RIDASCREEN Listeria. Enzymimmunoassay für den Nachweis von Listeria spp. Enzyme immunoassay for the detection of Listeria spp. Art. No.

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1 RIDASCREEN Listeria Enzymimmunoassay für den Nachweis von Listeria spp. Enzyme immunoassay for the detection of Listeria spp. Art. No.: R4202 In vitro Test Lagerung bei 2-8 C Storage at 2-8 C R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany Tel.: +49 (0) / Telefax: +49 (0)

2 Anschrift: R-Biopharm AG An der neuen Bergstraße 17 D Darmstadt Für weitere Fragen stehen Ihnen gerne zur Verfügung: Telefon: Zentrale / Auftragsannahme ( ) Telefax / Auftragsannahme ( ) orders@r-biopharm.de Marketing ( ) info@r-biopharm.de RIDA und RIDASCREEN sind eingetragene Warenzeichen der R-Biopharm AG Hersteller: R-Biopharm AG, Darmstadt, Deutschland R-Biopharm AG ist ISO 9001 zertifiziert. RIDA and RIDASCREEN are registered trademarks of R-Biopharm AG Manufacturer: R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany R-Biopharm AG is ISO 9001 certified. 2 RIDASCREEN Listeria

3 Kurzinformation RIDASCREEN Listeria (Art. Nr.: R4202) ist ein Enzymimmunoassay zum Nachweis von Listeria spp. in Lebensmitteln und Abstrichproben aus dem Produktionsumfeld. Alle Reagenzien für die Durchführung des Enzymimmunoassays sind im Testkit enthalten. Ein Testkit ist ausreichend für 96 Bestimmungen (einschließlich Positiv- und Negativkontrolle). Zur Auswertung benötigt man ein Mikrotiterplatten-Photometer. Probenvorbereitung: Zeitbedarf: Nachweisgrenze: homogenisieren und anreichern Probenanreicherung ± 2 h Testdurchführung (ELISA)... 1 h 30 min Testdurchführung gesamt... ca. 49,5 ± 2 h (inklusive Voranreicherung) 1 KBE Listeria aus 25 g Probe, entsprechend mindestens 10 5 Listerienzellen/ml nach Voranreicherung. RIDASCREEN Listeria

4 1. Verwendungszweck Der RIDASCREEN Listeria (Art. Nr.: R4202) ist ein Sandwich-Enzymimmunoassay zum qualitativen Nachweis von Listeria spp. aus Voranreicherungskulturen von Lebensmitteln und Abstrichproben aus dem Produktionsumfeld. Die Voranreicherung muss mit geeigneten Selektivmethoden für Listeria spp. (z. B.: selektive Primäranreicherung in ½ Fraser-Bouillon, selektive Sekundäranreicherung in Fraser-Bouillon) durchgeführt werden. 2. Allgemeines Die Gattung Listeria umfasst insgesamt 6 Spezies: L. monocytogenes, L. ivanovii, L. seeligeri, L. welshimeri, L. innocua und L. grayi. Listerien sind in der Natur ubiquitär vorhanden. Sie gelten als Schmutzkeime und sind besonders in Abwässern, Böden sowie verunreinigtem Wasser, Lebens- und Futtermitteln verbreitet. Da sich auf Pflanzen, die mit Erde oder Staub kontaminiert sind, eigentlich immer Listerien nachweisen lassen, können auch Obst, Gemüse und pflanzliche Futtermittel kontaminiert sein. Lebensmittel tierischer Herkunft sind zumeist sekundär kontaminiert, kommen also erst bei der Verarbeitung mit Listerien in Kontakt. Besonders gefährdet sind Rohmilch und Rohmilchprodukte, Käse, Mayonnaise, Rohwürste, rohes Hackfleisch, Geflügelfleisch, Aufschnittwurst und Räucherfisch. Bei der Herstellung und Verarbeitung der genannten Lebensmittel ist die strenge Einhaltung der allgemeinen Betriebshygiene besonders wichtig. Von allen oben genannten Listerien-Species ist zumindest L. monocytogenes als Erreger der meldepflichtigen Infektionskrankheit Listeriose bei Menschen und Tieren bekannt. In einigen wenigen Fällen wurde von humanen Erkrankungsfällen berichtet, die durch L. ivanovii und L. seeligeri ausgelöst worden waren. Bei Tieren, insbesondere bei kleinen Wiederkäuern (Schafe oder Ziegen), wird in Erkrankungsfällen relativ oft L. ivanovii als Erreger festgestellt. Listeriosen sind gegenüber anderen Lebensmittelinfektionen (z.b. Campylobacteriosen, Salmonellosen) relativ selten, können aber vergleichsweise erheblichen gesundheitlichen Schaden anrichten und auch zum Tod führen. Besonders gefährdet sind abwehrgeschwächte Personen. Die Symptome reichen von leichten grippeähnlichen Symptomen und Durchfall bis hin zu Sepsis, Enzephalitis und Meningitis. Infektionen bei Schwangeren können Fehl- oder Frühgeburten zur Folge haben, wobei die Neugeborenen mit schweren Schäden zur Welt kommen. 4 RIDASCREEN Listeria

5 3. Testprinzip Grundlage ist die Antigen-Antikörper-Reaktion. Die Vertiefungen der Mikrotiterstreifen sind mit spezifischen Antikörpern gegen Oberflächenantigene von Listerien beschichtet. Bei Zugabe von Positivkontrolle oder Probe binden vorhandene Listerienantigene an die spezifischen Antikörper. Das Resultat ist ein Antikörper-Antigen-Komplex. Die nicht gebundenen Anteile werden in einem Waschschritt entfernt. Danach erfolgt die Zugabe eines Peroxidase-gekoppelten Antikörpers (Enzymkonjugat). Dieses Konjugat bindet an den Ak-Ag-Komplex. Es entsteht ein Antikörper- Antigen-Antikörper-Komplex (Sandwich). Nach anschließender Auswaschung überschüssiger Reagenzien erfolgt der Nachweis durch Zugabe von Substrat/Chromogen. Das an den Antikörper gebundene Enzym wandelt das Chromogen in ein blaues Endprodukt um. Die Zugabe des Stopp-Reagenzes führt zu einem Farbumschlag von blau nach gelb. Die Messung erfolgt photometrisch bei 450 nm/620 nm (Referenzwellenlänge). Die Probe ist als positiv zu bewerten, wenn der gemessene Extinktionswert größer ist als der für positive Proben berechnete Grenzwert. 4. Packungsinhalt Jeder Testkit enthält alle Reagenzien für 96 Tests: 1 x Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten (12 Streifen à 8 Einzelkavitäten) beschichtet mit Antikörpern gegen Antigene von Listeria spp. 1 x Positivkontrolle (2 ml)... roter Verschluss enthält inaktivierte Listeria monocytogenes-zellen rötlich gefärbt gebrauchsfertig 1 x Negativkontrolle (2 ml)... weißer Verschluss enthält inaktivierte Streptococcus faecalis-zellen farblos gebrauchsfertig 1 x Konjugat (10 ml)... roter Verschluss Peroxidase-konjugierte Antikörper gegen Listeria spp. grün gefärbt gebrauchsfertig RIDASCREEN Listeria

6 1 x Substrat-/Chromogenlösung (13 ml)... brauner Verschluss rötlich gefärbt gebrauchsfertig 1 x Stopp-Reagenz (13 ml)... gelber Verschluss enthält 1 N Schwefelsäure gebrauchsfertig 2 x Puffersalz (Waschpuffer) zur Herstellung eines 10 mm Phosphatpuffers (ph 7,4) enthält 0,05 % Tween Zusätzlich benötigte Reagenzien - erforderliches Zubehör 5.1. Geräte: Laborwaage Stomacher oder Äquivalent (zum Homogenisieren der Probe) Stomacher-Beutel oder Äquivalent (optional mit Filtereinsatz) Mikropipette für 100 µl und 1 ml saubere Einmal-Pipettenspitzen sterile Einmal-Pipettenspitzen (zum Überimpfen des Kulturmediums) 10 ml Pipetten (steril) 15 ml Falconröhrchen (steril) Inkubator, einstellbar auf 30 ± 1 C Multikanalpipette (250 µl) oder Mikrotiterplatten-Washer (optional) Messzylinder (1000 ml) Stoppuhr Filterpapier (Labortücher) Wasserbad (80 C) oder Vergleichbares zur Erhitzung der Probenvoranreicherung Mikrotiterplatten-Photometer mit 450 ± 10 nm/620 ± 10 nm Filtern 5.2. Reagenzien: destilliertes Wasser Fraser-Anreicherungsbouillon-Basis (empfohlen: LabM, LAB164), Fraser- Selektiv-Supplement, halbkonzentriert; Fraser-Selektiv-Supplement (jeweils nach Angabe des Herstellers der Fraser-Basis) Je nach Verfügbarkeit können auch fertig gemischte, trockene Kulturmedien, in denen die Supplemente bereits vorhanden sind, verwendet werden. 6 RIDASCREEN Listeria

7 6. Vorsichtsmaßnahmen Der RIDASCREEN Listeria Test ist nur von geschultem Laborpersonal durchzuführen. Die Gebrauchsanweisung zur Durchführung des Tests ist strikt einzuhalten. Generell empfehlen wir für Probenvorbereitung, Testdurchführung und Entsorgung die Einhaltung der allgemeingültigen GLP-Richtlinien (gute Laborpraxis). Alle Proben müssen als potentiell infektiös behandelt werden. Alle verwendeten Reagenzien, Waschlösungen und Materialien, die mit potentiell infektiösen Proben in Berührung kommen, müssen mit geeigneten Desinfektionsmitteln behandelt oder mindestens 15 min bei 121 C autoklaviert werden. Positiv- und Negativkontrolle enthalten inaktivierte bakterielle Zellen. Dennoch sollten sie als potentiell infektiös behandelt werden. Das Stopp-Reagenz enthält 1 N Schwefelsäure (R36/38, S2-26). Hautkontakt vermeiden. Positiv- und Negativkontrolle 0,1 % Kathon. Kontakt mit Haut oder Schleimhaut ist zu vermeiden. 7. Reagenzien und ihre Lagerung Die Reagenzien bei 2-8 C lagern. Komponenten des Testkits auf keinen Fall einfrieren! Nicht benötigte Mikrotiterstreifen zusammen mit dem Trockenmittel im Folienbeutel gut verschlossen aufbewahren und weiterhin bei 2-8 C lagern. Die Substratlösung ist lichtempfindlich, deshalb direkte Lichteinwirkung vermeiden. Nach Ablauf des Verfalldatums (siehe Außenetikett unter Expiry) kann keine Qualitätsgarantie mehr übernommen werden. Ein Austausch von Einzelreagenzien zwischen Kits verschiedener Chargennummern ist nicht zulässig. RIDASCREEN Listeria

8 8. Anzeichen für Reagenzienverfall bläuliche Färbung der Substrat-/Chromogenlösung vor Zugabe in die Kavitäten Extinktion der Positiv-Kontrolle kleiner 0,8 (E 450/620 nm < 0,8) 9. Probenvorbereitung Bakterien der Gattung Listeria sind unter Umständen sehr empfindlich gegenüber schnellen Änderungen der Umweltbedingungen (Temperatur, ph, etc.). Die in einem Lebensmittel als Kontaminanten vorhandenen Listerien können beispielsweise durch Konservierungsmittel subletal geschädigt sein und müssen daher vor Durchführung eines Nachweistests wie dem RIDASCREEN Listeria auf eine nachweisbare Zellzahl vorangereichert werden. Für die Voranreicherung von Listeria spp. wird die zweistufige Selektivanreicherung nach Fraser (Fraser J. A. und Sperber, W. H. 1988) empfohlen. Alternativ kann eine vergleichbare, geeignete Methode (nach USDA, BAM, ISO, etc.) zur Voranreicherung verwendet werden Voranreicherung nach Fraser Fraser-Anreicherungsbouillonbasis in ausreichender Menge für ½ Fraser-Bouillon (HFB) und Fraser-Bouillon (FB) nach Herstellerangabe zubereiten (Mengenverhältnis 22,5:1) und autoklavieren. Auf 50 C abkühlen lassen. Halbkonzentriertes Selektiv-Supplement nach Herstellerangabe zu der als HFB vorgesehenen Basisbouillon geben und mischen. Fraser-Selektiv-Supplement zu der als FB vorgesehenen Basisbouillon geben und mischen. Die FB zu jeweils 10 ml in Falconröhrchen aliquotieren. 25 g Probe in einen Stomacherbeutel einwiegen, 225 ml HFB zugeben und homogenisieren Oberseite des Stomacherbeutels umfalten und mit Klebeband oder Beutelverschluss verschließen Beutel für 24 ± 2 h bei 30 ± 1 C inkubieren nach Ende der Inkubationszeit 0,1 ml der Kultur in ein Falconröhrchen mit 10 ml FB überführen Röhrchen für 24 h bei 30 ± 1 C inkubieren 8 RIDASCREEN Listeria

9 10. Testdurchführung Testvorbereitung Ein geeignetes Aliquot der Probenvoranreicherung entnehmen und für eventuell nötige weitere Untersuchungen (z.b. Test auf L. monocytogenes) aufbewahren. Die restliche Voranreicherung vor Einsatz in den Test für 20 min im Wasserbad auf 80 C erhitzen. Alle Reagenzien und Probenvoranreicherungen vor Gebrauch auf Raumtemperatur (20-25 C) bringen. Als Waschpuffer wird ein PBS-Tween-Puffer benötigt, benutzen Sie dazu bitte das beiliegende Puffersalz (siehe 4.). Zur Herstellung des Puffers den gesamten Inhalt eines Beutels in 1 Liter destilliertem Wasser lösen. Der gelöste Waschpuffer ist ca. 4-6 Wochen bei 2-8 C haltbar. Alternativ: Inhalt eines Beutels in 100 ml dest. Wasser lösen (10fach Konzentrat). Um die gebrauchsfertige Lösung herzustellen, 1 Teil des 10fach Konzentrats mit 9 Teilen dest. Wasser mischen. Die Lösung (10fach Konzentrat) ist ca Wochen bei Raumtemperatur (20 25 C) haltbar Testdurchführung Sorgfältiges Waschen ist sehr wichtig. Ein Eintrocknen der Kavitäten zwischen den Arbeitsschritten vermeiden. 1. Plattenvorbereitung: so viele Kavitäten in den Halterahmen einsetzen, wie für die Kontrollen und alle Proben benötigt werden. Nicht benötigte Mikrotiterstreifen zurück in den Folienbeutel geben und gut verschließen. 2. Probenzugabe: jeweils 100 µl der vorangereicherten Probe, der Negativkontrolle und der Positivkontrolle in die entsprechenden Kavitäten pipettieren. Dabei jeweils eine neue Pipettenspitze verwenden. Die Positionen der Kontrollen und Proben protokollieren. Die Platte abdecken und für 30 min bei 37 C inkubieren. 3. Erster Waschschritt: die Kavitäten durch Ausschlagen der Flüssigkeit leeren und die Restflüssigkeit durch kräftiges Ausklopfen (dreimal hintereinander) auf saugfähigen Labortüchern entfernen. Die Kavitäten mit jeweils 250 µl Waschpuffer (siehe 10.1.) waschen. Diesen Vorgang fünfmal wiederholen. RIDASCREEN Listeria

10 Der Vorgang kann manuell unter Verwendung einer Multikanalpipette durchgeführt werden. Gründliches Waschen der Kavitäten ist wichtig und notwendig für eindeutige Resultate. 4. Konjugatzugabe: je 100 µl Konjugat in die vollständig entleerten Kavitäten pipettieren. Die Platte abdecken und für 30 min bei 37 C inkubieren. 5. Zweiter Waschschritt: die Kavitäten entleeren und sechsmal mit jeweils 250 µl Waschpuffer waschen (gleiche Vorgehensweise wie bei Punkt 3.). 6. Substratzugabe: je 100 µl Substrat-/Chromogenlösung in die vollständig entleerten Kavitäten pipettieren. Die Platte abdecken und 30 min bei Raumtemperatur (20-25 C) im Dunkeln inkubieren. 7. Stoppen der Reaktion: jeweils 100 µl Stopp-Reagenz in die Kavitäten pipettieren und vorsichtig manuell mischen. 8. Messung: die Extinktion bei 450 ± 10 nm / 620 ± 10 nm (Referenzwellenlänge) innerhalb von 30 min nach Zugabe des Stopp-Reagenzes messen. 11. Auswertung Für die Auswertung ist bei R-Biopharm die speziell für die RIDASCREEN Enzymimmunoassays entwickelte Software RIDA SOFT Win (Art. Nr. Z9999), erhältlich Qualitätskontrolle des Tests Der Extinktionswert der Positivkontrolle sollte größer oder gleich 0,8 sein. Der Extinktionswert der Negativkontrolle sollte kleiner 0,2 sein. Falls diese Kriterien nicht erfüllt werden, sollten die folgenden Arbeitsschritte überprüft und evtl. korrigiert werden. Anschließend den Test wiederholen. Überprüfen des Haltbarkeitsdatums des Testkits Sicherstellen, dass alle Reagenzien des Testkits vor Gebrauch auf Raumtemperatur gebracht wurden Verwendung von neuen Pipettenspitzen beim Pipettieren der Proben und Kontrollen (Vermeidung von Kreuzkontamination) Überprüfen der Sterilität des Wassers für das Ansetzen des Waschpuffers Sicherstellen, dass die Waschsequenzen korrekt durchgeführt wurden (s ) Überprüfen der Pipetten auf mögliche Kontaminationen (Pipetten regelmäßig reinigen/einmalpipetten verwenden) 10 RIDASCREEN Listeria

11 11.2. Grenzwertberechnung Zur Festlegung des Grenzwertes werden zum gemessenen Extinktionswert der Negativkontrolle 0,15 Extinktionseinheiten hinzu addiert. Beispiel: Negativkontrolle = 0,042 Grenzwert = 0, ,15 = 0, Interpretation der Ergebnisse Als positiv werden solche Proben beurteilt, deren Extinktionswert mehr als 10 % über dem errechneten Grenzwert liegt. Als grenzwertig werden solche Proben bezeichnet, deren Extinktionswert im Bereich von 10 % ober- oder unterhalb des Grenzwertes liegt. In diesem Fall ist die Untersuchung mit frischer Voranreicherung zu wiederholen. Fällt eine Wiederholungsuntersuchung wieder in den Grenzbereich, so ist die Probe als negativ zu beurteilen. Proben, deren Extinktionswert mehr als 10 % unter dem errechneten Grenzwert liegt, sind als negativ zu bewerten. Diese Angaben entsprechen dem heutigen Stand unserer Kenntnisse und sollen über unsere Produkte und deren Anwendungsmöglichkeiten informieren. Sie haben somit nicht die Bedeutung, bestimmte Eigenschaften der Produkte oder deren Eignung für einen konkreten Einsatzzweck zuzusichern. R-Biopharm übernimmt keine Gewährleistung, außer für die standardisierte Qualität der Reagenzien. Defekte Produkte werden ersetzt. Darüber hinaus gehende Ansprüche für direkte oder indirekte Schäden oder Kosten aus der Nutzung der Produkte entstehen nicht. RIDASCREEN Listeria

12 RIDASCREEN Listeria Brief information RIDASCREEN Listeria (Art. No.: R4202) is an enzyme immunoassay for the detection of Listeria spp. in food and swab samples from the production environment. All reagents required for the enzyme immunoassay are contained in the test kit. The test kit is sufficient for 96 determinations (including positive and negative control). A microplate photometer is necessary for evaluation. Sample preparation: Time requirement: Detection limit: homogenization and enrichment sample enrichment ± 2 h test implementation (ELISA)... 1 h 30 min test implementation, total... approx ± 2 h (including pre-enrichment) 1 cfu Listeria in 25 g of sample equivalent to 10 5 Listeria cells/ml at least after pre-enrichment. 12 RIDASCREEN Listeria

13 1. Intended use The RIDASCREEN Listeria (Art. No.: R4202) is a sandwich enzyme immunoassay for the qualitative detection of Listeria spp. from pre-enrichment cultures of food samples and swab samples from the production environment. The preenrichment has to be performed using appropriate selective methods for Listeria spp. (e.g. selective primary enrichment in ½ Fraser broth followed by a selective secondary enrichment in Fraser broth). 2. General The Genus Listeria includes 6 species: L. monocytogenes, L. ivanovii, L. seeligeri, L. welshimeri, L. innocua und L. grayi. Listeria are organisms which occur ubiquitous in the environment. They are considered as so called dirt germs and mostly common in wastewater, soils, contaminated water as well as food and feed. Listeria can be detected almost always on plants which are contaminated with soil or dust. Therefore also fruits, vegetables as well as herbal animal feed could be infectious. Foodstuffs from animal origin are mostly secondary contaminated. They get into contact with Listeria during the production process. Especially raw milk and raw milk products, cheese, mayonnaise, raw sausages, raw ground meat, poultry meat, cold cuts and smoked fish are affected. The strict obedience of common standards in industrial sanitation is needed during production or processing of these kinds of foods. From all Listeria species named above L. monocytogenes at least is known as cause of the so called Listeriosis which is a notifiable disease in humans and animals. In few instances L. ivanovii und L. seeligeri have been reported as responsible for human infections. In animals L. ivanovii is deteted very often as cause of the diseases, particularly in small ruminants as sheep or goats. Listeriosis is relatively seldom found compared to other foodborne infections (e.g. Campylobactriosis, Salmonellosis), but very harmful to human health and very often leads to death of infected persons. Especially endangered are immunodeficient persons. Symptoms of the disease may be comparable to a mild influenza and diarrhea but can also be sepsis, encephalitis and meningitis. Infections of pregnant women may lead to abortive or premature births where as the babies will be born with heavy damages. RIDASCREEN Listeria

14 3. Test principle The basis of the test is the antigen-antibody reaction. The wells of the microtiter strips are coated with specific antibodies against surface antigens of Listeria. By adding the positive control or sample solution to the wells, present Listeria antigens will bind to the specific capture antibodies and an antibody-antigencomplex is formed. In a washing step components not bound are removed. Then antibody conjugated to peroxidase (enzyme conjugate) is added. This antibody conjugate is bound to the antibody-antigen-complex. An antibody-antigen-antibody-complex (sandwich) is formed. Any unbound conjugate is then removed in a washing step. The detection of Listeria antigens takes place by adding substrate/chromogen solution. The enzyme conjugate converts the chromogen into a blue product. The addition of the stop solution leads to a color change from blue to yellow. The measurement is made photometrically at 450 nm/620 nm (reference wave length). The sample has to be considered positive if the absorbance value is greater than the threshold value calculated for positive samples. 4. Reagents provided Each kit contains sufficient reagents for 96 tests: 1 x Microplate with 96 wells (12 strips with 8 wells each) coated with antibodies against antigens of Listeria spp. 1 x Positive control (2 ml)... red cap contains inactivated Listeria monocytogenes cells stained red ready-to-use 1 x Negative control (2 ml)... white cap contains inactivated Streptococcus faecalis cells colorless ready-to-use 1 x Conjugate (10 ml)... red cap peroxidase conjugated antibodies against Listeria spp. stained green ready-to-use 1 x Substrate/chromogen solution (13 ml)... brown cap stained red ready-to-use 14 RIDASCREEN Listeria

15 1 x Stop solution (13 ml)... yellow cap contains 1 N sulfuric acid ready-to-use 2 x Buffer salt (washing buffer) for preparation of 10 mm Phosphate Buffer (ph 7.4) contains 0.05 % Tween Materials required but not provided 5.1. Equipment: laboratory scale blender or equivalent (for sample homogenization) blender bags or equivalent (optional with filter insert) micro pipettes for 100 µl and 1 ml clean, disposable pipette tips sterile, disposable pipette tips (for transfer of culture media) 10 ml pipettes (sterile) 15 ml falcon tubes (sterile) incubator adjustable to 30 ± 1 C (86 F) multi channel pipette (250 µl) or microplate washer (optional) measuring cylinder (1000 ml) timer filter paper (laboratory tissues) water bath (80 C/176 F) or equivalent for heat treatment of sample pre-enrichment microplate reader with 450 ± 10 nm/620 ± 10 nm filters 5.2. Reagents: distilled water Fraser broth base (recommended: LabM, LAB164), ½ Fraser selective supplement; Fraser selective supplement (according to advise of broth base manufacturer) According to their availability it may be also possible to use ready mixed dry culture media which already contain the supplements required. RIDASCREEN Listeria

16 6. Warnings and precautions The RIDASCREEN Listeria test should only be carried out by trained laboratory employees. The instruction for use must be strictly followed. For sample preparation, test performance and waste disposal the compliance of GLP guidelines is recommended. All samples have to be treated as they could be potentially infectious. All materials as reagents, washing solutions or lab ware coming into contact with potentially infectious samples have to be treated with suitable decontaminating agents or have to be autoclaved for 15 min at 121 C (249.8 F) at least. Positive as well as negative controls contain inactivated bacterial cells. However they should be treated as they could be potentially infectious. The stop solution contains 1 N Sulphuric Acid (R36/38, S2-26). Avoid contact to skin. Positive and negative control contain 0.1 % Kathon. Avoid contact to skin and mucosa. 7. Storage instructions Store the kit at 2-8 C. Do not freeze any test kit components! Return any unused micro wells to their original foil bag reseal them together with the desiccant provided and further store at 2-8 C. The substrate solution is light sensitive, therefore, avoid exposure to direct light. No quality guarantee is accepted after expiry of the kit (see kit label). Do not interchange individual reagents between kits of different lot numbers. 8. Indication of instability and deterioration of reagents any bluish coloration of the substrate/chromogen solution prior to test implementation a value of less than 0.8 absorbance units (A 450/620 nm < 0.8) for the positive control 16 RIDASCREEN Listeria

17 9. Preparation of samples Bacteria from the genus Listeria in some cases may be sensitive to rapid changes in environmental conditions (temperature, ph, etc.). Listeria which occur as contaminants in food may be sub-lethally damaged by preservatives or other agents and food treatments. Therefore the samples have to be pre-enriched before they can be implemented into a detection assay as RIDASCREEN Listeria. As suitable pre-enrichment procedure for Listeria spp. the two-step selective enrichment method according to Fraser (Fraser J. A. and Sperber, W. H. 1988) is recommended. Alternatively any comparable suitable method (e.g. according to USDA, BAM, ISO, etc.) for pre-enrichment of Listeria in food may be used for sample preparation Pre-enrichment according to Fraser Prepare and autoclave Fraser base broth in adequate volumes for preparation of ½ Fraser broth (HFB) as well as Fraser broth (FB) according to manufacturer s instructions (proportion equals to 22.5:1). Let the broth cool down to 50 C (122 F). Add half concentrated selective supplement for preparation of HFB to the designated base broth and mix. Add selective supplement to the as FB designated base broth and mix as well. Aliquot FB to 10 ml each into falcon tubes. weigh 25 g of sample into a blender bag, add 225 ml HFB and homogenize fold over the top of the blender bag and seal the bag using a tape or bag closure incubate bag 24 ± 2 h at 30 ± 1 C (86 F) after end of incubation time transfer 0.1 ml of the culture to a falcon tube containing 10 ml of FB incubate tube for 24 h at 30 ± 1 C (86 F) RIDASCREEN Listeria

18 10. Test implementation Test preparation Take an appropriate aliquot of sample pre-enrichment and store it for possible further analysis (e.g. test on presence of L. monocytogenes). Heat the remaining sample pre-enrichment for 20 min at 80 C (176 F) in a water bath prior to test implementation. Bring all reagents and sample pre-enrichments to room temperature (20-25 C / F) before use. As washing buffer a PBS tween buffer is needed. Please use the buffer salt contained in the kit (see 4.). Dissolve the complete content of one envelope in one liter of distilled water. The ready to use washing buffer expires after approx. 4-6 weeks at 2-8 C (36-46 F). Alternative: Dissolve the content of one envelope in 100 ml of distilled water to obtain a 10fold concentrated washing buffer. Use 1 part of this concentrate and dissolve with 9 parts of distilled water to obtain the ready to use washing buffer. The 10fold concentrate expires after approx weeks, store at room temperature (20-25 C / F) Test procedure Carefully follow the recommended washing procedure. Do not allow microwells to dry between working steps. 1. Plate preparation: insert as many micro wells into the micro well holder as needed for all samples and controls. Return any unused micro wells to their original foil bag and reseal. 2. Adding Sample: using a new pipette tip for each sample, transfer 100 µl aliquots of pre-enriched sample, negative control and positive control into individual wells, recording the position of each sample. Cover the wells and incubate for 30 min at 37 C (98.6 F). 3. First washing: pour the liquid out of the wells and tap the microwell holder upside down vigorously (three times in a row) against absorbent paper to ensure complete removal of liquid from the wells. Fill all the wells with 250 µl washing buffer (see 10.1.) and pour out the liquid again. Repeat five more times. 18 RIDASCREEN Listeria

19 The procedure can be performed manually using a multi channel pipette. Thorough washing of the wells is a critical step and is essential for a clear interpretation of results. 4. Adding conjugate: pipette 100 µl of conjugate into the completely emptied wells. Cover the wells and incubate for 30 min at 37 C (98.6 F). 5. Second washing: empty the wells and wash six times with 250 µl of wash buffer (same procedure as point 3.). 6. Adding substrate: pipette 100 µl of substrate/chromogen into the completely emptied wells. Cover the wells and incubate for 30 min at room temperature (20-25 C / F) in the dark. 7. Stopping of reaction: pipette 100 µl stop solution to each well and mix gently by shaking the plate manually. 8. Measurement: measure the absorbance at 450 ±10 nm / 620 ±10 nm (reference wave length). Read within 30 min after addition of stop solution. 11. Results A special software, the RIDA SOFT Win (Art. No. Z9999), is available to evaluate the RIDASCREEN enzyme immunoassays Quality control for the test to be valid Positive control must have reached an absorbance of 0.8 or higher. Negative control must have an absorbance of less than 0.2. If these criteria have not been met, the following steps should be checked and corrected before repeating the test: check kit expiry date ensure that kit components have reached room temperature prior to use avoid cross contaminations by using a new pipette tip for each sample or control check sterility of water used for preparation of washing buffer ensure that washing sequences have been performed correctly (s ) check pipettes for contaminations (clean pipettes regularly/use disposable pipettes) RIDASCREEN Listeria

20 11.2. Determination of threshold values For the determination of the threshold value 0.15 absorbance units have to be added to the absorbance value of the negative control. Example: Negative control = Interpretation of results Threshold value = = Samples which lead to an absorbance value of more than 10 % over the threshold value are considered as positive. Samples with an absorbance value in the range of 10 % higher or lower as the threshold value are considered as borderline. In this case the analysis has to be repeated using fresh pre-enrichment. If the repeated analysis leads to a borderline result again the sample is considered as negative. If the absorbance value of a sample is more than 10 % below the threshold value the sample has to be considered as negative. R-Biopharm makes no warranty of any kind, either expressed or implied, except that the materials from which its products are made are of standard quality. If any materials are defective, R-Biopharm will provide a replacement product. There is no warranty of merchantability of this product, or of the fitness of the product for any purpose. R-Biopharm shall not be liable for any damages, including special or consequential damage, or expense arising directly or indirectly from the use of this product. 20 RIDASCREEN Listeria