivierungsfaktor) Platlet Activating Factor Acetylhydrolase (Plättchen Aktivierungsfaktor-Acetylhydrolase) Platelet Derived Growth Factor (Plättchen gebildeter
12 IV.Abkürzungsverzeichnis Seite X PE Wachstumsfaktor) Phenylephrin PGE 2 Prostaglandin E 2 PGI 2 Prostaglandin I 2, Prostacyclin pm Picomol PSS physiologische Salzlösung RCT (engl.) Reverse Cholesterin Transport (reverser Cholesterintransport) ROS (engl.) Reactive Oxygen Species (Radikale Sauerstoffabkömmlinge) S1P Sphingosin-1-Phophat SNP (engl) Sodiumnitroprussid (Natrium Nitroprussid) SOD Superoxiddismutase SPC Sphingosyphosphorylcholin SR BI (engl.) Scavenger Rezeptor BI TGF (engl.) Tumor Growth Factor (Tumor Wachstumsfaktor) TNF-α (engl.) Tumor Necrosis Factor α (Tumornekrosefaktor α) t-pa (engl.) tissue Plasminogen Activator (Gewebe Plasminogen Aktivator) VA-HIT (engl.) High-Density-Lipoprotein Cholesterol Intervention Trial of the Department of Veterans Affairs VCAM-1 (engl.) Vascular Cell Adhesions Molecule 1 (Gefäßzelladhäsionsmolekül 1) VLDL (engl.) Very Low Density Lipoprotein (Lipoprotein sehr geringer Dichte) VSMCs (engl.) Vascular Smooth Muscel Cells (glatte Gefäßmuskelzellen) WKY Wistar Kyoto
13 7. Danksagung Seite Danksagung Herrn Prof. Dr. med. Markus van der Giet danke ich für die interessante Themenstellung, die Bereitstellung der Laborräume und Arbeitsmittel sowie die freundliche Hilfe in allen Situationen und die kritische Durchsicht meiner Arbeit. Mein herzlicher Dank gilt Herrn Dr. med Markus Tölle für die Betreuung während der Labortätigkeit und die Unterstützung bei der Erstellung dieser Arbeit. Besonders möchte ich Ihm danken für die verständnisvolle Förderung, die Bereitschaft Fragen geduldig zu beantworten, sowie seine Fähigkeit Probleme zu lösen. All das hat zur guten und entspannten Atmosphäre in der Arbeitsgruppe beigetragen. Für die gute Kooperation im Labor und die gemeinsame Nutzung der Arbeitsgeräte, möchte ich Frau Julia Steinhagen und Frau Nadja Müller danken. Frau Daniela Blaschke und Herr Konrad Henze haben ebenfalls wesentlich zum guten Klima und zur unkomplizierten Zusammenarbeit unserer Arbeitsgruppe beigetragen und für regen Gedankenaustausch gesorgt. Ich danke meiner Frau Barbara Mathis, die zu mir gehalten und mich in kritischen Stunden aufgebaut und motiviert hat. Besonders wichtig war und ist die Unterstützung meiner Familie, die mir den Rücken gestärkt und an mich geglaubt hat, sowohl während meines Studiums als auch bei der Erstellung dieser Arbeit. Ich danke ganz besonders meiner Großmutter Frau Hildegard Wollmann und meiner Tante Frau Dagmar Wollmann.
14 8. Lebenslauf Seite Lebenslauf Mein Lebenslauf wird aus Datenschutzgründen in der elektronischen Version meiner Arbeit nicht mit veröffentlicht. Name Maudrich (geborener Schmidt) Vorname Marco
15 Erklärung Seite 64 Erklärung Ich, Marco Maudrich, erkläre, dass ich die vorgelegte Dissertationsschrift mit dem Thema: Das endogene Lysophoshpolipid Sphingosylphosphorylcholin ist ein potenter Aktivator der endothelialen NO-Synthase selbst verfasst und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt, ohne die Hilfe Dritter verfasst und auch in Teilen keine Kopien anderer Arbeiten dargestellt habe. gez. Marco Maudrich Datum Unterschrift
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