Oxidativer- / Nitrosativer-Stress

Transkript

1 Oxidativer- / Nitrosativer-Stress Biochemische Grundlagen Dr. med. univ. Kurt Kraus Laborarzt Otto-Hahn-Straße Ettlingen 1

2 Inhalt Was ist oxidativer Stress? Was ist nitrosativer Stress? Was sind die wichtigsten reaktiven Sauerstoffverbindungen(ROS)? Wie und wodurch entstehen sie? Wie schädigen sie Gefäße und Neuronen? Was sind die wichtigsten Antioxidanzien? Wie werden oxidativer Stress und antioxidative Kapazität gemessen? 2

3 Molekulare Grundlagen Oxidativer Stress ist eine ständige überschießende Bildung reaktiver Sauerstoffverbindungen (ROS = reactive oxygen species). Es liegt ein ständiges Ungleichgewicht zwischen aggressiven ROS und schützenden Antioxidanzien vor. 3

4 Die wichtigsten reaktiven Sauerstoffverbindungen (ROS) (Hyperoxid-Anion) Wasserstoffperoxid Stickoxid-Radikal Hydroxyl-Radikal Peroxynitrit-Anion RNS RNS Huber J., Grundlagen der Altersprävention 4

5 Entstehung des Hydroxylradikals Das Hydroxylradikal entsteht in 2 Reaktionsschritten: Reduktion von dreiwertigem Eisen (z. B. Speichereisen im Ferritin) zu zweiwertigem Eisen durch das Superoxid- Anion: Fe 3+ + O 2 O 2 + Fe 2+ Rück-Oxidation des zweiwertigen Eisens unter gleichzeitiger Spaltung von Wasserstoffperoxid*: Fe 2+ + H 2 O 2 Fe 3+ + OH + OH * OH = Hydroxid-Anion, OH = Hydroxyl-Radikal Das Hydroxyl-Radikal ist eines der gefährlichsten Radikale! 5

6 Entstehung des Peroxynitrit-Anions Das Peroxynitrit-Anion entsteht durch die Verbindung des Stickoxid Radikals (NO ) mit dem Superoxid-Anion (O 2 ), vermutlich katalysiert durch die Superoxid- Dismutase (SOD): NO + O 2 SOD? ONOO ONOO hemmt die Cytochrom C-Oxidase der Atmungskette im Gegensatz zu NO nicht reversibel, sondern irreversibel, außerdem die Akonitase des Zitronensäurezyklus. Das Peroxynitrit-Anion ist äußerst gefährlich! 6

7 Entstehung des Superoxid-Anions Das Superoxid-Anion - entsteht unter der enzymatischen Aktivität von Oxidoreduktasen und Oxygenasen im Zytosol, in Peroxisomen und auf Zellmembranen - entsteht vorwiegend in der mitochondrialen Atmungskette, und zwar an Enzymkomplex I und vor allem an Enzymkomplex III. Kunsch and Medford 7

8 Entstehung des Superoxid-Anions in der Atmungskette Schematische Darstellung der mitochondrialen Atmungskette mit den Komplexen I und III Protonengradient Staustufe Hemmung der Cytochrom-Oxidase durch ONOO I Elektronenfähre III Elektronen - Stau IV ATP-Synthase V II O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 Überlauf O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 Entkoppelung der OXPHOS Hemmung Horn, F. et al., Biochemie des Menschen 1-4 % des Sauerstoffs werden nicht zu Wasser reduziert (am Komplex IV), sondern zum Superoxid-Anion (vorwiegend am Komplex III). 8

9 Entgiftung des Superoxid-Anions Das Superoxid-Anion entsteht u. a. in der mitochondrialen Atmungskette aus der Oxidation von NADH zu NAD + und wird hauptsächlich durch die Superoxid-Dismutase (SOD) entgiftet: O 2 + O 2 + 2H + SOD H 2 O 2 + O 2 Wasserstoffperoxid entsteht bei der Entgiftung des Superoxid-Anions durch die Superoxid-Dismutase (siehe oben), aber auch bei vielen anderen enzymatischen Reaktionen. Es wird entgiftet u. a. durch Glutathion-Peroxidase (GPX) bzw. Katalase: 2 H 2 O 2 GPX/Katalase 2 H 2 O + O 2 9

10 Hypertonie und altersbedingte Atherosklerose der Gefäße 1. Scherkräfte 2. Angiotensin II 3. biologisches Altern der Gefäße 10

11 Schwankungen des Blutdrucks mit phasenhaft steilem Blutdruckanstieg (psychischer Stress) lösen oszillierende Scherkräfte auf das Gefäßendothel aus, vor allem bei den Arteriolen. Die oszillierenden Scherkräfte führen zur verstärkten Bildung von H 2 O 2 und O 2 (im Verhältnis 100:1). Genauer Mechanismus unbekannt (eine Hypothese: über Einwirkungen auf das Zytoskelett). 11

12 Folgen der Bildung von O 2 und H 2 O 2 Entstehung von Peroxynitrit-Anionen ONOO - NO + O 2 SOD? ONOO Inaktivierung von NO-Radikalen, die im Endothel mit Hilfe des Enzyms enos (endotheliale Stickoxid- Synthase) gebildet wurden und unter physiologischen Bedingungen die Gefäßmuskulatur relaxieren NO -Mangel = Vasokonstriktion Entstehung von Hydroxylradikalen Fe 2+ + H 2 O 2 Fe 3+ + OH + OH 12

13 Weitere Folgeschäden durch die ROS: Oxidation von LDL (oxidiertes LDL) Oxidation ungesättigter Fettsäurereste in den Phospholipiden der Zellmembranen zu Lipidhydroperoxiden 13

14 Die ROS, das oxidierte LDL und die Lipidhydroperoxide aktivieren den Trankskriptionsfaktor NF-κ B (Nukleärer Faktor κ B) Synthese von Adhäsionsproteinen (ICAM-1; VCAM-1 = vascular cell adhesion molecule-1, MCP-1 = monocyte chemoattractant protein-1) Adhäsion von Leukozyten am Gefäßendothel Synthese pro-inflammatorischer Zytokine (u. a. TNF-alpha, Il-1, Il-6) Diese stimulieren ihrerseits NF-κ B Circulus vitiosus Folge: entzündliche Infiltration der Gefäßwände Arteriosklerose 14

15 Angiotensin II verstärkt in der Gefäßwand die Aktivität der NADPH-Oxidase Superoxid-Anionen induziert die Synthese der Adhäsionsproteine VCAM-1 und MCP-1 Arteriosklerose 15

16 Biologisches Altern der Gefäße 1) Mit fortschreitendem Alter stärkere Schädigung der mitochondrialen DNS durch oxidativen Stress im Vergleich zur chromosomalen DNS des Zellkerns, da in den Mitochondrien kein Schutz der DNS durch Histone. Zunehmend Defekte bei der Synthese von Enzymen der Atmungskette mitochondriale Atmung ROS-Bildung oxidativer Stress Arteriosklerose 16

17 2) Mit fortschreitendem Alter zunehmende Beeinträchtigung des Transports der SOD vom Zytosol in die Mitochondrien (Mangan-abhängige SOD2). Ursache: Punktmutation im Signal-Polypeptid (mitochondrial targeting sequence), das den SOD-Transport in die Mitochondrien veranlasst. Entgiftung von O 2 ROS und oxidativer Stress Arteriosklerose 17

18 3) Oxidativer Stress: Oxidation von intrazellulärem Glutathion Permeabilität der Mitochondrienmembran Cytochrom C wandert aus den Mitochondrien in das Zytosol Komplexbildung des Cytochrom C mit Apaf-1 (Apoptosom) Apoptose der Zelle 18

19 Zusammenfassung biologisches Altern der Gefäße 1) Schädigung der mitochondrialen DNS 2) Beeinträchtigung des Transports der SOD 3) Cytochrom C wandert aus den Mitochondrien in das Zytosol Apoptose 19

20 Diabetes mellitus 1. Entkoppelung der OXPHOS mit Hemmung der ATP-Synthase 1. Amadori, AGE und RAGE 2. Polyol-Weg 20

21 Hemmung der ATP-Synthase Hyperglykämie Glucosemetabolisierung durch Glykolyse und Zitratzyklus Coenzyme NADH und FADH 2 NADH und FADH 2 = Elektronendonatoren Überschuss an Elektronen gelangt in die mitochondriale Atmungskette. beginnender Überlauf der Elektronen auf O 2 Entkoppelung der OXPHOS ATP Rückstau der Elektronen, die dadurch verstärkt mit O 2 reagieren O 2 Arteriosklerose und Neuropathie 21

22 Entstehung des Superoxid-Anions in der Atmungskette Schematische Darstellung der mitochondrialen Atmungskette mit den Komplexen I und III Protonengradient Staustufe Hemmung der Cytochrom-Oxidase durch ONOO I Elektronenfähre III Elektronen - Stau IV ATP-Synthase V II O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 Überlauf O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 Entkoppelung der OXPHOS Hemmung Horn, F. et al., Biochemie des Menschen 1-4 % des Sauerstoffs werden nicht zu Wasser reduziert (am Komplex IV), sondern zum Superoxid-Anion (vorwiegend am Komplex III). 22

23 AGE-Synthese (advanced glycation end products) Bei Hyperglykämie zunächst Glykierung von Aminogruppen der Proteine über die Bildung von Schiff schen Basen und Amadori-Produkten (Zwischenprodukte) Löffler, G., Basiswissen Biochemie von den Amadori-Produkten ausgehend weitere chemische Reaktionen bis zur Bildung von AGEs. 23

24 Das Ausmaß der AGE-Synthese ist von der Glucose- Konzentration abhängig. Bindung der AGEs an Zelloberflächenrezeptoren (RAGEs = Rezeptoren für AGEs) Bildung von ROS Aktivierung von NF-κ B Synthese von Adhäsionsproteinen (ICAM-1, VCAM-1, MCP-1) und pro-inflammatorischen Zytokinen (TNF-alpha, IL-1, IL-6) Arteriosklerose und Neuropathie 24

25 Polyol-Weg Stoffwechselweg zum Verbrauch überschüssiger Glucose, die nicht für die Energiegewinnung durch Glykolyse, Zitratzyklus und mitochondrialer Atmungskette verwendet werden kann. Bei Gesunden von untergeordneter Bedeutung. Bei Diabetikern mit Hyperglykämie wird dagegen bis zu einem Drittel der Gesamt-Glucose über den Polyol-Weg verstoffwechselt. 25

26 Polyol-Weg: Glucose + NADPH + H + Aldo-Reduktase Sorbitol + NADP + bei ständiger Hyperglykämie Verbrauch der NADPH- Reserven NADPH steht für die Glutathion-Reduktase als Coenzym nicht mehr ausreichend zur Verfügung Erschöpfung der Reserven an reduziertem Glutathion = wichtigstes Antioxidans oxidativer Stress Arteriosklerose und Neuropathie 26

27 Entzündungen / Infektionen Interferon gamma stimuliert in Makrophagen die induzierbare Stickoxid-Synthase, welche über Arginin- Citrullin-Zyklus die Synthese des hochreaktiven Stickoxid-Radikals (NO-Radikals) katalysiert. Physiologische Wirkung des NO-Radikals: Abtöten von Krankheitserregern 27

28 NO-Radikal kann mit Superoxid-Anion zum Peroxynitrit- Anion reagieren NO + O 2 SOD? ONOO NO-Radikal und Peroxynitrit-Anion hemmen Enzyme des Zitronensäure-Zyklus und der mitochondrialen Atmungskette und damit die Energiegewinnung betroffener Zellen (insbes. von Neuronen). Schädigung der Membran- und Proteinstrukturen von Zellen (u. a. die innere Mitochondrienmembran) Folge: zelluläre Funktionsstörung (z.b. Erregungsleitungsstörungen) bis zum Zelltod; betroffen sind Neuronen und andere Zellen (z. B. Bindegewebszellen der Gelenkskapseln). nitrosativer Stress 28

29 NO hemmt die Cytochrom C-Oxidase der Atmungskette reversibel, ONOO - dagegen irreversibel Mitochondrienfunktion = Energiegewinnung herabgesetzt Betrifft vor allem die Neuronen (hoher Energiebedarf). Axonaler Transport von Zellstrukturproteinen ist eingeschränkt. Darüber hinaus direkte stressbedingte Schäden an Membran- und Proteinstrukturen der Neuronen. Neuropathie, z. B. bei chronischer Borreliose massive Freisetzung des Zytokins Interferon-γ durch Th1-Zellen inos-aktivität in Makrophagen nitrosativer Stress 29

30 Marker des oxidativen Stresses und der antioxidativen Kapazität Marker der Lipidperoxidation - Malondialdehyd (MDA) - oxidiertes LDL (oxldl) 30

31 Malondialdehyd (MDA) ROS oxidieren ungesättigte Fettsäurereste in den Phospholipiden der Zellmembranen. Es entstehen Lipidhydroperoxide = hochreaktive Zwischenprodukte; diese aktivieren den Transkriptionsfaktor NF-κ B (Adhäsionsproteine und pro-inflammatorische Zytokine) Die Lipidhydroperoxide - werden teilweise durch die Glutathion-Peroxidase (GPX) entgiftet, - gehen teilweise weitere chemische Reaktionen ein Malondialdehyd (MDA) MDA ist ebenfalls reaktiv und wirkt mutagen, indem es Verbindungen mit Nukleinbasen eingeht und so Punktmutationen auslösen kann. 31

32 Oxidiertes LDL (oxldl) - entsteht durch die Oxidation von LDL (vermutlich katalysiert von Lipoxygenasen), - aktiviert den Transkriptionsfaktor NF-κ B Adhäsionsproteine und pro-inflammatorische Zytokine 32

33 Marker der Nukleinsäureoxidation 8-Hydroxy-2-Desoxyguanosin (OHDG) entsteht durch die Oxidation von Desoxyguanosin in der DNS des Zellkerns und insbesondere der Mitochondrien (in den Mitochondrien kein Schutz durch Histone) zunehmend Defekte bei der Synthese von Enzymen der Atmungskette mitochondriale Atmung ROS-Bildung oxidativer Stress Arteriosklerose 33

34 Marker des nitrosativen Stresses - 3-Nitrotyrosin - Arginin - Citrullin/g Kreatinin 34

35 3-Nitrotyrosin entsteht durch die Nitrierung von Tyrosin durch NO bzw. durch ONOO - Arginin + O 2 NO-Synthase NO + Citrullin Wenn Arginin bzw. Citrullin/g Kreatinin dann nitrosativer Stress 35

36 Marker der antioxidativen Kapazität Totale Antioxidative Kapazität (AOC) Glutathion Glutathion-Peroxidase (GPX) Ubichinon (Coenzym Q 10) Superoxid-Dismutase (SOD) Vitamin C und Vitamin E Kofaktoren (Redoxfaktoren) Kupfer, Zink, Mangan und Selen LABORZENTRUM ETTLINGEN - KARLSRUHE 36

37 Totale antioxidative Kapazität (AOC) Globaltest, mit dem das gesamte Reduktionsvermögen zur Entgiftung von ROS gemessen wird. Methode: Ein chromogenes Radikal wird mit Patientenserum versetzt. Die dann folgende Abnahme der Farbreaktion entspricht der antioxidativen Kapazität. Je größer der oxidative Stress, desto geringer die antioxidative Kapazität. LABORZENTRUM ETTLINGEN - KARLSRUHE 37

38 Glutathion ist das wichtigste Antioxidans. Reduziert Lipidhydroperoxide mit Hilfe der Glutathionperoxidase (GPX). Kofaktor der GPX ist Selen. Selen ist für die Redox-Reaktionen das Elektronen- Reservoir. Ubichinon (Coenzym Q 10) ist einer der Elektronenüberträger innerhalb der mitochondrialen Atmungskette (zwischen Komplex I und Komplex III). Antioxidans und Radikalfänger wie Glutathion. LABORZENTRUM ETTLINGEN - KARLSRUHE 38

39 Superoxid-Dismutase (SOD) entgiftet das Superoxid-Anion (O 2- ) O 2 + O 2 + 2H + SOD H 2 O 2 + O 2 Es gibt 3 Isoenzyme der SOD: SOD1: Vorkommen im Zytosol, enthält als Kofaktoren Kupfer und Zink SOD2: Vorkommen in den Mitochondrien, enthält als Kofaktor Mangan SOD3: Vorkommen auf extrazellulären Oberflächen Kupfer und Zink bzw. Mangan dienen als Elektronenreservoir für die Redoxreaktionen. LABORZENTRUM ETTLINGEN - KARLSRUHE 39

40 Vitamin E (Tocopherol) ist ein Antioxidans, das insbesondere ungesättigte Fettsäurereste in Zellmembranen vor der Lipidperoxidation schützt (Vermeidung von Lipidhydroperoxiden). Das so oxidierte Vitamin E wird durch Vitamin C (Ascorbinsäure) regeneriert = reduziert. Das so oxidierte Vitamin C wird durch Glutathion regeneriert = reduziert. Vitamin E, Vitamin C und Glutathion wirken also synergistisch. LABORZENTRUM ETTLINGEN - KARLSRUHE 40

41 Rationale Stufendiagnostik Hierfür gelten folgende Grundsätze: 1) Je größer der oxidative Stress, desto geringer die antioxidative Kapazität. 2) Endprodukte des oxidativen Stresses, wie Malondialdehyd (MDA), oxidiertes LDL (oxldl) oder 8-Hydroxy-2-Desoxyguanosin (OHDG) sind generell aussagekräftiger als Enzyme, da sie kaum Schwankungen unterliegen. 3) Ist die Aktivität eines Enzyms zu niedrig, sollten seine Kofaktoren (Spurenelemente) kontrolliert werden. Darüber hinaus sind Substrate der Redox- Reaktionen, z. B. die beiden Vitamine C und E zu bestimmen. 41

42 1. Stufe Untersuchung Totale Antioxidative Kapazität (AOC) Totale Antioxidative Kapazität (AOC) oxidiertes LDL (oxldl) 8-Hydroxy-2-Desoxyguanosin (OHDG) Totale Antioxidative Kapazität (AOC) 8-Hydroxy-2-Desoxyguanosin (OHDG) Malondialdehyd (MDA) 2. Stufe Superoxid-Dismutase (SOD) Glutathion-Peroxidase (GPX) Glutathion Glutathion-Reduktase 3. Stufe Kofaktoren Kupfer, Zink und Mangan bei erniedrigter SOD Kofaktor Selen bei erniedrigter GPX ggf. Vitamine C und E ggf. Ubichinon (Coenzym Q10) Material Serum Serum Serum Urin (gefroren) Serum Urin (gefroren) Heparinplasma, gefroren oder Serum, gefroren EDTA-Blut EDTA-Blut EDTA-Blut, gefroren EDTA-Blut Kupfer im Serum, Zink im Heparinblut, Mangan im EDTA-Blut EDTA-Blut Serum Serum 42

43 Oxidativer- / Nitrosativer-Stress Entstehung und Auswirkungen Wir danken für Ihre Aufmerksamkeit Dr. med. univ. Kurt Kraus Otto-Hahn-Straße Ettlingen 43