BlueBlot Wet 100 BlueBlot Wet 200 Tankblot-Gerät

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1 BlueLine Instruments for Electrophoresis GEBRAUCHSANLEITUNG BlueBlot Wet 100 BlueBlot Wet 200 Tankblot-Gerät SERVA Electrophoresis GmbH Carl-Benz-Str. 7 D Heidelberg Phone , Fax info@serva.de

2 Inhaltsverzeichnis 1. Packliste 3 2. Spezifikationen 3 3. Betriebsbedingungen 4 4. Bedienung des Gerätes Sicherheitsvorkehrungen Pflege und Wartung der Transferkammer Durchführung eines Transfers 5 5. Literatur 9 6. Empfohlene Produkte für den Proteintransfer 10 Ver. 03/2007 1

3 Achtung Dieses Gerät darf nur von geschultem Personal betrieben werden. Wenn es an eine Stromversorgungsquelle angeschlossen wird, steht es potentiell unter elektrischer (Hoch-) Spannung, die bei falscher Handhabung gesundheits-gefährdend ist. Die BlueBlot Blotting-Systeme sind gemäß den gültigen Sicherheitsrichtlinien hergestellt. Sie sind für die Erreichung bester Ergebnisse im Einklang mit langer Lebensdauer ausgelegt. Um dies zu gewährleisten, lesen Sie bitte vor Inbetrieb-nahme die Bedienungsanleitung sorgfältig durch. Bitte überprüfen Sie nach dem Auspacken an Hand der Packliste, ob die Bestandteile des Gerätes vollständig sind, und ob das Gerät unbeschädigt ist. Sollte dies nicht der Fall sein, benachrichtigen Sie bitte sofort SERVA Electrophoresis GmbH in Heidelberg bzw. den zuständigen Distributionspartner, um eine reibungslose Berichtigung zu gewähren. Die Garantiezeit beträgt 12 Monate und beginnt mit der Auslieferung. Wir bitten Sie, die Verpackungsmaterialien bis zu dem Ablauf der Garantiezeit aufzubewahren. 2

4 1. Packliste BlueBlot Wet 100 Kat.-Nr.: BB100 Anzahl Beschreibung Kat.-Nr. 1 Haupteinheit 4 Gelkassetten BB Schwammeinlagen (2) BB Bedienungsanleitung BlueBlot Wet 200 Kat.-Nr.: BB200 Anzahl Beschreibung Kat.-Nr. 1 Haupteinheit 4 Gelkassetten BB Schwammeinlagen (2) BB Bedienungsanleitung 2. Spezifikationen Stabile Acrylglas-Konstruktion. Alle Acrylglas-Nahtstellen sind mit einem Spezialkleber verbunden. Doppelt isolierte Stromkabel, bemessen für bis zu 3000 Volt. Vergoldete Steckanschlüsse, korrosionsfrei, Sicherheitsbemessung für bis zu 1000 Volt. In dem Deckel integrierte, zurückversetzte Anschlüsse. Elektroden aus reinem Platindraht (0,2 mm Durchmesser). Elektroden können einfach vom Anwender ausgetauscht werden. Einfach zu bedienende Klammerverschlüsse zum Verschließen der Gelkassetten. 3

5 3. Betriebsbedingungen BB100: BB200: Ca. Puffervolumen 1100 ml 4500 ml Anzahl an Kassetten 4 4 Max. mögliches Gelformat 8,5 x 9 cm 14 x 16 cm Max zulässige Spannung 500 Volt 500 Volt Max. zulässiger Strom 2 Amp. 2 Amp. Geeignetes Umfeld: Diese Geräte sind nur für den Gebrauch in geschlossenen Räumen einzusetzen. Die Betriebstemperatur beträgt 4 C bis 65 C. Für den Betrieb ist empfohlen: Maximale relative Luftfeuchtigkeit bis zu 80 % (bei einer Temperatur bis 31 C), linear abnehmend bis zu 50 % relativer Luftfeuchtigkeit (bei einer Temperatur bis 40 C), bei maximaler Höhe von 2000 m (NN). 4. Bedienung des Gerätes 4.1. Sicherheitsvorkehrungen Bitte lesen Sie vor Gebrauch die Bedienungsanleitung. Vor Entfernen des Kammerdeckels die Elektrophorese-Kammer von dem Stromgeber trennen (Stecker ziehen). Maximal zulässige Spannung und zulässiger Strom dürfen nicht überschritten werden (siehe "Betriebsbedingungen"). Betreiben Sie diese Elektrophoresekammer nicht in einer Metallschale. Beachten Sie das maximal zulässige Volumen des Transferpuffers (siehe 3. Betriebsbedingungen). Acrylamid ist ein leicht flüchtiges Neurotoxin und krebserregend. Bitte tragen Sie daher Schutzkleidung. Auch ein auspolymerisiertes Gel enthält noch unpolymerisierte Monomere. Tragen Sie daher Sicherheitshandschuhe. Bei Austausch der Platinelektrode sollte die Kammer durch einen Sicherheitsbeauftragten überprüft werden. 4

6 4.2. Pflege und Wartung der Transferkammer Um den Kammerdeckel zu entfernen, drücken Sie mit beiden Daumen die Plastik-stege nach unten und heben Sie parallel dazu den Deckel an. Reinigen Sie vor Gebrauch die Kammer mit destilliertem Wasser. Wichtiger Hinweis: Acrylplastik ist nicht resistent gegen aromatische oder halogenierte Kohlenwasserstoffe, Ester, Ketone sowie Alkohole (>30 %) oder Säuren (>25 %). Trocknen Sie die Elektroden vor Gebrauch mit einem sauberen Papiertuch. Vor Erstbenutzung und in möglichst regelmäßigen Zeitabständen (z.b. 1x per Monat) sollten Sie die Klebekanten der Kammer auf eventuelle undichte Stellen überprüfen. Hierzu stellen Sie die Kammer auf ein Papiertuch und füllen sie mit destilliertem Wasser bis zu der maximalen Füllhöhe. Sie können nun leicht undichte Stellen auf dem Papiertuch erkennen. Sollte dies der Fall sein, informieren Sie bitte sofort SERVA ELECTROPHORESIS GmbH in Heidelberg bzw. den zuständigen Distributionspartner. Zur Reinigung der Elektroden darf keine Bürste verwendet werden. Hierfür genügt es, die Kammer gründlich mit destilliertem Wasser zu spülen. Versichern Sie sich, dass die Elektroden sauber und trocken sind, bevor Sie die Kammer benützen oder zur Aufbewahrung lagern. Alle Bestandteile nach der Benutzung gründlich mit deionisiertem Wasser spülen und die Elektrodenverbindungen mit einem sauberen Papiertuch abtrocknen. Benutzen Sie niemals organische Lösungsmittel Durchführung eines Transfers Kühlen und entgasen Sie das benötigte Puffervolumen an Transferpuffer vor (siehe 3. Betriebsbedingungen, Seite 4). Der Puffer sollte vor Zusatz von SDS entgast werden. Der am häufigsten eingesetzte Puffer ist der nach Towbin et al., 1997 (Kat.-Nr , Towbin Buffer, 10x for Western Blotting): 25 mm Tris 192 mm Glycin 20 % Methanol ph 8,3 Dieser Puffer kann mit oder ohne Zusatz von 0,05-0,1 % (w/v) SDS eingesetzt werden. 5

7 Alternative Transferpuffer enthalten: und 48 mm Tris 39 mm Glycin 20 % Methanol ph 9,2 (Bjerrum and Schafer-Nielsen, 1986) 10 mm NaHCO 3 3 mm Na 2 CO 3 20 % Methanol ph 9,9 (Dunn, 1986) Füllen Sie den Tank zur Hälfte mit Transferpuffer. Verbinden Sie den Kühlwasservorrat mit den Schlauchanschlüssen des Tank-sockels. Legen Sie einen Magnet-Rührfisch in den Tank, um konstante Temperatur während des Elektrophoresevorgangs zu erhalten. Tragen Sie während dem Zusammenbau der Transferkassettenbestandteile Hand-schuhe (wie unten beschrieben). Äquilibrieren Sie das Gel im kalten Transferpuffer, um SDS und Salze zu entfernen. Dadurch kommt es nicht zu Größenveränderungen der Gele während des Transfers und Wärmeeffekte werden reduziert. Äquilibrieren Sie ein im Gelformat zugeschnittenes Stück Transfermembran in Transferpuffer für ca. 15 Minuten. Schneiden Sie sechs Stücke Blottingpapier ca. 5mm größer als das Gelformat zurecht und wässern Sie diese in Transferpuffer. Legen Sie die Schwämme in Transferpuffer. Falls die Schwämme größer sind als das von Ihnen üblicherweise benötigte Format, schneiden Sie diese auf Ihr Format zu. Machen Sie sich vertraut mit den Kassetten und den zugehörigen Klammern zum Fixieren des Blot-Sandwiches. Richten Sie das Gel auf drei vorgefeuchteten Blottingpapieren in einer Wanne mit Transferpuffer aus. Richten Sie die Transfermembran aus und legen Sie diese vorsichtig über das Gel. Arbeiten Sie von der Mitte aus und lassen Sie die Enden nach und nach herunter-gleiten. Versuchen Sie nicht die Membran zu verrücken, da es bereits zu einem Transfer kommen kann. Legen Sie drei weitere Blottingpapiere auf das Sandwich. Benutzen Sie einen sauberen Glasstab, den Sie vorher in Transferpuffer getaucht haben, um eingefangene Luftblasen durch Herausrollen zu entfernen. Setzen Sie das Gel/Membranensandwich in die Klammerkassette wie es unten beschrieben ist. Beachten Sie die Ausrichtung des Gels in Relation zu der Mem-bran, und benutzen Sie einen Bleistift oder einen Marker (auf der Klammer), um die + (positive)- Seite (d.h. die Membranseite) auf der Kassette zu markieren. Sandwich in der folgenden Reihenfolge zusammensetzen: 6

8 1. Kassette negative Seite 2. Vorgefeuchteter Schwamm 3. Drei vorgefeuchtete Blottingpapiere 4. Gel 5. Vorgefeuchtete Transfermembrane 6. Drei vorgefeuchtete Blottingpapiere 7. Vorgefeuchteter Schwamm 8. Kassette positive Seite 9. Klammer zum Zusammenhalten der Kassette Drücken Sie anschließend vorsichtig die Kassettenseiten zusammen und befestigen Sie die 2 Klammern auf der oberen und unteren Kante. Stecken Sie die Kassette mit der Transfermembrane auf der positiven Seite in einen der Tankschlitze. Fügen Sie noch etwas Transferpuffer hinzu, bis die gesamte Fläche der Kassette bedeckt ist. 7

9 Schließen Sie den Sicherheitsdeckel und lesen Sie die Laufbedingungen in Tabelle 1. Beachten Sie, dass diese Bedingungen für Ihre Anwendung optimiert sein sollten. Folgende Faktoren können den Erfolg des Transfers beinflussen: Gelporosität, Pufferzusammensetzung und ph, Transferzeit, Transferfelddichte (V/cm), Molekulargewichtsbereich, Rühren des Puffers und Temperaturkontrolle, Wahl der Membran und des Deketionssystems. Restliche Salze im Gel könnten eine Erhitzung des Systems bewirken, deshalb ist eine vorherige Äquilibrierung des Gels mit Transferpuffer wichtig. Wählen Sie anfänglich ein Puffersystem wie das genannte von Towbin et al (1979), und führen Sie einen Vorversuch mit Molekulargewichtsmarkern durch. Beginnen Sie mit einer niedrigen Stromstärke oder Spannung. Tabelle 1: Transferpuffer und Laufbedingungen: BlueBlot Wet 100 BlueBlot Wet 200 Transferpuffer über Nacht 1 Stunde über Nacht 1 Stunde Towbin Puffer Volt ma Volt ma Volt ma Volt ma 25 mm Tris ph 8,3 192 mm Glycin 20 % Methanol Bjerrum Puffer 48 mm Tris ph 9,2 39 mm Glycin 20 % Methanol Volt ma Volt ma Volt ma Volt ma Dunn Puffer 10 Volt ma Volt ma 10 Volt ma Volt ma 10 mm NaHCO 3 3 mm Na 2 CO 3 ph 9,9 20 % Methanol ph-wert nicht mit Säure oder Alkali einstellen. Der ph-wert kann sich entsprechend der Reinheit der Reagenzien und Genauigkeit des Wiegens leicht verändern. Hin-zugabe von Ionen könnte eine Überhitzung während des Transfers hervorrufen. Falls Sie einen Säurepuffer wählen, z.b. 0,7 % Essigsäure, verläuft der Transfer umgekehrt als normal, d.h. von der Anode zu der Kathode. Dieser Puffer eignet sich für IEF Gele oder basische Proteingele (native). 8

10 5. Literatur Towbin, J., Staehelin, T., and Gordon, J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications, Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 76, Bjerrum, O.J. and Schafer-Nielsen, C. (1986). Buffer systems and transfer parameters for semi-dry electroblotting with horizontal apparatus, in: Dunn Electrophoresis 1986, , VCH, Weinheim, Germany. Dunn, S.D. (1986). Effects of the modification of transfer buffer composition and the renaturation of proteins in gels on the recognition of proteins on Western blots by monoclonal antibodies, Anal. Biochem. 157, B.D. Hames (1990). Blotting Techniques Ch.1, 7.10, p In: Gel Electrophoresis of Proteins, A Practical Approach, 2nd Edition, B.D.Hames and D.Rickwood, eds., IRL Press. Sollten Sie weitere Fragen haben zur SERVA BlueLine, können Sie sich gerne an unseren Technischen Service in Heidelberg wenden. Tel.:

11 6. Empfohlene Produkte für den Proteintransfer Die SERVA Reagenzien für die Elektrophorese unterliegen der ständigen Qualitäts- und Applikationskontrolle, um optimale Ergebnisse zu gewährleisten. Wir empfehlen den Einsatz der Reagenzien besonders bei Betrieb der BlueLine Elektrophoresegeräte, da die Qualität der Verbrauchsmittel auf die Geräte abgestimmt ist (Applikationstest). Produkt Kat.-Nr. Abpackung Glycin analytical grade g 500 g 1 kg 5 kg Tris g 1000 g 5 kg Sodium Dodecyl Sulfate g 250 g 1 kg Sodium Dodecyl Sulfate in pellets g 250 g 1 kg Methanol für HPLC ,5 l Towbin Buffer 10X, for Western Blotting l Nitrocellulose NC 45, 0,45 µm Blätter 8,8 x 8,8 cm Nitrocellulose NC 45, 0,45 µm Rolle 30 cm x 3 m Nitrocellulose NC 2, 0,2 µm Blätter 20 x 20 cm Nitrocellulose NC 2, 0,2 µm Rolle 30 cm x 3 m SERVA Fluorobind, PVDF, 0,2 µm Blätter 20 x 20 cm SERVA Fluorobind, PVDF, 0,2 µm Blätter 10 x 10 cm SERVA Fluorobind, PVDF, 0,2 µm Rolle 25 cm x 3 m SERVA Nylon-Bind A, amphoteric, 0,2 µm Rolle 30 cm x 3 m SERVA Nylon-Bind A, amphoteric, 0,45 µm Blätter 8,0 x 8,3 cm SERVA Nylon-Bind A, amphoteric, 0,45 µm Blätter 10 x 10 cm SERVA Nylon-Bind A, amphoteric, 0,45 µm Rolle 30 cm x 3 m SERVA Nylon-Bind A,amphoteric, 0,45 µm Blätter 20 x 20 cm 10

12 Produkt Kat.-Nr. Abpackung SERVA Nylon-Bind B, positive, 0,45 µm Blätter 8,0 x 8,3 cm SERVA Nylon-Bind B, positive, 0,45 µm Blätter 10 x 10 cm SERVA Nylon-Bind B, positive, 0,45 µm Rolle 30 cm x 3 m SERVA Nylon-Bind B, positive, 0,45 µm Blätter 20 x 20 cm Fluorobind Membrane, PVDF, 0,2 µm Rolle 25 cm x 3 m Fluorobind Membrane, PVDF, 0,2 µm Blätter 20 cm x 20 cm Fluorobind Membrane, PVDF, 0,2 µm Blätter 10 cm x 10 cm Immobilon -P-membrane, PVDF, 0,2 µm Rolle 26,5 cm x 3,75 m Immobilon -P-membrane, PVDF, 0,2 µm Blätter 9 cm x 12 cm Weitere Produkte für die Elektrophorese finden Sie im SERVA Electrophoresis Hauptkatalog, den wir Ihnen auf Wunsch gerne zusenden. 11