Zusammenhang zwischen biologischer Aktivität und lokalen Konformationsänderungen in Proteinen

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1 Struktur- und Zellbiologie Zusammenhang zwischen biologischer Aktivität und lokalen Konformationsänderungen in Proteinen Fischer, Gunter; Bordusa, Frank Max-Planck-Forschungsstelle für Enzymologie der Proteinfaltung, Halle/Saale Forschungsbereich - Enzymologie der Proteinfaltung Korrespondierender Autor: Fischer, Gunter fischer@enzyme-halle.mpg.de Zusammenfassung Die Aufrechterhaltung normaler physiologischer Funktionen einer Zelle oder von Zellverbänden ist direkt mit der Sicherung der nativen, funktionalen Konformation zellulärer Proteine verbunden. Konformativ abweichende Proteine können ihre Funktion nicht erfüllen und sind im schlimmsten Falle sogar zelltoxisch. Unter diesen Umständen spielen sie oft für die molekulare Pathogenese vieler Erkrankungen beim Menschen eine entscheidende Rolle. Der Zusammenhang zwischen Konformation und biologischer Aktivität eines Proteins wird durch ein außerordentlich komplexes Netzwerk intra- und intermolekularer Wechselwirkungen bestimmt. Globale Konformationsänderungen in einem Protein sind durch Membraninsertion, Denaturantien, Stabilisatoren und andere Zusatzstoffe leicht zu erzielen. Immer sind Hunderte von chemischen Bindungen im Protein gleichzeitig von Konformationsänderungen betroffen. Bisher weiß man wenig über die Beziehungen zwischen definierten Konformationsänderungen und der dadurch bedingten Modifizierung der Proteinfunktion. Als Ursache gilt, dass es nur unzureichend gelingt, schnelle, selektive Konformationsänderungen einzelner Atomgruppen in einem Protein zu bewirken, an einem vorbestimmten Ort der Polypeptidkette zu platzieren und den biologischen Effekt dieser Änderungen unmittelbar zu untersuchen. Gunter Fischer und seine Mitarbeiter haben neue Verfahren entwickelt, um den Einfluss der Konformation einer einzelnen Peptidbindung auf die enzymatische Aktivität von RNase S und die Strukturbildung bei einer Polyprolin II-Helix zu messen. Neben der gezielten Umschaltung einer lokalen Konformation in Proteinen steht die Frage der Induktion nativer Proteinkonformationen durch intermolekulare Wechselwirkungen im Fokus der Untersuchungen. Durch dieses Verfahren kann es gelingen, nicht-native Faltungszustände wieder funktional werden zu lassen. Die Wissenschaftler der Max-Planck-Forschungsstelle für Enzymologie der Proteinfaltung haben das IANUS-Verfahren (IANUS: : Induced organization of structure by matrix-assisted togetherness) entwickelt. Dabei werden Bibliotheken von Peptidpaaren auf einer planaren Matrix synthetisiert, die aus binären Protein-Protein-Komplexen abgeleitet sind. Unter den Bedingungen des IANUS-Verfahrens kann man aus den Peptidpaaren die Architektur der Protein-Protein-Interaktionsstellen bestimmen. Abstract Preservation of the functional conformation of proteins may be critical for maintaining the physiological function of cells and tissues. Being toxic in the extreme case, proteins with aberrant conformational properties lack proper functioning in cells. More specifically, a defective protein conformation was shown to play a major role in the molecular pathogenesis of many human diseases. A highly complex array of intra- and intermolecular interactions determines the relationship between conformation and biological activity of a protein. Denaturants, membrane insertion, stabilizers and other additives were considered suitable for inducing conformational changes of a protein on the global scale. However, 155

2 Tätigkeitsbericht 2005 Fischer, Gunter et al. Zusammenhang zwischen biologischer Aktivität und lokalen... the conformational process involves the simultaneous switching of hundreds of chemical bonds. Until now deciphering the relationship between a local conformational change and the function of the protein involved is restricted to a few cases. Major limitations are (1) a lack of fast methods to switch a limited polypeptide segment to another position, (2) to position the conformational change at a predetermined site (3) to directly probe the new conformational state for biological activity. Gunter Fischer and colleagues have developed new methods for measuring the effect of a very local conformational change, predisposing a single peptide bond in the polypeptide chain, on the enzymatic activity of RNaseS and the structure formation of a polyproline II helix. In addition, methods for induction of native protein conformation by external forces, which relate to conformational switching at local sites on the molecular level, have been investigated. It can be hypothesized that a ligand complementary to the binding site of a native protein induces a functional protein state in a non-native protein. A group at the Max-Planck-Research Unit for Enzymology of Protein Folding created the IANUS procedure (IANUS: Induced organization of structure by matrix-assisted togetherness). A library of matrixbound peptide pairs characterizes the IANUS experiment where a low resolution three-dimensional picture of protein-protein interaction sites can be evaluated on the basis of sequence information only. Conformational induction of native-like polypeptide segments forms the molecular basis of the IANUS method. Die Bioaktivität eines Proteins ist direkt an dessen Faltungszustand gekoppelt und somit mit der Konformation der Polypeptidkette verknüpft. Die globale bioaktive Konformation eines Proteins ist eine gut zugängliche Größe und wird durch dessen dreidimensionale Struktur im nativen Zustand charakterisiert. Die Zusammenhänge zwischen der Konformationsdynamik und der biologischen Aktivität sind weniger gut untersucht, obwohl Konformationsänderungen zwangsläufig ein Bestandteil der Adaption der Proteine an ihre zelluläre Funktion sind. Noch wesentlich unschärfer sind Informationen darüber, inwieweit streng lokalisierte Konformationsänderungen etwa innerhalb des Radius einer einzelnen funktionellen Gruppe oder Bindung biologische Aktivitäten tangieren. Globale, sich über Hunderte und Tausende von Bindungen erstreckende simultane Konformationsänderungen sind leicht zu erreichen, wie man aus Faltungs/Entfaltungsexperimenten der Proteine gut ableiten kann. Allerdings ist auch bei diesen Experimenten die Zuordnung eines bestimmten Faltungszustandes zur biologischen Aktivität des Proteins in den meisten Fällen nicht gelungen. Gunter Fischer und Frank Bordusa haben mit der Substitution einer Peptidbindung durch die isostere Thioxopeptidbindung einen universell anwendbaren, photoaktivierbaren konformationellen Schalter in eine Polypeptidkette eingeführt. Durch UV/Vis-Bestrahlung eines Thioxopeptids, das eine sekundäre Thioxoamid-Peptidbindung enthält, wird der ursprüngliche Gehalt am cis-konformeren Peptid von zirka 0,2 auf bis zu 20 % mit einer Zeitkonstanten im Pikosekundenbereich erhöht. Alle übrigen Bindungen in einer Polypeptidkette bleiben konformativ unbeeinflusst. Somit wird eine genau definierte Konformationsänderung in einem eng begrenzten Bereich einer Polypeptidkette erreicht, bei dem sich der Abstand der C-alpha-Atome der durch die Thioxopeptidbindung verbundenen Aminosäuren um zirka 0.8 Ảngström verkürzt. Bei der Photoschaltung der Thioxopeptidbindung von trans nach cis zwischen den Aminosäuren Ala4 und Ala5 des S-Peptides von RNase S gelang es nachzuweisen, dass die enzymatische Aktivität der RNAse S komplett verloren geht. Dies geschieht, obwohl die photoinduzierte Konformationsänderung relativ weit entfernt vom aktiven Zentrum des Enzyms stattfindet. Schaltet man die Peptidbindung in die ursprüngliche Konformation zurück, wird das Enzym wieder voll aktiv. In einem zweiten Beispiel haben die Wissenschaftler die für Protein-Protein-Wechselwirkungen äußerst bedeutsame Polyprolin II-Helix mittels der photoschaltbaren Thioxosonde untersucht. Hier stand der bisher offene Bildungsmechanismus für diese Sekundärstruktur zur Diskussion. Fischer und sein Team haben herausgefunden, dass Konformationsänderungen innerhalb der Helix räumlich gerichtet Max-Planck-Gesellschaft

3 sind. Alle Rotationsbewegungen in bereits gebildeten Helixbereichen verlangsamen das Kettenwachstum, wenn sie C-terminal zu einem noch nicht in die Helix eingebundenen Prolinrest lokalisiert sind. Sind die Helixbereiche N-terminal vorhanden, sind sie weitgehend ohne Einfluss auf die Kettenverlängerung (Dirk Wildemann, Stephan Wawra, Christian Lücke). Die Forschergruppe in Halle untersuchte weiterhin die Möglichkeit, aus den Interaktionsdaten kurzkettiger Oligopeptide abgeleitet aus den Aminosäuresequenzen zweier interagierender Proteine oder eines Proteins und eines Peptides die Architektur der Interaktionsstellen im Proteinkomplex abzuleiten. Während kurzkettige Peptide durch automatisierte chemische Synthese leicht zugänglich sind, müssen zur Herstellung von Proteinen aufwändige biologische Verfahren angewandt werden. In manchen Fällen sind native Proteine in den Mengen, die zur Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen notwendig sind, überhaupt nicht zugänglich. Eine einfache Methode, die in der Lage ist, ein dreidimensionales Bild der Wechselwirkungsstellen und der daran beteiligten Sequenzbereiche zu liefern, ist daher für biologische und pharmakologische Forschungen außerordentlich hilfreich. Zu diesem Zwecke wurde das IANUS-Verfahren entwickelt und am Streptavidin-Strep-tag II-Komplex erprobt. Abb. 1: Prinzip der IANUS-Methode: Zwei an ein bifunktionelles Templatmolekül gebundene Oligopeptide werden auf definierten Spots auf einer Zellulosemembran synthetisiert. Oligopeptid I ist aus der Aminosäuresequenz eines interagierenden Proteins A (IPA) und Oligopeptid II aus der Aminosäuresequenz seines Interaktionspartners Protein B (IPB) abgeleitet. Die IANUS-Peptidmembran wird mit Protein IPA inkubiert und auf Bindung des Proteins IPA an den jeweiligen Spot mittels Western-blot-Analyse getestet. (A) Nativähnliche Interaktion innerhalb des Oligopeptidpaares unterdrückt die Bindung des Antikörpers an den jeweiligen Spot. Es ist keine Spotfärbung zu beobachten. (B) Falls keine Interaktion im Peptidpaar zu verzeichnen ist, wird der Antikörper gebunden. Der Spot wird dunkel gefärbt. Urheber: Max-Planck-Forschungsstelle für Enzymologie der Proteinfaltung Zur Lösung des Verteilungsproblems der multiplen Peptidkonformationen wurde die effektive Konzentration der potenziell interagierenden Oligopeptide durch intramolekulare Anordnung beider Ketten 157

4 Tätigkeitsbericht 2005 Fischer, Gunter et al. Zusammenhang zwischen biologischer Aktivität und lokalen... auf einem matrixfixierten bifunktionalen gabelförmigen Molekül (Templat) so erhöht, dass eine konformationelle Induktion erfolgen kann. Die in den Peptidpaaren induzierten nativ-ähnlichen Interaktionen wurden über ein antikörpergestütztes Detektionssystem von nicht-interagierenden Oligopeptidpaaren unterschieden (Abb. 1). Beim IANUS-Verfahren wird die gesamte Kollektion der potenziellen Interaktionsstellen in einem Spot-Array erfasst. Ein Peptidblock umfasst somit die gesamte Aminosäuresequenz des jeweiligen Proteins in Form von überlappenden, gleich langen Oligopeptiden. Für den Streptavidin-Strep-tagII-Komplex, dessen dreidimensionale Struktur durch Röntgenstrukturanalyse bekannt ist, wurde mit der IANUS-Methode die nahezu vollständige Bindefläche beider Moleküle erfasst. Es wurde vor allem keine falsch-positive Interaktionsstelle identifiziert. Diese neue Strategie der Bindeflächenerkennung von Proteinkomplexen, die auf der konformativen Induktion komplementärer molekularer Oberflächen von Oligopeptidpaaren beruht, ist erweiterungsfähig. Durch Fluoreszenzmarkierung gelang es bereits, komplementäre Oberflächen der IANUS-Peptidpaare direkt zu detektieren. Damit kann man eine Interaktionsanalyse durchführen, die als Informationsbasis ausschließlich die Primärstrukturen der interagierenden Proteine nutzt. Die Herstellung eines Proteins in Substanz ist dann nicht mehr erforderlich (Cordelia Schiene-Fischer, Günther Jahreis, Chao Yu, Miroslav Malesevic, Mike Schutkowski). Konformative Erkennungsprozesse werden auch bei hochspezifischen Antikörper-Antigen-Reaktionen realisiert. Molekulare Basis dieser Erkennungsprozesse ist im Falle von peptidischen Epitopen primär die Abfolge der im Epitop vorhandenen individuellen Aminosäuren (Primärsequenz). Diese können aufeinanderfolgend auf der Polypeptidkette angeordnet sein (lineares Epitop) oder aber infolge der Strukturierung des proteinogenen Bindungspartners ein so genanntes nicht-lineares Epitop ausbilden, bei dem die durch den Antikörper selektiv erkannten Aminosäuren in der Primärsequenz weit voneinander entfernt positioniert sein können. Damit liefert die Analyse derartiger Interaktionen Strukturdaten, die neben einer rein diagnostischen Anwendung auch Relevanz für Konformationsuntersuchungen in Proteinen besitzen. Letztere ist besonders bedeutsam, weil die konformationsspezifische Identifizierung von Xaa-Pro-Bindung (Xaa steht für eine beliebige Aminosäure) in Proteinen unter Zellbedingungen noch ungelöst ist, aber besonders für im Zellzyklus verankerte Proteine von hoher Relevanz wäre. Voraussetzung für den effizienten Einsatz dieser Sonden ist jedoch ein analog sensitives Detektionssystem für den Antikörper selbst. Ideal hierfür wäre die Dekoration des Antikörpers mit bereits in geringer Konzentration nachweisbaren Reportergruppen. Die Einführung solcher Funktionalitäten führt allerdings wegen der fehlenden Selektivität chemischer Modifizierungsreaktionen in aller Regel zu einer Modifizierung der Epitop-bindenden Bereiche des Antikörpers und damit zu dessen Inaktivierung. Die Forscher der Max-Planck-Forschungsstelle lösten dieses Problem durch die Verwendung einer so genannten,restriktionsligase. Dieses, durch den Austausch von vier Aminosäuren aus der Serinprotease Trypsin erhaltene Enzym, erkennt selektiv die Tetraaminosäure-Sequenz Tyr-Arg-His- Ala und katalysiert in einer Transamidierungsreaktion die Abspaltung der Teilsequenz Arg-His-Ala unter Ersatz mit einer analogen, jedoch die Reportergruppe enthaltenden Peptidsequenz. Der Einbau dieser Erkennungssequenz in die C-terminale Region der beiden F ab -Fragmente (F ab : Antigen-bindende Region des Antikörpers) führt demzufolge neben der Abspaltung der für die Epitop-Bindung verantwortlichen F ab -Fragmente gleichzeitig zu deren C-terminaler Modifizierung mit der entsprechenden Reportergruppe (Abb. 2). Das Produkt dieser Reaktion, ein funktionell auf die Bindung des Epitops verkürzter und selektiv am C-Terminus markierter Antikörper, lässt sich direkt für Faltungsstudien einsetzen (Frank Bordusa, Sandra Liebscher in Kooperation mit Roche Diagnostics) Max-Planck-Gesellschaft

5 Abb. 2: Strategie zur selektiven Abspaltung der Epitop-bindenden F ab -Fragmente von Antikörpern unter gleichzeitiger C-terminaler Markierung (6-CF: 6-Carboxyfluorescin) mittels einer von der Serinprotease Trypsin abgeleiteten synthetischen,restriktionsligase. Als Produkt dieser Reaktion werden funktionale und selektiv mit Reportergruppen markierte Antikörper-Fragmente für Konformationsuntersuchungen erhalten. Urheber: Max-Planck-Forschungsstelle für Enzymologie der Proteinfaltung 159