Workshop Sicher dokumentieren und messen Reproduzierbarkeit in der industriellen Mikroskopie

Transkript

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2 Workshop Sicher dokumentieren und messen Reproduzierbarkeit in der industriellen Mikroskopie Einflussfaktoren zum reproduzierbaren Arbeiten in der industriellen Mikroskopie Referent: Johannes Kaindl Seite 2

3 Grundlagen Fehlerquellen beim Arbeiten mit Mikroskopiesystemen Benutzereinfluss Probenpräparation Geräte + Gerätekonfiguration - Reproduziergenauigkeit der Systemhardware - Einstellungen Beleuchtung (Helligkeit, Kontrast, ) - Auflösungsvermögen (Mikroskop + Kamera) Software - Pixelskalierung - Messprogramm, z.b. - Falsche Objekterkennung ( Segmentierung ) - Ungeeignete Bildverarbeitungsroutinen (Bildverbesserung?) - Ungeeignete Messparameter Seite 3

4 Grundlagen Welche Eigenschaften sollte ein Mikroskopiesystem haben? Vollständig automatisierbare Systemhardware - Einsatz digitaler Kameras - Verwendung motorisierter Mikroskope und Komponenten Einfache und sichere Bedienung - Klare Darstellung, was als nächstes getan werden muss - Beschränkung auf die tatsächlich verwendeten Funktionen Nur benötigte Bedienelemente anzeigen - Einheitliches Bedienkonzept, Bedienoberfläche, Bedienelemente Automatisierung - Auswerteroutinen, keine interaktive Bedienung - Automatische Probenzuführung über Robotersysteme Datensicherheit - Einfache Datenverwaltung - Speicherung der Daten an einem Ort Klare Verbindung zwischen Bild und Daten - Unveränderbarkeit der Daten Seite 4

5 Probenpräparation Voraussetzung für korrekte Analyseergebnisse Gusseisen mit Lamallengraphit - Bild 1: nicht ausreichend poliert Polymer - Bild 1: fehlerhafter Schnitt mit Mikrotom Seite 5

6 Probenpräparation Voraussetzung für automatische Routinen Faserbündel zur Herstellung von Dialysefiltern - Spezielle Probenhalterung Kohlestofffasern - Verdünnung der Fasern 0,5 mm Seite 6

7 Probenpräparation Fazit Gute Präparation ist nötig, um gute Bildqualität und korrekte Messergebnisse zu erhalten Aufwand in die Probenpräparation lohnt sich - Durchsatz - Auswertedauer Auch teuere Systemhardware und software kann aus schlecht präparierten Proben KEINE guten Bilder und richtige Messergebnisse zaubern Seite 7

8 Gerätekonfiguration Einsatz motorisierter Systeme Motorisierte Systeme garantieren 100%-ige Wiederherstellbarkeit einer Systemkonfiguration Wichtige Voraussetzung für reproduzierbares Arbeiten Reproduzierbarkeit: Maß für die Wiederholbarkeit einer Messung (z.b. Einfluss der Defokussierung, ) Keine reine Komfortfunktion - Z.B. ist die Bedienung eines Fokus manuell u.u. eingängiger SteREO Discovery - Zoomeinstellung - Beleuchtung - Kontrastverfahren Axio Imager - Objektive - Beleuchtung - Kontrastverfahren Seite 8

9 Gerätekonfiguration Voraussetzungen für Reproduzierbarkeit Motorisierung bzw. Codierung aller Systemkomponenten - Codierung: Komponenten können erkannt, aber nicht gesteuert werden - Motorisierung: Komponenten können auch gesteuert werden Einsatz digitaler Kameras - Analoge Kameras haben häufig Schalter etc. die über Software nicht gesteuert werden können Vollständige Einbindung in die Software - Komponenten müssen erkannt werden - Hardware muss vollständig über die Software bedient werden können Seite 9

10 Reproduzierbarkeit Einfluss der Fokussierung am SteREO Discovery Fokussierung beeinflusst scheinbare Objektgröße laterale Auflösung etwa 3 mal besser als axiale Auflösung Messung in z-richtung mit Unsicherheit verbunden sorgfältige Fokussierung für reproduzierbare Messung nötig SteREO Discovery: Fehler < 1% (Zoom und Fokus codiert oder motorisiert) z-pos.: 24,5 mm Fläche: Pixel² 25,5 mm Pixel² 26,5 mm Pixel² Seite 10

11 Reproduzierbarkeit Einfluss der Fokussierung am SteREO Discovery System: SteREO Discovery.V12 10 Messungen an Kreis mit Ø 1,6mm Vor jeder Messung: Maximale Defokussierung Ergebnisse: Durchmesser in X Durchmesser in Y Fläche Standardabweichung in % 0,14 0,16 0,009 Spanne in % 0,27 0,47 0,030 Seite 11

12 Auflösung des abbildenden Systems Kamera Anforderung: - alle vom Mikroskop-Objektiv aufgenommenen Details sollen auch von der Kamera aufgenommen und vom Ausgabematerial dargestellt werden können - leere Auflösung soll vermieden werden, um nicht unnötig große Dateien zu erzeugen Bedingung: - Auflösungsvermögen Bildsystem > Mikroskop - Shannon-Nyquist-Kriterium: Das kleinste Detail muss mit zwei Bildpunkten aufgelöst werden Abschätzung: F cut off microscope 3000 N. A. M Objektiv M Objektiv Adapter lp/mm Seite 12

13 Auflösung des abbildenden Systems Nötige Kameraauflösung bei Lichtmikroskopen Mikroskop AxioImager 2/3 CCD-Kamera Mikroskop-Objektiv Adapter 1x Adapter 0,63x Maßstabszahl Numerische Apertur Pixel (x) Pixel (y) Pixel (x) Pixel (y) 2,5x 0, Erforderliche Bildelementezahl pro Farbe für die Übertragung der Mikroskopauflösung auf die Kamera 10x 0, x 0, x 0, x 1, Daumenregel: nur bei niedrigen Objektiv-Maßstabszahlen sind hohe Kamera-Auflösungen nötig Seite 13

14 Auflösung des abbildenden Systems Nötige Kameraauflösung bei Stereomikroskopen SteREO Discovery.V12 Cut-off-Frequenz 2/3 CCD-Kamera Adapter 1x Adapter 0,63x Adapter 1x Adapter 0,63x Abbildungsmaßstab Numerische Apertur Lp/mm Lp/mm Pixel (x) Pixel (y) Pixel (x) Pixel (y) F 0,8x 0,019 71,3 113, x 0,022 66,0 104, x 0,039 58,5 92, cut off microscope 3000* N. A. M M Objektiv Objektiv Adapter ß lp/mm 4x 0,067 50,3 79, x 0,079 47,4 75, x 0,116 43,5 69, x 0,144 43,2 68, F cut off microscope M 3000 N. A. Objektiv M Objektiv Adapter ß Lp/mm Seite 14

15 Notwendige Auflösung für Messaufgaben Messfehler abhängig von Auflösung Auflösungskriterium hat bei Messaufgaben höhere Anforderungen 1 Partikel muss auf mindestens 10 Pixel in der CCD-Kamera abgebildet werden, erst dann ist der systematische Messfehler < 2% Seite 15

16 Software Pixelskalierung Skalierung digitaler Bilder: Zuweisen einer definierten Messstrecke pro Pixel mit Referenzmikrometer Einflussfaktoren: Objektiv Kameraadapter Kameraauflösung Möglichkeit zur Kontrolle der förderlichen Auflösung (maximal /2) 0,225 µm Seite 16

17 Software Richtige Pixelskalierung bei motorisierten Systemen Automatische Zuordnung der richtigen Skalierung zur Objektiv (AxioImager) bzw. Vergrößerung (SteREO) bei codierten oder motorisierten Stativen Automatische Anpassung der Skalierung an die Auflösung der AxioCam Vorteil im Bildformat ZVI: Skalierung wird im Bild gespeichert Automatische Anpassung der Maßstabsbalken und Messwerkzeuge an die Skalierung des Bildes Seite 17

18 Messsystem mit SteREO Discovery Automatische Skalierung Skalierung des Systems für jedes Objektiv und jede Kamera Software AxioVision berechnet Skalierung basierend auf ausgelesener Vergrößerungseinstellung Minimierung von Bedienfehlern Ausreichend für reine Dokumentationsaufgaben Nicht empfehlenswert bei Messaufgaben oder Aufnahme von MosaiX- Bildern Seite 18

19 Software Verwendung von Messprogrammen Messprogramme ( Skripte ) dienen der Automatisierung immer wiederkehrender Aufgaben. Festlegung der Reihenfolge und Parametereinstellungen aller verwendeter Funktionen. - Ungeeignete Bildverarbeitungsroutinen (Bildverbesserung?) Ausschluss subjektiver Bedienfehler - Falsche Objekterkennung ( Segmentierung ) Punktuell können interaktive Eingriffe durch den Bediener erlaubt werden. - Z.B. zur Positionierung der Probe, zur Einstellung von Helligkeitsgrenzen für die Objekterkennung etc. In der Praxis: Häufig Mischform - Keine Vollautomatik, sondern Vorschlag durch das System mit der Möglichkeit interaktiv Korrekturen vorzunehmen Seite 19

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