Selbstreplizierende 3-5 -Thiol-Oligodesoxynucleotidderivate: Zum Einfluss peptidischer Abgangsgruppen auf die. Oligonucleotidreplikation

Transkript

1 Selbstreplizierende 3-5 -Thiol-ligodesoxynucleotidderivate: Zum Einfluss peptidischer Abgangsgruppen auf die ligonucleotidreplikation Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät für Chemie der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Volker Patzke aus Menden Bochum 2005

2 1. Referent: Prof. Dr. G. von Kiedrowski 2. Referent: Prof. Dr. M. Feigel 3. Referent: Prof. Dr. M. ollmann Tag der mündlichen Prüfung:

3 Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Februar 1999 bis Juni 2005 an der Fakultät für Chemie der Ruhr-Universität Bochum unter der Leitung von Prof. Dr. Günter von Kiedrowski angefertigt. Ich danke errn Prof. Dr. Günter von Kiedrowski für die interessante Themenstellung und die Möglichkeiten zur Gestaltung dieser Arbeit.

4 1 EILEITUG EVLUTI DIE RA-WELT ICTEZYMATISCE, MATRIZEGESTEUERTE REAKTIE SELBSTREPLIZIEREDE LIGUCLETIDE PARABLISCE UD EXPETIELLE REPLIKATI Prinzipien des selbstreplizierenden Minimalsystems SELBSTREPLIZIEREDE MIIMALSYSTEME Selbstreplizierende Peptide Synthetische Replikatoren WEGE ZUR REALISIERUG EXPETIELLER REPLIKATRE LIGATI V LIGUCLETID-AALGA MIIMALE REPLIKASE LIGUCLETIDSYTESE Phosphoramiditverfahren AUFGABESTELLUG ALLGEMEIER TEIL VRUTERSUCUGE: SYTESE EIER PTETIELLE PLYAMI-REPLIKASE UTERSUCUGE ZUR LIGUCLETID-REPLIKATI MIT PSPRIMIDAZLID-KJUGATE EUE VERKÜPFUGSCEMIE I DER LIGUCLETIDREPLIKATI: TIL- DISULFID-AUSTAUSCREAKTIE TIL-MDIFIKATIE A LIGUCLETIDE UTERSUCUG DES 5 -CYSTEAMI-3 -PSPRTIAT-SYSTEMS SYTESE Synthese eines 5 -Mercapto-cytidin- Phosphoramidit Synthese von 3 -Mercapto-Desoxyguanosin Darstellung von 3 -Thio-xylo-guanosin MR-Untersuchungen der 3 -Thio-guanosine Synthese von Festphasen zur 3 -Thiolmodifikation REDUKTI UD ADABUG V TILMDIFIZIERTE LIGUCLETIDE 68

5 3.9. REDUZIEREDE TILFESTPASE DARSTELLUG PTETIELLER MIIMALER REPLIKASE VRBEREITUGE FÜR REPLIKATISEXPERIMETE: AKTIVIERUG V TILLIGUCLETIDE DARSTELLUG V LIGUCLETID-PEPTID-KJUGATE MERCAPT-LIGUCLETIDLÖSUGE TEMPLATMLEKÜLE KZETRATISBESTIMMUG V LIGUCLETID-LÖSUGE KIETISCE UTERSUCUGE Durchführung von nline-kinetiken Untersuchungen zur Reaktionsgeschwindigkeit der Disulfid-Austausch- Reaktionen KIETISCE UTERSUCUGE DES 3-5 -TIL-SYSTEMS Reaktionsbedingungen Kinetiken bei verschiedenen p-werten Aktivierung mit icotinsäuredisulfid REPLIKATISSYSTEME MIT 5 -CYSTEAMI-MDIFIKATI UTERSUCUGE ZUR MIIMALE REPLIKASE ZUSAMMEFASSUG UD AUSBLICK EXPERIMETELLER TEIL MATERIALIE UD METDE Spektroskopische Methoden Chromatographische Methoden Automatisierte Synthese Chemikalien SYTESE Polyamin-Synthese: Synthese von 1-[3-({4-[(3-Dimethylamino-propyl)-methyl-amino]-butyl}-methylamino)-propyl]-3-[2-(1-imidazol-4-yl)-ethyl]-harnstoff Synthese reduzierender Festphasen: Synthese der ukleosidderivate: Geschütztes 5 -Mercapto-desoxycytidin (39, 41) Geschütztes 3 -Mercapto-desoxyguanosin

6 Geschütztes 3 -Mercapto-desoxyxyloguanosin Synthese der Festphasen zur ligonucleotid-synthese Peptidsynthese: Darstellung von 5,5 -Dithiobis(2-nitrobenzoesäure)-hydroxy-succinimidylester (87) [98] 170 Darstellung von 6,6 -Dithiodinicotinsäuresuccinimidylester ligonucleotid-synthese: Postsynthetische ligonucleotid-modifikation Reinigung und Charakterisierung der ligonucleotide Durchführung der nline-kinetiken AAG CMMAD-FILES: SIMULATIE: MESSDATE DER KIETISCE EXPERIMETE LITERATURVERZEICIS

7 Einleitung 1 1 Einleitung 1.1 Evolution Die Frage nach der Entstehung des Lebens hat die Menschheit wohl schon seit Jahrtausenden beschäftigt und führte in der jüngeren Vergangenheit schließlich zu einer naturwissenschaftlichen Auseinandersetzung mit dieser Frage. Mit den Arbeiten von Lamarck ( ) und Darwin ( ) wurde aufgrund der engen Verwandtschaft aller existierenden Lebensformen ein gemeinsamer Ursprung allen Lebens, die so genannte Urzelle, postuliert. [1] Basierend auf Darwins Theorien zur Entwicklung der Vielfalt und Eigenschaften der Arten wurde eine Evolutionstheorie etabliert, welche auf dem Prinzip der Mutabilität und Vererbung mit anschließender Selektion der Arten beruht. Aus biologischer und chemischer Sicht gab es nun zwei verschiedene Wege, sich der Frage nach der Beschaffenheit und Entstehung der Urzelle zu nähern. Während die Biologie versucht, die Evolution durch phylogenetischen Vergleich der einzelnen Lebewesen zeitlich bis zur Urzelle zurückzuverfolgen, beschäftigt sich die präbiotische Chemie mit dem Übergang von toter Materie zu lebenden rganismen. Da die biologische Vorgehensweise zwangsläufig auf einer komplexen zellulären Ebene endet, kann dieser Ansatz kaum Aufschluss über die Entstehung des Lebens geben. Vor der ersten Urzelle müssen bereits einfache sich selbst erhaltende, evolvierbare chemische Systeme existiert haben. Die präbiotische Chemie beschäftigt sich mit der Entstehung einfacher Biomoleküle, den Bausteinen eines lebenden Systems, und untersucht die Entstehung dieser Aminosäuren, Zucker oder ucleobasen aus anorganischer Materie durch Simulation potentiell präbiotischer Umweltbedingungen im Labor. In den zwanziger Jahren des vergangenen Jahrhunderts entwickelten parin und aldane unabhängig voneinander ihre ypothese von der Ursuppe, wonach sich in einer reduzierenden Uratmosphäre aus Methan, Ammoniak, Wasserstoff und Wasser eine chemische Evolution des Lebens ereignet haben soll. [1, 2] Im Jahre 1953 konnte Miller in seinen klassischen Experimenten zeigen, dass sich unter dem Einfluss von elektrischen

8 Einleitung 2 Entladungen in der reduzierenden Atmosphäre neben anderen organischen Verbindungen wie Formaldehyd und Blausäure auch Aminosäuren, die Bausteine von Proteinen, bildeten. [3] In der Folgezeit wurden in zahlreichen weiteren Experimenten präbiotische Synthesemodelle für weitere biologisch relevante Verbindungen beschrieben. Einige Synthesewege seien hier kurz aufgelistet: - Synthese von Zuckern aus Formaldehyd mittels Formose-Reaktion, [4] - Synthese der ucleobase Adenin aus Blausäure und Ammoniak, [5] - Synthese von ucleosiden durch Eindampfen einer wässrigen Lösung von Purinen und Ribose in Gegenwart von Magnesiumsalzen. [6] bwohl man noch nicht für jede aturstoffklasse eine präbiotisch relevante Synthesemethode gefunden hatte, glaubte man zeitweise, alle wichtigen Bausteine von Biomolekülen durch primitive Reaktionen aus einfachen Precursor-Molekülen erzeugen zu können. Dies änderte sich jedoch, als sich herausstellte, dass die Uratmosphäre wahrscheinlich nicht die angenommenen reduzierenden Eigenschaften hatte, sondern vielmehr aus Wasser, Stickstoff und Kohlendioxid bestand. Wieder war es Miller, der in den 80er Jahren zeigen konnte, dass praktisch keine Aminosäuren nachgewiesen werden konnten, wenn man im Experiment die stark reduzierende Atmosphäre durch eine redox-neutrale oder nur schwach reduzierende Gasmischung ersetzte. [7, 8] Auch die Bildung von Formaldehyd und Blausäure fand unter diesen Bedingungen nicht statt, sodass wieder offen ist, welche frühzeitliche Chemie die Selbstkonstituierung von Biomolekülen ermöglichte. Weitere ypothesen, die die Entstehung von Kohlenstoffverbindungen niedriger xidationsstufe erklären könnten sind die primordiale Überführung von Wasserdampf, Kohlendioxid und Stickstoff in Ammoniak, Carbonsäuren, Aldehyde und Blausäure [9] durch die Reduktion etwa auf Pyrit-berflächen. [10] Auch eine Zufuhr organischer Verbindungen über Meteoriten aus dem All wurde diskutiert. [11] Ungeachtet der verschiedenen Theorien zur Entstehung präbiotischer Substanzen dienten diese Verbindungen als Bausteine für die ersten lebensfähigen Systeme, welche primitive Vorläufer des komplexen Replikaktionsapparates heutiger Lebensformen waren.

9 Einleitung Die RA-Welt ach einer modernen Definition wird Leben als ein sich selbst erhaltendes chemisches System betrachtet, welches in der Lage ist Darwinsche Evolution einzugehen. ierzu muss das System über folgende Grundeigenschaften verfügen, die erstmals von parin formuliert wurden: [12] - Metabolismus - Selbstreplikation - Mutabilität eben den Fähigkeiten des Systems, in einem Stoffwechsel Energie und Materie aus der Umwelt zu beziehen und sich selbst durch Mutation weiterzuentwickeln, kommt vor allem der Selbstreplikation in der Forschung eine besondere Bedeutung zu. Unter Selbstreplikation versteht man eine Form der Autokatalyse, die mit einem Informationstransfer verbunden ist. Selbstreplikation = Autokatalyse + Informationstransfer Dies bedeutet, dass das gebildete Produkt nicht nur die eigene Synthese katalysiert, sondern gleichzeitig auch Informationen über seine chemische Struktur an die nächste Generation weitergibt. Entscheidend für eine Evolution des Systems ist eine gewisse Fehlerquote bei der Replikation, die zu einer Veränderung der transferierten Informationen führt und eine Verbesserung des bestehenden Systems erlaubt. Die Verdrängung der ursprünglichen Population entspräche einer Selektion im Darwinschen Sinne. Ein grundlegender Prozess aller heute lebenden rganismen ist die Proteinbiosynthese, also der ribosomale Translationsprozess einer ucleotidsequenz (als Informationsträger) in eine Peptidsequenz (als Funktionsmolekül). Die bei der Proteinbiosynthese gebildeten Enzyme steuern auf der anderen Seite aber auch die DA-Synthese. Aufgrund der großen Komplexität dieser DA-RA-Protein-Welt gilt es als extrem unwahrscheinlich, dass sich ein derartiges System spontan entwickelt hat. Man geht vielmehr davon aus, dass evolvierende Systeme nur aus einer Verbindungsklasse aufgebaut waren; dabei spricht vieles für eine homomolekulare RA-Welt.

10 Einleitung 4 Die Entdeckung von Ribonucleinsäuren mit enzymatischer Aktivität durch Cech und Altmann führte zu einer Theorie der RA-Welt, der zufolge die RA früher die Funktion der DA als Informationsspeicher und gleichzeitig die heutige Funktion der Proteine als Enzym erfüllte. [13-15] Es gibt zahlreiche weitere Indizien dafür, dass die RA bereits deutlich vor der DA existiert hat: [16] - Desoxribonucleotide werden durch enzymatische Reduktion von Ribonucleotiden erzeugt. - Thymidin wird durch 5-Methylierung von Uridin erzeugt. - Coenzyme wie AD +, FAD oder der Energieträger ATP leiten sich von Ribonucleotiden ab. - RA kann katalytisch wirken und als Templat fungieren. Trotz zahlreicher inweise für eine homomolekulare RA-Welt darf jedoch bezweifelt werden, dass das Leben auf der Erde tatsächlich mit der RA begann. Es ist bis heute nicht geklärt, wie sich die ucleinsäuren auf der frühen Erde in signifikanten Mengen gebildet haben sollen und auch die generelle Frage nach dem Ursprung der Chiralität ist bisher ungelöst. Durch die Weiterentwicklung der in-vitro-evolution lassen sich mittlerweile RA-Moleküle mit verschiedensten Eigenschaften erzeugen. Im Jahr 2002 gelang Joyce schließlich ein großer Schritt hin zur experimentellen Rekonstruktion der RA-Welt. [17] Das vorgestellte selbstreplizierende System basiert auf einem RA-Templat T, welches als Ribozym wirkt und seine eigene Synthese katalysiert. ierbei ist das RA-Fragment B durch ein Triphosphat am 5 -Ende für die Reaktion mit der 3 -ydroxy-funktion von A aktiviert. So entsteht eine exakte Kopie von T. Eine diskontinuierliche Interaktion mit dem Templat führt hier zu einer schnellen Freisetzung des Produkts. Dies führt zu einer Kinetik erster rdnung. Inhibierend wirken bei diesem System jedoch intramolekulare Wechselwirkungen im Templat und die Bildung von Eduktdimeren, sodass autokatalytisches Wachstum hier nicht beobachtet werden konnte.

11 Einleitung 5 Abbildung 1.1: Sekundärstruktur eines selbstreplizierenden Ligase-Ribozyms nach Joyce [17] Trotz großer Fortschritte hin zur RA-Welt gilt die spontane Entstehung schon relativ einfacher Ribozyme als sehr unwahrscheinlich. Bei der Entstehung des Lebens müssen zuvor bereits andere Replikationsmechanismen auf einer niederen rganisationsstufe eine Rolle gespielt haben. In diesem Zusammenhang wurden nichtenzymatische Transkriptions- und Replikationsmodelle auf der Basis von kurzen ucleinsäuresequenzen untersucht. Und auch selbstreplizierende Peptide und synthetische Replikatoren können im Zusammenhang mit dem Ursprung des Lebens weitere Einblicke in die chemische Evolution liefern. 1.3 ichtenzymatische, matrizengesteuerte Reaktionen Da das heutige Leben auf der enzymkatalysierten Replikation von ucleinsäuren basiert, wurde diese Substanzklasse auch in den ersten Replikationsexperimenten untersucht. Im Jahre 1966 wurde von aylor und Gilham die erste nichtenzymatische templatgesteuerte Reaktion beschrieben bei der zwei Moleküle exathymidylsäure-5 -phosphat an der komplementären Matrize Polyadenylsäure kondensiert wurden. Die Aktivierung der Phosphatgruppen erfolgte durch das wasserlösliche Carbodiimid EDC. [18]

12 Einleitung 6 Umfangreiche Untersuchungen zur matrizengesteuerten Polymerisation von Mononucleotiden wurden seit 1968 im Arbeitskreis von rgel durchgeführt. Als aktivierte monomere Bausteine dienten hier hauptsächlich Ribonucleosid-5 - phosphoimidazolide. [19] Es stellte sich heraus, dass die Regiochemie (2-5 oder 3-5 -Verknüpfung) durch zweiwertige Metallionen [20, 21] und durch Substituenten am aktivierenden Imidazol [22] umgekehrt werden kann. Dies zeigt, dass schon kleine Änderungen des Systems einen großen Einfluss auf die Konformation der Komplexe in matrizengesteuerten Reaktionen haben kann. EDC P R P R - P 2 Base Abbildung 1.2: Aktivierung durch EDC 1 oder Phosphoimidazolid 2 rgel konnte außerdem zeigen, dass nur dann eine effiziente templatgesteuerte Kondensation stattfindet, wenn die Matrize reich an Pyrimidinbasen ist. Matrizen mit Purin- und Pyrimidinbasen verlieren mit steigendem Anteil an Purinbasen an Wirkung. [23] Bei der ersten nichtenzymatischen Polymerisationsreaktion mit einem sequenziellen Informationstransfer, die rgel 1984 vorstellte, zeigte sich erneut, dass ein purinreiches Produkt sich seinerseits nicht als Matrix eignet. [24] Ein Gemisch der 2-Methyl-substituierten Phosphoimidazolide des Cytidins und Guanosins konnten an der Matrize CCGCC oligomerisiert werden. ierbei entstand das komplementäre ligonucleotid, das in Abwesenheit der Matrize nicht nachgewiesen werden konnte. Man beobachtete jedoch keine echte Selbstreplikation, da das entstandene ligonucleotid aufgrund des hohen Puringehalts nicht als Matrize wirkt.

13 Einleitung Selbstreplizierende ligonucleotide Das erste selbstreplizierende Minimalsystem (Abb. 1.3) wurde 1986 von von Kiedrowski vorgestellt. [25] Basierend auf den Ergebnissen von aylor, Gilham und rgel wurde ein selbstkomplementäres hexameres DA-System konzipiert, bei dem das Produkt durch Aktivierung mit EDC aus zwei Trimeren gebildet wird. Mit diesem System vermeidet man zum einen durch Verwendung von DA unnatürliche 2-5 -Verknüpfungen und erreicht zum anderen eine höhere Komplexstabilität als bei Monomeren. Durch die Selbstkomplementarität wird Selbstreplikation möglich, da nun Templat und Ligationsprodukt identisch sind. Der gleich hohe Anteil an Purinen und Pyrimidinen im Templat sorgt für einen genügend großen Templateffekt. - 3 P - 2 P - 2 P - 4 P P Cl - EDC 2 P P - 2 P - P - 2 P 2 5 Cl 2 2 Abbildung 1.3: Selbstreplizierendes Minimalsystem nach von Kiedrowski [25]

14 Einleitung 8 Um die Analytik des Systems einfach zu halten, wurden an den flankierenden Enden der Trimere Schutzgruppen eingeführt. Somit wurden komplexere Reaktionswege vermieden. Die Kondensation erfolgte zwischen einem aktivierten 3 -Phosphat und einer 5 -ydroxylgruppe. Als ebenprodukt entstand bei der Reaktion auch immer das 3-3 -verknüpfte Pyrophosphat des CCGp Bausteins. Die kinetischen Untersuchungen der Kondensationsprozesse per PLC zeigten, dass die Produktbildung durch initiale Templatzugabe erhöht wird und andererseits die Bildung des Pyrophosphat-ebenproduktes verringert wird. Die Produktbildung erfolgt also autokatalytisch. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist jedoch nicht der Templatkonzentration direkt, sondern deren Quadratwurzel proportional. Dieser Zusammenhang zwischen der Anfangsreaktionsgeschwindigkeit v c, mit der das Produkt gebildet wird, und der Anfangskonzentration der Matrize c ist in der Literatur als Quadratwurzelgesetz der Autokatalyse bekannt. vc dc = = α c + β dt Gleichung 1: Quadratwurzelgesetz der Autokatalyse Trägt man die gemessenen Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten v c gegen die Quadratwurzeln der vorgelegten Anfangskonzentrationen c der Matrize auf, so erhält man eine Gerade mit der Steigung α und dem rdinatenabschnitt β. Die Steigung α ist dabei ein Maß für die Autokatalyse, während der rdinatenabschnitt β die Geschwindigkeit der Matrizensynthese bei Abwesenheit jeglicher Matrizenmoleküle (c = 0) widerspiegelt. Die Existenz eines rdinatenabschnittes bei dieser Auftragung impliziert, dass die Matrize nicht nur autokatalytisch, sondern auch spontan erzeugt wird. Die gefundenen Gesetzmäßigkeiten konnten 1987 von Zielinsky und rgel an einem tetrameren Ribonucleotidsystem (Abb. 1.4) bestätigt werden. [26]

15 Einleitung P P P 3 EDC P P 2 - P 3 8 Abbildung 1.4: Selbstreplizierendes System nach Zielinski und rgel [26] Die Ligation eines 5 -Phosphat-Dimers 7 mit einem 3 -Amino-Dimer 6 in Gegenwart eines tetrameren Templats 8 folgte dem Quadratwurzelgesetz und ist das erste Beispiel für Replikation von ucleinsäurederivaten mit modifiziertem Rückgrat. Die höhere Reaktivität der Aminofunktion vermeidet nicht nur die Bildung eines 2-5 -verknüpften Produktes, sondern favorisiert auch die Produktbildung des aktivierten Phosphates gegenüber der unerwünschten ydrolyse zeigte Shabarova, welchen Einfluss die reagierenden Funktionalitäten auf die Kinetik der EDC-vermittelten Ligation haben. [27] Es wurde ein 5 -modifiziertes Undecamer mit einem 3 -modifizierten examer an einer tetradecameren Matrize ligiert; dabei wurden je nach Verknüpfungschemie die folgenden relativen Geschwindigkeitskonstanten gefunden: Tabelle 1: Einfluss von Funktionalitäten auf die Reaktivität [28] 3 -Terminus 5 -Terminus rel. Reaktivität P P P P P P

16 Einleitung 10 Auf der Grundlage dieser kinetischen Daten wurden in der Arbeitsgruppe von Kiedrowski Variationen am Replikationssystem durchgeführt, die bei Ligation zur Bildung von Pyrophosphaten und Phosphoramidaten führten. [29] ierdurch erreichte man nicht nur eine erhebliche Reaktionsbeschleunigung im Vergleich zum rginalsystem, die Unterscheidbarkeit des initialen Templats vom Produkt bei der PLC-Analytik verbesserte auch die Reproduzierbarkeit der kinetischen Untersuchungen. In den folgenden Jahren wurden weitere Systeme selbstreplizierender ligonucleotide untersucht, die eine EDC vermittelte Ligation zur Phosphoramidatbindung nutzten beschrieben Sievers und Kiedrowski ein nach dem Vorbild der atur gestaltetes kreuzkatalytisches minimales Replikationssystem. Es konnte gezeigt werden, dass bei einem komplementären System die Replikation von ligonucleotiden an purinreichen Matrizen ähnlich effektiv verläuft wie im selbstkomplementären System. [30] Des weiteren wurde von Wlotzka et al. gezeigt, dass die Art der ucleobasen, die unmittelbar die Ligationsstelle flankieren, einen deutlichen Einfluss auf das Reaktionsverhalten des Systems hat. Dies resultiert aus den hydrophoben Wechselwirkungen der planar aufeinanderliegenden Basenpaare, die zu einer Stabilisierung des Übergangszustandes bei der Ligation beitragen. [31] Abbildung 1.5: Kreuzkatalytisches Minimalsystem (schematisch) Alle diese Experimente zur Selbstreplikation von ligonucleotiden waren bisher durch RP-PLC analysiert worden. Dieses Verfahren hat einige achteile, da die Dauer der PLC- Elutionsprogramme die Zahl der Messpunkte limitiert und die Probenvorbereitung einige experimentelle Fehlerquellen beinhaltet. Als Alternative hierzu stellten Schöneborn, Bülle und von Kiedrowski 2001 ein Verfahren vor, welches die Verfolgung der ligonucleotidreplikation über Fluoreszenz-Resonanz-Energie- Transfer (FRET) erlaubte. Das bisherige hexamere Replikationssystem wurde hierbei zu

17 Einleitung 11 einem octameren, einem decameren und einem dodecameren System erweitert. Die Kernsequenz d(ccgcgg) blieb dabei erhalten und wurde endständig um jeweils eine Base mit T bzw. A erweitert. [32] Die FRET-Analytik basiert auf dem strahlungslosen Energietransfer eines Fluoreszenz-Donors auf einen Akzeptor. Die zugrundeliegenden Theorien des Phänomens gehen auf Förster zurück. [33] Die Effizienz E des strahlungslosen Energie-Transfers ist dabei vom Abstand R der beiden Chromophoren abhängig. Förster [33] konnte hierfür folgenden Zusammenhang formulieren: 1 E = R 1+ R Gleichung 1: Förster-Gleichung R 0 ist hierbei eine für das Donor-Akzeptor-Paar charakteristische Konstante. Bei einem der Konstante R 0 entsprechenden Abstand der Chromophoren liegt die Effizienz des Transfers bei 50%. Typische Werte für R 0 liegen zwischen 10 und 70Å. In dem beschriebenen System wurden die strukturell verwandten Cyaninfarbstoffe Cy3 und Cy5 verwendet, die einen möglichst gleichmäßigen Einfluss der Farbstoffe auf die Komplexbildung aller Spezies gewährleisten sollten. Das Farbstoff-Labeling wurde als Phosphoramidit am 5 -Ende eines Eduktbausteins und des Templats eingeführt. + + Cy3 Cy5 Abbildung 1.6: Die Fluoreszenzfarbstoffe Cy3 und Cy5 Durch die Strategie des Cyanin-Labelings wurde ein Fluoreszenz-Quenching durch benachbarte Farbstoffe verhindert. Lediglich der Produktduplex C 2 liefert einen relevanten Beitrag zum FRET- Signal, da der termolekulare Komplex ABC nur sehr gering populiert ist.

18 Einleitung 12 Abbildung 1.7: Schematische Darstellung eines FRET-Replikationssystems eben dem gezeigten heteromolekularen Duplex C 2 existieren auch noch die entsprechenden homomolekularen Komplexe die nur das Donor- oder Akzeptor-Labeling tragen und keinen Beitrag zum FRET leisten. Bei fortlaufender Reaktion verschiebt sich das Gleichgewicht zwischen den Komplexen und wirkt sich so auch auf das FRET-Signal aus. Mit der Aufnahme von Kalibrierkurven war es aber möglich, vom Fluoreszenz-Signal auf die Produktkonzentration zu schließen. Die Fluoreszenzmarkierung ermöglicht damit eine direkte online -Visualisierung der Reaktion und erlaubt es, die Zahl der Datenpunkte gegenüber PLC-Kinetiken beliebig zu erweitern. Die FRET-Messmethode vereinfacht die Analyse von Replikationssystemen erheblich, und ist nicht nur auf ligonucleotidreplikatoren beschränkt, sondern auch auf andere selbstreplizierende Systeme anwendbar.

19 Einleitung Parabolische und exponentielle Replikation Die meisten der bisher vorgestellten Replikatoren folgen dem Quadratwurzelgesetz und zeigen demnach ein sogenanntes parabolisches Wachstum. Szathmary hatte 1989 theoretisch gezeigt, dass eine Evolution im Darwinschen Sinne unter diesen Bedingungen nicht eintreten kann. [34] Der Übergang vom parabolischen zum exponentiellen Wachstum ist aufgrund dieser Erkenntnis zu einem der wichtigsten Ziele der Replikationsforschung geworden. Es existieren bereits synthetische Replikatoren und Peptidreplikatoren, die diesem Ziel recht nah kommen, bei der ligonucleotidreplikation kam man bisher über ein parabolisches Wachstum nicht hinaus. intergründe, Ursachen und mögliche Lösungen werden im Folgenden kurz diskutiert Prinzipien des selbstreplizierenden Minimalsystems Im einfachsten Fall eines selbstreplizierenden Systems reagieren zwei Eduktbausteine A und B zu einem Produkt C, das als Templat für seine eigene Bildung dient. Durch Assoziation zu einem termolekularen Komplex ABC kommen die reaktiven Gruppen der Edukte A und B in räumliche ähe (Templateffekt), wodurch die autokatalytische Wirkung entsteht. Abbildung 1.8: Schema eines minimalen selbstreplizierenden Systems Die irreversible kovalente Verknüpfung (Ligation) führt erst zum Duplex C 2, dessen reversible Dissoziation die Templatbausteine für neue Katalysezyklen freisetzt (Abb. 1.8). eben diesem autokatalytischen Reaktionskanal beobachtet man normalerweise auch einen nicht-autokatalytischen Kanal, in dem A und B spontan zu C reagieren.

20 Einleitung 14 Im Bezug auf ihr Wachstumsverhalten lassen sich synthetische Replikatoren in drei experimentell relevante auptkategorien unterteilen: linear, parabolisch und exponentiell. Geht man davon aus, dass sich die Zahl der zur Verfügung stehenden Templatmoleküle mit jedem Replikationszyklus verdoppelt, so betrachtet ma n ein exponentielles Wachstum. Dieses wird jedoch tatsächlich nicht beobachtet, da ein Teil der Templatmoleküle als Duplex vorliegt und dadurch keine Matrizenwirkung zeigt. Diese Produktinhibition führt in der Regel zu einem parabolischen Wachstum, das dem schon zuvor an einigen Beispielen erläuterten Quadratwurzelgesetz entspricht. Der Zusammenhang zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und der Anfangskonzentration des Templats lässt sich vereinfacht folgendermaßen darstellen: [3 5] dc dt p = α c + β Gleichung 2 β beschreibt hier die Geschwindigkeit des nicht-autokatalytischen Kanals, αc p den autokatalytischen Kanal. Der Faktor p entspricht der autokatalytischen Reaktionsordnung, welche die Qualität des autokatalytischen Wachstums festlegt. Für den autokatalytischen Kanal ergibt sich: a) p = 0 => lineares Wachstum, b) p = 0,5 => parabolisches Wachstum (Quadratwurzelfall), c) p = 1 => exponentielles Wachstum. Stehen zwei oder mehr Templatbausteine in direkter Konkurrenz um Eduktmoleküle zueinander, so sind zwei Szenarien denkbar: 1) Selektion: Der effizienteste Replikator verdrängt die Konkurrenten vollständig (survival of the fittest). 2) Koexistenz: Der effizienteste Replikator erreicht höhere Konzentrationen, ist aber nicht in der Lage, die Konkurrenten zu verdrängen (survival of everybody). Exponentielles Wachstum führt in solchen Konkurrenzexperimenten zur Selektion, während lineares Wachstum zur Koexistenz führt. [36] ach theoretischen Ergebnissen von Szathmary

21 Einleitung 15 führt parabolisches Wachstum ebenfalls zur Koexistenz. [34] Eine molekulare Evolution im Darwinschen Sinne ist demnach nur bei einem exponentiell wachsenden Replikator möglich. 1.6 Selbstreplizierende Minimalsysteme Die Selbstreplikation von chemischen Minimalsystemen wurde unter Verwendung von ligonucleotidsequenzen in Anlehnung an natürliche Replikationsvorgänge gezeigt. [25] Eine enzymfreie Replikation, die auch in präbiotischen Systemen stattgefunden haben muss, führte zu einem parabolischen Wachstum der Produktmoleküle. Daneben wurde das Prinzip der Selbstreplikation auch auf andere Biomoleküle und artifizielle Systeme übertragen. Bei einigen Systemen konnte hierbei eine Steigerung der Autokatalyse über das parabolische Wachstum (p > 0,5) hinaus erzielt werden Selbstreplizierende Peptide Ein erstes selbstreplizierendes Peptid wurde 1996 von Ghadiri vorgestellt. [37] Abgeleitet von der GC4-Sequenz ließ man ein 15-mer un d ein 17-mer enzymfrei an einem 32-mer reagieren. Bei dem als Leucine-Zipper bekannten Strukturmotiv dieses Systems bilden die Peptidstränge α-elices aus, die sich durch eine wiederholte Abfolge einer heptaden Aminosäuresequenz (abcdefg) n auszeichnen. Die Assoziation der elices zu einem Duplex, der auch als coiled coil bezeichnet wird, erfolgt durch ein reißverschlussartiges Ineinandergreifen der hydrophoben Seitenketten in Position a und d. Eine zusätzliche Stabilisierung wird durch elektrostatische Wechselwirkungen der Positionen e und g erreicht.

22 Einleitung 16 Abbildung 1.9: elixrad Darstellung selbstreplizierender Peptide; Duplex entsteht durch Wechselwirkung der hydrophoben Seitenketten an a und d. Die Verknüpfung der Peptideinheiten durch die sogenannte native Ligation nach Kent[38] führt zu einer Amidbindung. Es wird zunächst ein aktivierter Thioester am C-Terminus des einen Peptidfragments 9 von einem Cysteinrest am -Terminus des anderen Peptidfragments 10 angegriffen. Anschließend erfolgt eine intramolekulare S,-Acylverschiebung vom intermediär gebildeten Thioester 11 zum kondensierten Peptid R R -BzS S R S R 10 R 2 S R R S R R 12 Abbildung 1.10: Peptidligation nach Kent[38] Diese Ligationsmethode wurde aufgrund ihrer hohen Selektivität und der nativen Verknüpfung auch bei den anderen Replikationsuntersuchungen an Peptiden verwendet. Auch dieser Replikator zeigte aufgrund von Produktinhibition ein parabolisches Wachstum (p = 0.5). Durch Erhöhung der Anfangskonzentration konnte aber der Wert für die autokatalytische Reaktionsordnung auf p = 0.63 erhöht werden. Dieses Ergebnis wurde mit

23 Einleitung 17 einem tetramolekularen Komplex erklärt, der aus den Eduktbausteinen und zwei Matrizen besteht. Die Abhängigkeit der Reaktionsordnung p von der Zahl der am Komplex beteiligten Templatmoleküle n lässt sich ausdrücken mit: [39] n 1 p = n Gleichung 3 Exponentielles Wachstum mit p = 1 wäre nach diesen Überlegungen erst mit einer unendlichen Zahl von Templatmolekülen n zu erreichen. Es folgten zahlreiche weitere selbstreplizierende Peptide, die auf der Ausbildung von coiled coils und der Kent Ligation beruhten. [40, 41] So wurden von Chmielewski Systeme vorgestellt bei denen die Selbstreplikation von bestimmten Reaktionsbedingungen (p-wert, acl 4 -Konzentration) abhängig gemacht wurde. In anderen Systemen wurde über Kreuzkatalyse oder über chiroselektive Peptidreplikation berichtet. [42-45] Bei zwei Systemen wurde ein nahezu exponentielles Wachstum mit der Reaktionsordnung p = 0.91 nachgewiesen. Ursächlich hierfür war in einem Fall die Destabilisierung des Templatdimers durch Minimierung der Sequenz auf 26 Aminosäuren. Dieses System ist zur Ausbildung von coiled coils fähig, die geringe Stabilität führt aber zu einer effektiven Unterdrückung der Produktinhibition. [46] Im anderen Fall wurde eine Störung der Sekundärstruktur nach Einführung von L-Prolin in eine 35mer Sequenz erreicht. Der aus dem Austausch einer Aminosäure resultierende Knick von etwa 30 in der elixstruktur beeinträchtigt die Wechselwirkungen der hydrophilen Seitenketten. [47] Beide Systeme zeigen eine außergewöhnlich hohe autokatalytische Effizienz ε Synthetische Replikatoren Eine logische Fortsetzung der Suche nach einem minimalen Replikator führt nach der Verwendung von RA, DA und Peptiden zwangsläufig auch zu artifiziellen Systemen, die sich strukturell stark von bestehenden Biomolekülen unterscheiden. Das erste System dieser Art wurde 1990 von Rebek beschrieben. [48] Es enthielt als Erkennungsmotiv auf der einen Seite ein Derivat des Adenosins und auf der anderen eine entsprechende künstliche Erkennungseinheit für Adenin. Die Verknüpfung erfolgte über eine Amidbindung und das Reaktionsprodukt war selbstkomplementär. Das System gehorchte auch dem Quadratwurzelgesetz.

24 Einleitung 18 C F Abbildung 1.11: Selbstreplizierendes System nach Rebek [48] Das erste vollsynthetische Replikationssystem wurde 1992 durch Terfort und von Kiedrowski beschrieben. [49] Die Assoziation der Bausteine erfolgte über Salzbrücken zwischen einer Amidiniumfunktion und einem Carboxylatrest. Als Ligationsreaktion wurde die Ausbildung eines Azomethins verwendet. Es entstand ein konjugierter und damit planarer Templatbaustein. R1 2 R2 R1 R R1= C 3, C(C 3 ) 2 R2=, 2 R2 R2 R1 Abbildung 1.12: Selbstreplizierendes System nach Terfort und von Kiedrowski [49] R1 Die Kinetik der autokatalytischen Synthese gehorcht auch hier dem Quadratwurzelgesetz. Eine Modifikation des Templats an den Seitenketten der Aromaten bewirkte eine Geschwindigkeitssteigerung und man beobachtete eine lineare Abhängigkeit der

25 Einleitung 19 Produktbildung von der Templatzugabe. ier ist jedoch keine Selbstreplikation mehr gegeben, da das Reaktionsprodukt mit dem Templat nicht mehr identisch ist. Bei jüngeren artifiziellen Replikationssystemen konnte die autokatalytische Reaktionsordnung noch weiter in die ähe eines exponentielle Wachstum gerückt werden. Erreicht wurde dies bei den Systemen von Sutherland [50] und von Kindermann. [51] Die Ligation verlief in beiden Fällen über eine Diels-Alder-Reaktion zwischen einem Cyclohexadien und einem Maleinimid. Die autokatalytische Reaktionsordnung lag mit p = 0.8 bei Sutherland und p = 0.89 bei Kindermann und damit weit oberhalb eines parabolischen Wachstums (p= 0.5). Abbildung 1.13: Diels-Alder-Replikator nach Kindermann [51] Es wird vermutet, dass der Templatduplex aufgrund sterischer inderung schlechter für eine Assoziation geeignet ist als der termolekulare Komplex. Die hierdurch verminderte Produktinhibition könnte die ungewöhnlich hohe Reaktionsordnung erklären. Voraussetzung für eine Selektion nach Darwin (survival of the fittest) ist das exponentielle Wachstum von konkurrierenden selbstreplizierenden Bausteinen. Die meisten bisherigen Replikatoren zeigen jedoch ein, durch Produktinhibition bedingtes, parabolisches Wachstum. Insbesondere in der ligonucleotid-replikation konnte hier bisher keine Steigerung der Reaktionsordnung in kontinuierlichen Replikatoren erzielt werden.

26 Einleitung Wege zur Realisierung exponentieller Replikatoren Der auptgrund für das bei den meisten Replikatoren beobachtete parabolische Wachstum liegt in der Produktinhibition. Die Komplexbildungskonstante für den Templatduplex C 2 (K 2 ) liegt normalerweise ein bis zwei Größenordnungen über der des termolekularen Komplexes ABC (K 1 ). K 1 K 2 A + B + C ABC C 2 2 C Ein System mit K1 > K 2 würde ein exponentielles Wachstum ermöglichen. Es gibt eine Reihe von Ansätzen, um die Produktinhibition zu verringern und eine Reaktionsordnung von p > 0.5 zu erreichen. Dies wurde bei verschiedenen Peptidreplikatoren und synthetischen Replikatoren durch ein entsprechendes Design erreicht. Bei Peptiden kommt die Erhöhung der Reaktionsordnung p zum Beispiel durch die Bildung höhermolekularer Komplexe zustande, bei den synthetischen Systemen durch die schwächere Assoziation des Duplexes gegenüber dem termolekularen Komplex. Mit dem SPREAD-Verfahren (Surface Promoted Replication and Exponential Amplification of DA-Analogues) stellten Luther und von Kiedrowski 1998 erstmals eine nichtenzymatische exponentielle Replikation von ligonucleotiden vor. [52] Es wurden komplementäre Templat- jeweils auf einer Festphase immobilisiert und mit komplementären ligonucleotid- moleküle Fragme nten hybridisiert. Durch nachfolgende EDC-vermittelte Ligation wurden die entsprechenden Kopien erhalten. Die Immobilisierung der Templatmoleküle und der Kopien erfolgte als Disulfidbrücke über eine 5 -Thiolmodifikation an Thiosepharosefestphase. Durch eine schrittweise Reaktionsführung auf der Festphase wurde hier eine räumliche Trennung von Templat und Produkt erreicht und dadurch das Problem der Produktinhibition umgangen. Die Replikation zeigt hier ein exponentielles Wachstumsverhalten, verläuft jedoch nicht mehr als autonomer Prozess, da der Experimentator eingreifen muss. Um bei einer autonomen ligonucleotid-replikation eine Erhöhung der Reaktionsordnung zu erreichen, muss der termolekulare Komplex ABC gegenüber dem Templatduplex C 2 stabilisiert werden. Es gibt mehrere Ansätze, dies zu erreichen:

27 Einleitung 21 1) eue Ligationschemie: Bei synthetischen Replikatoren wurde schon gezeigt, dass durch ein geeignetes Design der Verknüpfungs- und Erkennungsmotive eine Stabilisierung des termolekularen Komplexes gegenüber dem Templatduplex erreicht werden kann. Ähnliches sollte prinzipiell auch bei ligonucleotiden durch entsprechende Modifikationen des Rückgrats möglich sein. 2) Minimale Replikase: Ein DA-bindendes Molekül, z.b. ein Peptid, Polyamin oder ligonucleotid, wirkt als kovalenter Katalysator auf den Ligationsschritt der Replikation. Die Replikase ist kovalent an ein Edukt gebunden, stabilisiert den termolekularen Komplex und fungiert nach Ligation als Abgangsgruppe. 3) Replikation an berflächen: Ähnlich der minimalen Replikase wird bei diesem Konzept eine Stabilisierung des termolekularen Komplexes und auch die Aktivierung durch Anbindung an eine berfläche erreicht. Diese Replikation an einer Feststoffoberfläche ließe sich mit einer Chromatographie koppeln, was laut Computersimulationen von von Kiedrowski und Szathmary zu einer Selektion auf berflächen führen kann. [53] Alle diese Ansätze, die Effektivität der ligonucleotidreplikatoren zu steigern, ließen sich aber auch untereinander kombinieren, um so ein möglichst effektives System zu erhalten. 1.8 Ligation von ligonucleotid-analoga Als man bei den ersten Experimenten zur templatgesteuerten enzymfreien ligonucleotidsynthese versuchte, die native Phosphodiester-Verknüpfung zu kopieren, zeigten die Systeme nur eine geringe Kopplungseffizienz. [25] Erst durch die Einführung einer Phosphoramidatbindung konnte die Effizienz der Ligation soweit gesteigert werden, dass umfangreiche kinetische Untersuchungen möglich wurden. Die entstandenen ligonucleotid- Analoga zeigten hier die gleiche Matrizenwirkung wie das ursprüngliche Templat. Die Effizienzsteigerung des autokatalytischen Systems erlaubte in der Folgezeit nicht nur die Beobachtung einer sigmoiden Produktbildungskurve. In komplexeren Systemen konnte auch das Konkurrenzverhalten und die Kreuzkatalyse von ligonucleotiden untersucht werden. Seitdem wurde eine Vielzahl von DA-Analoga mit unterschiedlichen Modifikationen publiziert. [54] Einige Beispiele sind in Abbildung 1.14 dargestellt.

28 Einleitung 22 So unterschiedlich die Verknüpfungsstrategien in den einzelnen Systemen auch sind, allen Systemen gemeinsam ist die strukturelle Ähnlichkeit zum natürlichen Phosphat-Rückgrat, um eine effiziente templatgesteuerte Ligation zu erreichen. Eine Steigerung der autokatalytischen Reaktionsordnung p durch derartige Modifikationen konnte in selbstreplizierenden ligonucleotid-systemen bisher jedoch nicht beobachtet werden. Base Base Base Base LG P Base P Base P LG 2 Base P Base (L. rgel) LG = Abgangsgruppe (G. v. Kiedrowski) Base Base Base Base P X Y Base P X Base P S RS Base P S S Base X = S, Se Y = Ts, I (R. Letsinger, E. Kool) R = PyS, (. Dolinnaya) Base Base Base Base 2 Base Base R 2 Base Base (D. Lynn) (P. ielson, L. rgel) Base Base R S Base R S (G. Joyce, S. Kent) Base (K. Fujimoto) Abbildung 1.14: Repräsentative templatgesteuerte Reaktionen von ligonucleotidderivaten [25, 26,54-60]

29 Einleitung Minimale Replikase Das Konzept der minimalen Replikase stellt einen weiteren Lösungsansatz zur Steigerung des parabolische Wachstums in der ligonucleotidreplikation dar. Ausgehend von einem nichtenzymatischen Replikationssystem auf Basis von ligonucleotiden wird durch die Einführung eines kovalent gebundenen DA-bindenden Moleküls eine Stabilisierung des termolekularen Komplexes ABC gegenüber dem Templatduplex C 2 erreicht (Abb. 1.15). Dies führt unter geeigneten Reaktionsbedingungen zu einer gesteigerten Population an termolekularem Komplex und dadurch zu einer höheren Reaktionsordnung. Abbildung 1.15: Reaktionsschema eines Replikationssystems unter Einfluss einer minimalen Replikase Der Funktion eines Enzyms entsprechend stabilisiert die minimale Replikase nicht nur den Eduktkomplex, sondern aktiviert auch den Eduktbaustein A, an den sie kovalent gebunden ist, für die Ligation. ach der Verknüpfung verlässt die Replikase das System als Abgangsgruppe, sodass eine relative Destabilisierung des Templatduplexes C 2 gegenüber dem termolekularen Komplex ABC erreicht wird. Im Idealfall wäre die Replikase so gestaltet, dass eine Freisetzung nach der Ligation durch eine Destabilisierung bei struktureller Veränderung oder Ladungsänderung erzwungen würde. Auch sollte die freigesetzte Replikase durch

30 Einleitung 24 Bildung neuer Konjugate A wieder in den Replikationszyklus eingreifen und dadurch auch nur in katalytischen Mengen einzusetzen sein. Die Gestalt einer minimalen Replikase ist a priori nicht festgelegt. Es eignen sich prinzipiell alle DA-bindenden Stoffklassen. Auch mit einer entsprechend modifizierten berfläche kann die katalytische Wirkung prinzipiell erzielt werden. Schon in den achtziger Jahren gab es Bemühungen, die Selbstreplikation von ligonucleotiden durch den Einfluss von minimalen Katalysatoren zu beschleunigen. Dörwald und von Kiedrowski synthetisierten analog der Struktur des EDC Carbodiimide mit einem DA-stabilisierenden Polyamin-Strukturmotiv, welche zur Aktivierung der Phosphatgruppen und zur gleichzeitigen Stabilisierung des termolekularen Komplexes dienen sollten. Es konnte jedoch keine Ligation sondern nur ydrolyse des Carbodiimids beobachtet werden. [61, 62] Auch die Arbeit von Burmeister, die zu einem cofaktorabhängigen Desoxyribozym mit ydrolase-aktivität führte, sollte ursprünglich dazu dienen, durch gerichtete molekulare Evolution von 5 -Amino-ligonucleotiden geeignete Sequenzen zu finden, die eine Ligation durch Phosphoryltransfer katalysieren. [63] Auch in der Arbeit von Azzawi wurde das Konzept der minimale Replikase mit einer Ligationsreaktion durch Phosphoryltransfer vom Phosphoramidat zum Pyrophosphat untersucht. [64] Als Abgangsgruppen wurden hier neben ligonucleotiden ebenfalls Peptide, Amine und Polyamine untersucht. Es wurde gezeigt, dass Konjugate von polykationischen Verbindungen mit ligonucleotiden den termolekularen Komplex bei niedrigen Salzkonzentrationen stabilisieren können. Geringe Reaktivität und ydrolyse der Phosphoramidatbindung ließen bei dem System keine weiteren kinetischen Untersuchungen bezüglich der Selbstreplikation zu. Für eine weitere Verfolgung des Konzepts liefern die bisherigen Untersuchungen keine Vorgaben bezüglich der Wahl der am besten geeigneten DA-stabilisierenden Stoffklasse oder bezüglich einer favorisierbaren Verknüpfungschemie. Größtmögliche strukturelle Variationen und die Verfolgung eines kombinatorischen Ansatzes wären am ehesten mit DA-bindenden Peptiden als Abgangsgruppen zu erreichen.

31 Einleitung ligonucleotidsynthese Zahlreiche Anwendungen in der biomedizinischen Forschung haben schon in der Vergangenheit für großes Interesse an der chemischen Synthese von Biomolekülen gesorgt. Die kontinuierliche Entwicklung verbesserter Synthesewege und Reagenzien hat vor allem die Synthese von ligonucleotiden und Peptiden zur Routine werden lassen. Das gängige Verfahren zur Festphasensynthese von ligonucleotiden, das Phosphoramiditverfahren, soll hier kurz beschrieben werden Phosphoramiditverfahren Das Phosphoramiditverfahren wurde von Caruthers eingeführt. [65] Es werden hierbei monomere ucleotidbausteine als 3 -Phosphoramidite sukzessive an einer Festphase miteinander verknüpft. Die Phosphoramidite erlauben aufgrund ihrer hohen Reaktivität quantitative Umsätze in sehr kurzer Zeit. Der Aufbau der Sequenz erfolgt vom 3 - zum 5 -Ende, wobei bei Standardsynthesen ein Leader-ucleosid über ein 3 -Succinat mit einer geeigneten Festphase (z. B. CPG) verknüpft ist. Die als 3 -Phosphoramidit eingebrachten ucleoside tragen an der 5 -ydroxylgruppe eine säurelabile Schutzgruppe und an den exocyclischen Aminofunktionen der Basen basenlabile Schutzgruppen. Der Aufbau eines ligonucleotids nach dem Phosphoramiditverfahren basiert auf einem sich für jeden monomeren Baustein wiederholenden Prozess. Dieser Synthesezyklus besteht aus vier grundsätzlichen Schritten: 1. Kopplung: Das Phosphoramidit wird durch Zugabe einer schwachen Säure, wie Dicyanoimidazol (DCI) oder 1--Tetrazol, aktiviert und an die 5 -ydroxygruppe des immobilisierten ucleosids gekoppelt. 2. Capping: Die nicht umgesetzten -Gruppen werden mit Essigsäureanhydrid acetyliert und somit für weitere Umsetzungen blockiert. ierdurch lassen sich unerwünschte ebenprodukte reduzieren. 3. xidation: Die xidation erfolgt mit wässriger Iodlösung und führt zum Phosphorsäuretriester. 4. Detritylierung: Die säurelabile Tritylschutzgruppe (MMT, DMT) wird mit einer Dichloressigsäurelösung entfernt.

32 Einleitung 26 DMT B' n+ DMT P C B' n+ B' n B' n P C 3 C C 3 DMAP 2,6-Lutidin 1--Tetrazol (C 3 C) Kopplung Capping DMT B' n+ B' n 3 C B' n P B' n C Detritylierung DMT B' n+ xidation Cl 3 C (C 2 4 Cl 2 ) 3 C B' n P C B' n I 2 / 2 Abbildung 1.16: Synthesezyklus beim Phosphoramiditverfahren [65] Die Freisetzung der fertigen Sequenz erfolgt standardmäßig durch anschließende Behandlung mit wässriger Ammoniaklösung. eben der Abspaltung von der Festphase werden die Basenschutzgruppen und die Cyanoethylgruppen am Phosphor abgespalten. Prinzipiell ist auch die Behandlung mit anderen Basen wie Lithiumhydroxid-Lösung, ydrazin, Ammoniakgas oder mit organischen Basen möglich. Grundsätzlich gibt es bei der ligonucleotidsynthese zur Einführung von Modifikationen zwei verschiedene Strategien. Je nach geplanter Anwendung und Art der Modifikation wird entweder ein am Zucker modifiziertes ucleosid oder ein Linker-Molekül während der Phosphoramiditsynthese eingeführt. Veränderungen am ucleosid führen in der Regel zu ligonucleotid-analoga mit geringfügigen strukturellen Veränderungen. Primäres Ziel ist es hier das Erkennungsmotiv weitgehend beizubehalten. Derartige Modifikationen werden z.b. bei Replikationsexperimenten benutzt, um die Ligation zu verbessern oder auch um den

33 Einleitung 27 enzymatischen Abbau von ucleotidsequenzen zu verhindern. Entsprechende Beispiele sind in Abbildung 1.14 dargestellt. Zur Synthese von ligonucleotid-konjugaten oder artifiziellen Molekülen mit DA- Reihe solcher Erkennungsmotiv werden häufig Linker-Moleküle oder basenmodifizierte ucleoside verwendet, die als Phosphoramidit in die Synthese integriert werden. Eine Phosphoramidite sind käuflich zu erwerben und erlauben auf synthetisch einfachem Weg die Einführung von z. B. Farbstoffen oder Biotin, ydrazin-, Aldehyd- und Thiol- Funktionalitäten. Bei diesen Beispielen steht die chemische Funktionalität der Modifikation im Vordergrund. Auch entsprechende Festphasen zur Darstellung von 3 -modifizierten ligonucleotiden sind bekannt und kommerziell erhältlich. Resultierend aus den verschiedenen Anwendungen und Modifikationen gibt es im Syntheseverfahren einige Variationen bei den Aktivatoren, Festphasen, Basenschutzgruppen und auch in der anschließenden Entschützung. Das Phosphoramiditverfahren erlaubt es so, zahlreiche chemische Modifikationen in der ligonucleotidsynthese einzuführen.

34 Aufgabenstellung 28 2 Aufgabenstellung Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Prinzip der minimalen Replikase als Katalysator der Replikation in einem ligonucleotid-replikationssystem zu untersuchen. Die minimale Replikase ist ein theoretischer Ansatz, um das ansonsten parabolische Wachstum bei ligonucleotid-replikatoren in exponentielles zu überführen (Abb. 1.15). Die Replikase soll hierbei kovalent an einen Eduktbaustein binden und diesen für die Replikation aktivieren. Gleichzeitig könnte sie aufgrund ihrer DA-bindenden Eigenschaften den termolekularen Komplex ABC relativ zum Templatduplex C 2 stabilisieren und das System nach der Ligation verlassen. Die Stabilisierung von ABC soll dabei die Steigerung der Reaktionsordnung über das parabolische Wachstum hinaus bewirken. Die bisherigen Ansätze zur Entwicklung einer minimalen Replikase hatten nicht zu den gewünschten Ergebnissen geführt, sodass es kaum konkrete Vorgaben für die Gestaltung des Replikationssystems und der Abgangsgruppe gab. Basierend auf den gut untersuchten DA-Replikatoren sollte die bisherige Kernsequenz der ligonucleotidbausteine d(ccgcgg) hier beibehalten werden. Eine Erweiterung der Sequenz zur verbesserten Anbindung einer Replikase war jedoch möglich und sinnvoll. Eine größere Variation an potentiellen Replikasen wäre so verwendbar, ohne die Dimensionen des zu katalysierenden Replikationssystems zu übersteigen. Die Gestaltung der Replikase war ebenfalls frei wählbar, da in den Arbeiten zur minimalen Replikase zuvor keine herausragenden DA-Binder gefunden wurden. Auch eine besonders geeignete Verknüpfung oder Aktivierung war nicht bekannt. Als potentielle Replikase wurde zunächst auf ein monofunktionalisiertes Polyamin zurückgegriffen, welches nach geeigneter Imidazol-Modifikation in Form eines Phosphorimidazolids an die DA gebunden werden sollte. Das so aktivierte ligonucleotid- Konjugat sollte auf seine Eignung als Baustein bei der ligonucleotidreplikation hin untersucht werden. Abhängig von den erzielten Ergebnissen waren verschiedene Variationen des Systems bezüglich der stabilisierenden Abgangsgruppe oder der Verknüpfungschemie denkbar. Das primäre Ziel der Arbeit sollte hierbei die Entwicklung eines Replikationssystems sein, das unter Freisetzung einer variierbaren Abgangsgruppe Selbstreplikation zeigt und in kinetischen Untersuchungen verfolgbar ist. Die Analyse der Replikationsexperimente sollte standardmäßig über PLC-Kinetiken oder gegebenenfalls über ein etabliertes FRET-System erfolgen.

35 Allgemeiner Teil 29 3 Allgemeiner Teil 3.1. Voruntersuchungen: Um das Konzept der minimalen Replikase realisieren zu können, mussten zunächst folgende Bestandteile des Systems festgelegt werden: - Wahl der ligonucleotidsequenz: Analog zu den von Bülle und Schöneborn untersuchten Systemen wurde ein selbstkomplementäres Decamersystem gewählt. [32, 66] Als Kernsequenz blieb hier das bewährte examersystem d(ccgcgg) bestehen und wurde um T und A auf die Sequenz d(ttccgcggaa) erweitert. Es erschien notwendig, das hexamere System für eine sinnvolle Umsetzung des Konzepts der minimalen Replikase zu erweitern. So sollte eine minimale Replikase die Größenordnung des katalysierten Replikationssystems nicht überschreiten, sie sollte aber auch, für den Fall der Polyamine oder Peptide, mehrere positive Ladungen tragen, um eine messbare Wechselwirkung mit der DA zu zeigen. Die Wahl dieses Decamersystems sollte außerdem eine Vergleichbarkeit mit den Arbeiten von Schöneborn und Azzawi erlauben. [64, 66] - Wahl der 3 - und 5 -Termini der Eduktbausteine: Wie auch in den meisten anderen Replikationssystemen wurde zunächst eine 3 -Phosphat- und eine 5 -Amino-Modifikation gewählt. Die EDC-vermittelte Reaktion verläuft bei dieser Ligation ausreichend schnell, um Autokatalyse zu verfolgen. Alternativ ist eine Aktivierung der 3 -Phosphatgruppe als Phosphorimidazolid möglich. - Wahl der Abgangsgruppe: ierbei sollte es sich um ein DA bindendes Molekül handeln, welches den termolekularen Komplex in der Selbstreplikation stabilisieren kann. Tetramethylspermin, ein monofunktionalisiertes Polyamin, das schon beschrieben wurde und [61, 62, 67] zur Modifikation zur Verfügung stand, sollte zunächst Verwendung finden. - Wahl der Verknüpfungschemie: Die Aktivierung für die Ligationsreaktion sollte über ein Phosphorimidazolid realisiert werden. Geeignete kommerziell erhältliche Imidazol- können, sind z.b. verbindungen, die mit einem DA-bindenden Molekül verknüpft werden istidin, istamin oder -(3-Aminopropyl)-imidazol.

36 Allgemeiner Teil Synthese einer potentiellen Polyamin-Replikase Durch Verknüpfung des Polyamins 18 mit istamin erhält man eine potentielle minimale Replikase, die als Phosphorimidazolid an ein ligonucleotid konjugiert werden kann. Der Polyaminrest, der in der Replikation den termolekularen Komplex stabilisieren soll, liegt methyliert vor, um mögliche ebenreaktionen mit dem Aktivierungsreagenz oder dem gebildeten Phosphorimidazolid auszuschließen. Zur Darstellung des Tetramethylspermins 18 wurde eine, gegenüber den zuvor beschriebenen Synthesen verbesserte Syntheseroute gewählt. Ausgehend vom Putrescin 13 gelangte man nach Michael-Addition von Acrylnitril und Alkylierung mit 15 zum Spermingerüst 16. [68] ach Eschweiler-Clark-Methylierung mit gleichzeitiger Boc-Entschützung lieferte die Reduktion mit Lithiumaluminiumhydrid das monofunktionalisierte Spermin 18 (Abb. 3.1) C 2 C Boc Br KF / Celite Boc C C C C LiAl 4 TF 18 2 Abbildung 3.1: Synthese eines monofunktionalisierten Spermin-Derivates 18 Die Imidazol-Funktionalisierung wurde durch Verknüpfung mit istamin über eine arnstoffbrücke erreicht. ierzu setzte man istamin mit Carbonyldiimidazol zu 20 um. [69] Die anschließende Reaktion des aktivierten istamins mit dem Polyamin lieferte 21 nach säulenchromatographischer Reinigung in guter Ausbeute und Reinheit (Abb. 3.2).

37 Allgemeiner Teil CDI DMF 20 DMF 3d Abbildung 3.2: Darstellung einer potentiellen Polyamin-Replikase 21 Trotz der langen Reaktionszeit wurde diese Verknüpfung daher den ebenfalls erprobten Umsetzungen mit Phosgen oder Triphosgen vorgezogen, da hierbei zahlreiche ebenprodukte gebildet wurden Untersuchungen zur ligonucleotid-replikation mit Phosphorimidazolid-Konjugaten Zur Ligation der ligonucleotide sollte die Phosphoramidatbindung wie in den bisherigen DA-Replikationssystemen beibehalten werden. Eine Aktivierung am 5 -Phosphat über Phosphorimidazolide wurde von rgel schon in ähnlicher Weise bei der matrizengesteuerten Polymerisation von ucleotiden (Abb. 3.3) verwendet. [19] Diese Aktivierung sollte entsprechend auf das 3 -Phosphat von ligonucleotiden übertragen werden. P B PPh 3, PySSPy, DMF, Et 3 Abbildung 3.3: Darstellung von Imidazol-aktivierten ucleotiden P B EDC, 0,1 M EPES [19, 70] P B Die Umsetzung der ligonucleotidreplikation kann zum einen durch eine EDC-vermittelte Ligation bei Zugabe der Imidazolverbindung erfolgen (Abb. 3.3)oder durch Reaktion mit dem

38 Allgemeiner Teil 32 zuvor isolierten Phosphorimidazolid-Konjugat 22. Da der Einfluss der Imidazolverbindungen bei einer direkten Aktivierung über die Konjugate besser zu verfolgen ist, wurde die zweite Methode gewählt. p EDC 5 5 p* 5 p T T C C G 2 T T C C G 2 T T C C G 22 2 C G G A 3 A 21 p* T T C C G C G G A A A A G G C G C C T T 5 p 2 T T C C G C G G A A A A G G C G C C T T T T C C G C G G A A A A G G C G C C T T A 3 A G G C G C C T T 5 Abbildung 3.4: Schema zur ligonucleotid-replikation unter Einfluss der Replikase 21; blau dargestellt ist der Replikationskreislauf ohne EDC-Aktivierung in situ Das Phosphorimidazolid-Konjugat 22 ließ sich zum einen durch EDC-Ligation im Wässrigen oder in DMF, aber auch durch die Aktivierung von ucleosiden mit PySSPy und PPh 3 in DMF synthetisieren. [70] Durch nichtwässrige Umsetzung sollte dabei eine ydrolyse des Konjugats bei der Aufreinigung verhindert werden. Das ligonucleotid wurde durch Ausfällen aus einer etherischen atriumperchlorat-lösung erhalten. Anders als für die Aktivierung von ucleotiden beschrieben [19] verlief die Umsetzung zum Phosphorimidazolid bei ligonucleotiden nicht quantitativ. Zur Isolierung des Produkts war daher wie bei der EDC-Ligation eine Aufreinigung mit RP-PLC-Chromatographie erforderlich. Als PLC- Puffer wurde ein 0.1 M Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer bei p 7 verwendet um einen nucleophilen Angriff des Amins auf das Konjugat zu vermeiden. Das gewünschte

39 Allgemeiner Teil 33 ligonucleotid-polyamin-konjugat konnte isoliert und per MALDI-TF charakterisiert werden (Abb. 3.5). - P - P 2 M = 1910,59 r P - P 2 P - Abbildung 3.5: Aufreinigung und Charakterisierung des ligonucleotid-polyamin-konjugats 22; das PLC-Elutionsdiagramm zeigt die EDC vermittelte Konjugation; bei der Charakterisierung durch MALDI-TF-MS ist auch das ydrolyseprodukt zu beobachten Es zeigte sich aber auch, dass beim Aufkonzentrieren des PLC-Eluates bereits eine merkliche ydrolyse einsetzte. Selbst beim sofortigen Reinjizieren des Produktpeaks auf die PLC wurde eine ydrolyse bereits beobachtet. Diese Ergebnisse machen deutlich, dass die kinetische Untersuchung der Replikation mit definierten Substanzmengen mit diesem Ansatz nur schwer umzusetzen sind. Aber auch die Erzeugung von Imidazoliden durch EDC-Zugabe in situ ist aus analytischer Sicht nicht unproblematisch. Eine RP-PLC-Analytik der Replikation würde bei EDC- Zugabe noch komplexer, da mehr Spezies zu verfolgen wären, und die EDC-vermittelte Ligation von der Imidazol-vermittelten Ligation unterschieden werden müsste. Des weiteren ist diese Form der Analytik sehr zeitaufwendig und liefert nur geringe Datenmengen, was sie

40 Allgemeiner Teil 34 vor allem für die Untersuchung einer größeren Zahl von potentiellen Replikasen ungeeignet macht. Als alternative Methode zur Verfolgung der Kinetik selbstreplizierender Systeme wurde das von Bülle und Schöneborn entwickelte Verfahren etabliert, welches die Verfolgung der Produktbildung online über einen Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) erlaubt. [25] In dem System sind der Eduktbaustein A und das Templat C mit Fluoreszenzfarbstoffen gelabelt. Da der termolekulare Komplex ABC sehr gering populiert ist, verfolgt man quasi nur das FRET-Signal des nach Ligation gebildeten Duplexes C 2 (Abb. 3.6). Über eine entsprechende Kalibrierung kann man die Fluoreszenz in Konzentrationen umrechnen. Abbildung 3.6: Replikationssystem von Schöneborn mit Cy-Labeling zur FRET-Analyse. ur der Produktduplex C 2 ist ausreichend populiert um ein Signal zu liefern. Eine Anwendung dieses Systems in der bestehenden Form auf das Konzept der minimalen Replikase ist nicht möglich, da die dem FRET-System zugrundeliegenden Annahmen nicht übertragbar sind. Da die katalytische Wirkung der minimalen Replikase durch eine Stabilisierung des termolekularen Komplexes erreicht werden soll, würde dieser im FRET- System neben dem Produktduplex ebenfalls für ein Signal sorgen. Auch müsste für eine utzung der FRET-Messung das Farbstofflabeling nicht am 5 - sondern am 3 -Ende eingeführt werden, da sonst auch ein möglicher Komplex des Konjugateduktes A mit dem Templat C ein FRET-Signal liefern könnte (Abb. 3.7). Eine Umkehrung der Phosphat- und Amin-Modifikation erschien aufgrund der geringeren Reaktivität nicht sinnvoll. Die von

41 Allgemeiner Teil 35 Zimmermann [71] dargestellte Cy-modifizierte Festphase, die ein 3 -Labeling ohne endständiges Phosphat ermöglichen sollte, eignete sich aufgrund der zu geringen Beladung nicht zur ligonucleotidsynthese. Abgesehen von diesen Problemen ist auch nicht klar, ob der Einfluss einer minimalen Replikase auf den termolekularen Komplex sich nicht auch strukturell soweit auswirken kann, dass eine Abstandsänderung der Farbstoffe und somit auch eine Änderung des FRET-Signals eintritt. Abbildung 3.7: Übertragung des FRET-Systems auf das Konzept der minimalen Replikase. Die Spezies ABC, AC und C 2 liefern Beitrag zum FRET-Signal. Aufgrund der beschriebenen experimentellen und konzeptionellen Probleme wurde das gewählte System verworfen und ein völlig neues Konzept erarbeitet. Die bei der Realisierung des Konzept der minimale Replikase hinderliche ydrolyse sollte hierdurch verhindert werden und die Replikation mit einer geeigneten Analytik verknüpft werden.

42 Allgemeiner Teil eue Verknüpfungschemie in der ligonucleotidreplikation: Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen Bei der Suche nach einer katalytisch wirkenden Abgangsgruppe der ligonucleotidreplikation sind prinzipiell eine Reihe von duplex-stabilisierenden Verbindungsklassen denkbar. Um eine Vielzahl an Verbindungen darstellen zu können und hieraus geeignete Spezies zu isolieren, sind einfache Synthesemethoden und eine schnelle unkomplizierte Analytik Voraussetzung. Für einen kombinatorischen Ansatz bieten sich DA und vor allem Peptide an, die leicht durch automatisierte Festphasensynthese darzustellen sind und durch Auswahl der Seitenketten eine Vielzahl an strukturellen Variationen bieten. Alternativ ist auch die gezielte Darstellung und Untersuchung einzelner potentieller Replikasen möglich. Die utzung von Computermodellen könnte hier bei der Gestaltung der stabilisierenden Abgangsgruppe hilfreich sein. Eine effiziente Methode, verschiedene potentielle Replikasen auf ihre Wirksamkeit zu testen, existiert bisher noch nicht. Der von Burmeister verfolgte Ansatz über eine gerichtete molekulare Evolution von 5 -Amino-ligonucleotiden als Katalysatoren führte nicht zum gewünschten Ziel. Die selektierten DA-Sequenzen, die als Phosphoramidate mit dem Replikationssystem verknüpft waren, zeigten nicht die beabsichtigte katalytische Wirkung. Anstelle einer Phosphoryltransferreaktion zum Phosphordiester wurde eine cofaktorabhängige ydrolyse der Phosphoramidatbindung beobachtet. [63] Auch durch eine gezielte Untersuchung einzelner potentieller Replikasen auf ihre Wirksamkeit hin konnte kein katalytischer Einfluss auf die ligonucleotid-replikation gezeigt werden. [64] Unabhängig von der Gestaltung der Replikase selbst, lagen die größten Probleme bei der Realisierung der Konzepte zur minimalen Replikase bisher vor allem in einer effizienten Verknüpfungschemie. Sowohl beim Phosphoryltransfer vom Phosphoramidat zum [63, 64] Pyrophosphat bzw. zum Phosphordiester als auch bei einer Aktivierung durch Carbodiimide [61, 62] oder Phosphorimidazolide, in allen Fällen beeinträchtigte vor allem die ydrolyse die Ligationsreaktion und dies unabhängig von der Reaktivität der Konjugate. Da für die Untersuchung von Reaktionskinetiken eine relativ schnelle Ligationreaktion erforderlich ist, ist bei entsprechender Aktivierung auch in großem Maße mit ydrolyse zu rechnen. Das Problem kann bei diesen Systemen wohl nur durch eine Aktivierung in situ mit einem Quasigleichgewicht gelöst werden.

43 Allgemeiner Teil 37 Die zusätzliche Aktivierung, beispielsweise durch EDC, führt jedoch zu weiteren Reaktionkanälen im Replikationssystem, wodurch die unkatalysierte EDC-Ligation die Produktbildung unter dem Einfluss der Replikase überlagert, was die Analytik erheblich erschwert. Alternative, hydrolyseunempfindliche Ligationen sind Phosphorsäure-Thioester- oder Disulfidbindungen, die in Arbeiten von Kool und Metelev und retskaya vorgestellt wurden. [72-76] Die Verknüpfung verläuft bei beiden Systemen unter Freisetzung einer Abgangsgruppe, die durch Einführung entsprechender Modifikationen als Replikase wirken könnte. In den Arbeiten von Kool findet die Verknüpfung zwischen einem 3 -Phosphorthioat- ligonucleotid und 5 -Iodo- oder 5 -Tosyl-modifizierten ligonucleotiden statt. [72] Im Jahre 2002 wurde auch eine Dabcyl-Modifikation als Aktivierung untersucht (Abb. 3.8). [73] Die Abgangsgruppe diente hierbei nicht nur der Aktivierung, sondern auch als Quencher für ein benachbartes Fluorophor. ierdurch wurde die Verfolgung der Kinetik der Ligationsreaktion durch Fluoreszenz möglich. P S 2 S P S 2 Abbildung 3.8: ligonucleotid-ligationsreaktion nach Kool [73] Ein solches System sollte in ähnlicher Form auch für das Konzept der minimale Replikase anwendbar sein. Diese Art von Ligation wurde dennoch verworfen, da die ligonucleotid- Kernsequenz CCGCGG beibehalten werden sollte. Die Übertragung einer Verknüpfung nach Kool auf dieses System war schon von Bülle untersucht worden, führte aber bei Verwendung von 5 -Iodo-cytidin zu keinem brauchbaren Replikationssystem. [77] Auch Kool beschränkt sich bei den 5 -Modifikationen auf Thymidin da bei 5 -Modifikationen von Purin- ucleosiden von intramolekularen ebenreaktionen berichtet wurde. [78]

44 Allgemeiner Teil 38 Aus der Arbeitsgruppe von retskaya wurde in den letzten Jahren mehrfach über [58, 74-76] Ligationsreaktionen von thiolmodifizierten ligonucleotiden berichtet. ierbei wurden 3 -Phosphorthioat-ligonucleotide mit 5 -Thiol- oder 5 -Phosphorthioat- ligonucleotiden umgesetzt. Die Bildung der Mono- oder Diphosphoryldisulfid- Bindung erfolgte zum einen durch Zugabe von xidationsmitteln aber auch durch Disulfid- Austauschreaktionen. Während die oxidative Ligation wenig gerichtet und unter Bildung zahlreiche ebenprodukte verlief, entstand durch Disulfid-Austausch fast ausschließlich das Zielmolekül. Ein Templateffekt konnte auch beobachtet werden. Die Aktivierung erfolgte durch Umsetzung eines Thiol-ligonucleotids mit 2,2 -Dipyridyldisulfid (PySSPy). P S 2 S S P S S 2 Abbildung 3.9: ligonucleotid-ligation nach retskaya [74] Die Thiol-Disulfid-Austauschreaktion wurde aufgrund folgender Überlegungen als Verknüpfungschemie für das Konzept der minimalen Replikase gewählt: - Thiol-Modifikationen: Entsprechende Modifikationen von ligonucleotiden sind bekannt und leicht zu synthetisieren. Eine terminale Phosphorthioat- oder Thiol- Modifikation kann direkt bei der Phosphoramidit-ligonucleotidsynthese eingeführt werden. - Reaktivität: Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen mit Arylthiolen sind schnelle Reaktionen, können aber nicht nur durch die Wahl der Abgangsgruppe, sondern auch durch p-wert, Temperatur und Konzentration gesteuert werden.

45 Allgemeiner Teil 39 - Aktivierung: Die Aktivierung erfolgt über kommerziell erhältliche Reagenzien wie 5-5 -Dithiobis-(2-itrobenzoesäure) (Ellmann s-reagenz, DTB) 23, 2-2 -Dipyridyldisulfid (PySSPy) 24 oder 6,6 -Dithiodinicotinsäure (SDS) 25. Die bei der Ligation entstehenden Abgangsgruppen (Thiopyridon bzw. Ellmann s Ion) zeigen eine charakteristische UV-Absorption, wodurch die Kinetik der Replikation UVspektroskopisch verfolgt werden kann. 2 C S S C 2 2 C C S S S S Ellmann s Reagenz 2,2 -Dipyridyldisulfid icotinsäuredisulfid DTB PySSPy SDS Abbildung 3.10: Kopplungsreagenzien für Thiole - Minimale Replikase: DA bindende Moleküle können über eine Amidbindung an die Carbonsäurefunktion des Ellmann s Reagenz oder icotinsäuredisulfids verknüpft werden. - ebenreaktionen: eben xidation sind kaum ebenreaktionen zu erwarten. - andhabung: Die andhabung der hydrolyseunempfindlichen aktivierten Konjugate ist vergleichsweise unproblematisch; das Arbeiten unter Schutzgas sollte eine xidation verhindern können. - Kosten: Die Ligationsreaktion ist reversibel, die Reduktion von Reaktionsansätzen erlaubt daher das Recycling der ligonucleotid-eduktbausteine. Bei umfangreichen Messungen bedeutet dies einen enormen Kostenvorteil gegenüber anderen Replikationssystemen. Um die Schnelligkeit der Disulfid-Austauschreaktionen besser einschätzen und die Verfolgbarkeit über UV-Kinetiken überprüfen zu können, wurden zunächst einige UV-Messungen durchgeführt. Die Reaktionen von Cysteamin mit 2,2 -Dipyridyldisulfid (PySSPy), Ellmann s Reagenz (DTB) und icotinsäuredisulfid (SDS) wurden untersucht.

46 Allgemeiner Teil 40 Ellmann s-reagenz DTB EllS icotinsäuredisulfid SDS ST Wellenlänge [nm] Wellenlänge [nm] Dipyridyldisulfid PySSPy PyS Wellenlänge [nm] Abbildung 3.11: UV-Kurven von DTB 23, SDS 25 und PySSPy 24 Die Extinktionsmaxima des Thiopyridons und des Ellmann-Ions wurden bestimmt und Reaktionskinetiken bei den entsprechenden Wellenlängen durchgeführt. Durch Variation von p-wert und Konzentration sollten geeignete Bedingungen für Replikationsexperimente gefunden werden. Der p-wert hat einen großen Einfluss auf die Reaktionsgeschwindigkeit, da hauptsächlich das Thiolat-Ion als ucleophil im Disulfid-Austausch wirkt. RS Ka RS k1 RS SEll EllS RS SR EllS (EllS) + - k2 2 + RS Abbildung 3.12: Disulfid-Verknüpfung mit Ellmann s Reagenz Es zeigte sich, dass die Reaktionen sehr schnell verlaufen, sodass eine Verfolgung der Reaktion nur bei geringen Konzentrationen und niedrigem p-wert möglich ist. Limitierend für die im Experiment einsetzbare Konzentration ist dabei der Extinktionskoeffizient des beobachteten Ions. Der p-wert sollte p 4 nicht unterschreiten, da hier mit einer Depurinierung der Basen zu rechnen ist. ptimal erschien ein p-wert von 5.

47 Allgemeiner Teil 41 Bei der Variation der p-werte zeigte sich auch, dass der Extinktionskoeffizient des Ellmann-Ions stark p-abhängig ist. Der Extinktionskoeffizient fällt bei einer Messwellenlänge von 412nm von M -1 cm -1 bei p 7 auf nur 6000 M -1 cm -1 bei p 4,5 ab. So zeigt beim Ellmann-Reagenz nur das gebildete Ellmann-Anion die charakteristische UV-Absorption, die Absorption des Thiols ist viel geringer. Die Protonierung des Ellmann- [79, 80] Ions sorgt bei niedrigem p-wert daher für die verringerte Absorption. Extinktion bei 412nm p4 p4,5 p5 p6 p7 p4 p4, Wellenlänge [nm] p5 Abbildung 3.13: p-abhängigkeit der Extinktion des Ellmann-Ions und der Einfluss auf den Disulfid-Austausch; Umsetzung einer 50µM DTB-Lösung mit Cysteamin bei verschiedenen p-werten Auch die Extinktionskoeffizienten der Thiopyridone wurden bestimmt. ier wurde in dem gemessenen Bereich keine p-abhängigkeit beobachtet. Bei Extinktionkoeffizienten von etwa M -1 cm -1 kann die Reaktion in einer 50 µm Lösung noch gut verfolgt werden. Dies entspricht auch in etwa den Konzentrationen die bei den Fluoreszenz-Messungen im FRET-System von Bülle und Schöneborn verwendet wurden. [32] Bei kleinen Reaktionsvolumina sollten 1,3µmol Standardsynthesen am Synthesizer die erforderlichen Substanzmengen an modifizierten ligonucleotiden liefern können. Um den Zusammenhang zwischen UV-Absorption und Konzentration für den Messbereich bis 50µM zu überprüfen, wurden Verdünnungsreihen des Ellmann-Ions bei verschiedenen p-werten aufgenommen. Es wurde über den gesamten Konzentrationsbereich, in dem die Kinetiken durchgeführt werden sollten, eine hohe Messgenauigkeit erreicht. Ein linearer

48 Allgemeiner Teil 42 Zusammenhang zwischen Konzentration und UV-Extinktion konnte für den Konzentrationsbereich ebenfalls gezeigt werden. Extinktion bei 412 nm Ellmann s-ion; p 5.0 Ellmann s-ion; p Konzentration [µm] Konzentration [µm] Abbildung 3.14: Verdünnungsreihen mit Ellmann s Ion bei verschiedenen p-werten Extinktion bei 412 nm Die Linearität war auch noch bei niedrigen Konzentrationen unter 5 µm gegeben, sodass bei Replikationsexperimenten mit Ellmann-Aktivierung ohne Korrekturfaktoren anhand der Messungen ein direkter Rückschluss auf die Produktkonzentration möglich wäre. Da insbesondere aus der Anfangssteigung der Messkurven in Replikationkinetiken Informationen über die Autokatalyse gewonnen werden, sind hier exakte Messwerte notwendig, die den tatsächlichen Reaktionsverlauf ausreichend widerspiegeln. Mit den Voruntersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Disulfid-Austausch-Reaktion über UV-Absorption verfolgt werden kann und eine Verfolgung von Reaktionskinetiken auf diesem Wege möglich ist Thiol-Modifikationen an ligonucleotiden Um eine templatgesteuerte Replikation mit Thiol-ligonucleotiden zu ermöglichen, sollten die eingeführten Modifikationen im Reaktionsprodukt einer Phosphordiesterbindung strukturell sehr ähnlich sein. Der Syntheseaufwand sollte auf der anderen Seite möglichst gering gehalten werden. Eine Monophosphoryldisulfid-Bindung wie von retskaya beschrieben erschien daher geeignet, die entsprechende Diphosphoryldisulfid-Bindung aufgrund geringer Stabilität jedoch nicht. [58] Die Einführung eines Phosphorthioats am 3 - oder 5 -Ende erfolgt sehr einfach beim Phosphoramidit-Verfahren durch Austausch des xidationsmittels Iod. Die Verwendung des kommerziell erhältlichen Beaucage-Reagenz (3-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid) 27 beim

49 Allgemeiner Teil 43 entsprechenden xidationsschritt sorgt für eine selektive xidation des dreiwertigen Phosphoratoms zum Phosphorothioat 28. ierdurch kann an jeder beliebigen Stelle des Rückgrats ein Phosphorthioat eingeführt werden. C S 2 2 S + P S C P S S S Abbildung 3.15: xidation mit dem Beaucage-Reagenz 27 zum Phosphorthioat. Die Entschützung derart modifizierter ligonucleotide erfolgt standardmäßig mit Ammoniak. Die Synthesen aller ligonucleotide wurden am DA-Syntheziser durchgeführt. Die Charakterisierung erfolgte über RP-PLC und MALDI-TF-MS. Die Phosphorthioat-Modifikation wurde als 3 -Modifikation gewählt und am Synthesizer das ligonucleotid TTCCGps (ps für Phosphorthioat) synthetisiert. Es zeigte sich, dass neben dem gewünschten Produkt auch das Phosphat-ligonucleotid mit der Sequenz TTCCGp in der Synthese enthalten ist. Eine Auftrennung mit RP-PLC war nicht möglich. Die Aufreinigung erfolgte daher durch Ionenaustauschchromatographie mit einer Dowex- Ionentauschersäule. Dies macht einen zusätzlichen Reinigungsschritt erforderlich, da die anschließende Entsalzung über RP-PLC erfolgen musste. Die Entsalzung kurzer ligonucleotidsequenzen über AP-Säulen oder asis-kartuschen war mit großen Substanzverlusten verbunden. Ein Thiol am 5 -Ende konnte einfach über eine Carbamat-Modifikation der 5 -ydroxy-funktion mit Cysteamin erhalten werden. Die Modifikation erfolgte nach der Standard-igonucleotidsynthese noch auf der Festphase durch Aktivierung mit Carbonyldiimidazol (CDI) zu 31 und anschließender Umsetzung mit Cystamin.

50 Allgemeiner Teil 44 Base Base 2 S S Base C P CDI C 3 C Base C P Base Cystamin DMF C P Base Abbildung 3.16: 5 -Cystamin-Modifizierung auf der Festphase. Die Entschützung von 32 mit Ammoniak und Reduktion mit Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin (TCEP) lieferte das gewünschte Cysteamin-CGGAA-ligonucleotid. Mit Einführung dieser Modifikation konnte zunächst die aufwendige Synthese eines 5 -thiolmodifizierten Phosphoramidits vermieden werden Untersuchung des 5 -Cysteamin-3 -Phosphorthioat- Systems Die Verwendung eines Cysteamin-Linkers am 5 -Ende führt scheinbar zu einem strukturellen achteil gegenüber der von retskaya [58] beschriebenen Verknüpfung über eine 5 -Thiol- Modifikation am Zucker. Bei der templatgesteuerten Replikation würden die Reaktionszentren im Cysteamin-System weniger gut in eine räumliche ähe gebracht. Dies sollte den Templateffekt verringern. Für ein Replikationssystem mit einer großen Abgangsgruppe am Reaktionszentrum kann diese Flexibilität aber auch als Vorteil gewertet werden, da eine mögliche sterische inderung verringert werden könnte und eine flexiblere Anbindung der minimalen Replikase an den termolekularen Komplex möglich würde. Sollte für das System kein Templateffekt zu beobachten sein, so wäre auch noch der Austausch eines natürlichen Templats gegen ein synthetisches Templat, wie z.b. das Produkt, möglich (Abb. 3.17).

51 Allgemeiner Teil 45 Abbildung 3.17: Disulfid-Replikationssystem mit 5 -Cysteamin- und 3 -Phosphorthioat- Modifikation Bei einem solchen System wäre mit einer verringerten Effizienz des Replikators zu rechnen, da die Stapelung der das Reaktionszentrum flankierenden Basen hier wegfiele und dadurch [35] die Stabilität des termolekularen Komplexes nachließe. Bei der Untersuchung von komplexstabilisierenden minimalen Replikasen wäre eine Destabilisierung jedoch nicht zwangsläufig ein achteil. Ein positiver Einfluss der Abgangsgruppe sollte auch hier noch wirksam, und in Vergleichsmessungen bestimmbar sein. Als Reagenz für die Aktivierung der ligonucleotide wurde zunächst DTB gewählt, da das Fortschreiten der Reaktion zum gemischten Disulfid aufgrund der gelben Farbe des entstehenden Ellmann-Ions gut zu verfolgen ist. Auch das Konjugat besitzt eine charakteristische UV-Adsorption bei 330 nm, was die Identifizierung des Produkts bei der Aufreinigung mit RP-PLC vereinfacht(abb. 3.18). Eine Aktivierung wurde sowohl für das 3 -Phosphorthioat als auch für das 5 -Cysteamin versucht. Es zeigte sich, dass nur die Thiolaktivierung für eine Isolierung ausreichend stabil ist. Das Produkt konnte in wässriger Lösung bei 20 C ohne beobachtbare Zersetzung gelagert werden. Die aktivierten Phosphorthioate zersetzten sich bereits bei der Aufarbeitung. Die rientierung der Aktivierung war somit festgelegt und auch favorisiert, da Phosphorthioate weniger oxidationsempfindlich gegenüber Sauerstoff sind als Thiole.

52 Allgemeiner Teil 46 Zur Aktivierung wurde das ligonucleotid zunächst mit einem etwa 20fachen Überschuss an TCEP reduziert (15min) und anschließend mit einem großen Überschuss an DTB (200fach) umgesetzt. ach etwa 30min wurde das Produkt durch RP-PLC isoliert und nach weiterer Aufarbeitung wurde eine Stammlösung des aktivierten ligonucleotids 33 erhalten. 2 C 2 S S P 33 2 P P 2 P Abbildung 3.18: PLC-Plot der Umsetzung des Cysteamin-ligonucleotids 32 mit Ellmann s Reagenz zum aktivierten Disulfid 33, durch die Extinktion der Ellmann Aktivierung bei 330 nm ist das Produkt identifizierbar Als problematisch erwies sich jedoch die andhabung der Phosphorthioat-ligonucleotide, aber auch der freien Thiol-ligonucleotide. Abbildung 3.19: Fortschreitende xidation des Phosphorthioat-ligonucleotids 28 ach PLC-Reinigung der zuvor reduzierten Phosphorthioate wurde zunächst eingeengt und zur Entfernung des PLC-Puffer mit Ethanol-Wasser (60:40) koevaporiert. bwohl alle Lösungen entgast waren und die Arbeiten unter Argon durchgeführt wurden, zeigte die PLC-Analyse zu diesem Zeitpunkt bereits eine merkliche xidation des Phosphorthioats.

53 Allgemeiner Teil 47 Dies konnte nur dann weitgehend verhindert werden, wenn die Probe nicht zur Trockne eingedampft wurde. Eine weitere xidation der Probe konnte aber auch durch Lagerung in Lösung bei 20 C unter Argon nicht verhindert werden (Abb. 3.19). ach 24 h war die Stammlösung der modifizierten ligonucleotide bereits zu etwa 20% oxidiert. Für qualitative Untersuchungen hat dies zwar kaum Konsequenzen, für die Aufnahme von Kinetiken stellt die xidation jedoch ein großes Problem dar. Zunächst sollte die Ligationsreaktion und ihre Verfolgbarkeit über UV-Absorption untersucht werden. ierzu wurden 50µM Ansätze des 5 -aktivierten Thiol-ligonucleotids mit Cysteamin oder Mercaptoethanol bei Raumtemperatur und variierenden p-werten im UV-Spektrometer vermessen. Eine Verfolgbarkeit der Kontrollreaktionen über UV- Absorption war möglich. Mit der anschließende Analyse der Reaktionsansätze konnte ein nahezu quantitativer Umsatz zum Produkt-Disulfid gezeigt werden. Entsprechend den Kontrollexperimenten mit Thiolen wurde die Umsetzung der aktivierten ligonucleotide mit den Phosphorthioaten versucht. Die Reaktionsbedingungen wurden dabei sehr ähnlich den vorangegangenen Testreaktionen gewählt. Bei diesen Ansätzen konnten jedoch unabhängig vom p-wert keine brauchbaren UV-Kurven erhalten werden. Die PLC- Analyse der Reaktionsansätze zeigte nur eine sehr geringe Produktbildung. Die DTB-Aktivierung genügt anscheinend nicht für eine schnelle, verfolgbare Austauschreaktion mit Phosphorthioaten, sodass hier ein Wechsel des Systems zu einer 3 -Thiol-Modifikation notwendig war. Die wohl einfachste Methode zur Einführung einer Thiol-Modifikation am 3 -Ende des ligonucleotids ist die Verwendung einer kommerziell erhältlichen Thiolfestphase 34. Bei der Synthese wird am 3 -Phosphat ein Mercaptopropanol oder Mercaptohexanol-Rest eingeführt. 34 CPG S S n DMT n = 1,4 Abbildung 3.20: Kommerziell erhältliche Thiolfestphase mit C 3 oderc 6 -Linker Auf die Verwendung dieser Festphase wurde bisher verzichtet, da sie vergleichsweise teuer ist und eine ebenreaktion bei der Phosphoramiditsynthese zeigt, die schlechte Ausbeuten an Thiololigonucleotiden liefert. So hat die Redoxreaktion zwischen der Disulfidbindung der Festphase und den eingesetzten Phosphoramiditen eine kontinuierliche Abspaltung von der

54 Allgemeiner Teil 48 Festphase zur Folge, was sehr gut an der abnehmenden Kopplungseffizienz im Syntheseprotokoll des DA-Synthesizers zu verfolgen ist. Dies wirkt sich bei längeren Sequenzen stark auf die Ausbeuten aus. Bei der Synthese eines 5mers lagen die Ausbeuten laut Protokoll bei 70% einer normalen Syntheseeffizienz. Die Substanzmenge an 3 -thiolmodifiziertem Thiol-ligonucleotid genügte der qualitativen Untersuchung des Disulfid-Austausches mit dem aktivierten Cysteamin-ligonucleotid. Bei der Aufarbeitung und Lagerung stellten sich die 3 -Mercaptopropanol-ligonucleotide als noch oxidationsempfindlicher heraus als die Phosphorthioate. Eine Lagerung in reduzierter Form war auch hier nicht möglich. 0.1 Testkinetik, 30µM, p 5 Extinktion bei 412 nm t [min] Abbildung 3.21: UV-Test-Kinetik mit 5 -Cysteamin und 3 -Mercaptopropanol-Modifikation Erste Replikationsexperimente mit dem 3 -aktivierten ligonucleotid zeigten, dass die Reaktion nahezu quantitativ verläuft und im UV gut zu verfolgen ist (Abb. 3.21). Prinzipiell könnte das System in dieser Form für Replikationsexperimente verwendet werden. Die Geometrie der entstehenden Disulfidbindung erschien für eine autokatalytische Reaktion jedoch wenig geeignet. Eine Betrachtung der Verknüpfung im Modell (Abb. 3.22) zeigte eine erhebliche Abweichung von der natürlichen Phosphordiester-Bindung, was eine Annäherung der reaktiven Zentren im termolekularen Komplex stark beeinträchtigen sollte.

55 Allgemeiner Teil 49 Abbildung 3.22: links: Geometrische ptimierung der Kernsequenz CCGCGG mit Disulfid Verknüpfung über Mercaptopropyl- und Cysteamin-Linker; rechts: isolierte Backbone mit Disulfid-Verknüpfung Die bisherigen Untersuchungen zeigen nicht nur, dass die ligonucleotid-replikation mit Thiol-Derivaten möglich ist und auch über UV-Absorption verfolgt werden kann, es wurde auch deutlich, dass eine Reihe von Problemen zu lösen sind, um ein selbstreplizierendes System zu erhalten: - Art der Thiol-Modifikation: Um eine templatgesteuerte Replikation beobachten zu können, ist es notwendig, eine der ucleinsäure-rückgrat strukturell sehr ähnliche Verknüpfung zu erhalten. Aussichtsreich erschien hier eine direkte Disulfidverknüpfung zwischen dem 3 - und 5 -Ende der Eduktbausteine. - xidation des freien Thiols: Für die Untersuchung von Reaktionskinetiken sind Stammlösungen der Edukte mit definierter Konzentration erforderlich. ierfür musste eine oxidationsfreie andhabung der Thiol-ligonucleotide ermöglicht werden. - Gestaltung der Abgangsgruppe: Sowohl die Einführung von Modifikationen an der schon erprobten Abgangsgruppen DTB oder SDS, als auch die Stoffklasse und Struktur der Modifikation waren zu diesem Zeitpunkt noch nicht festgelegt.

56 Allgemeiner Teil Synthesen Bei der Suche nach einer für ein Replikationssystem geeigneten Thiol-Modifikation wurden neben den erzeugten Thiololigonucleotiden verschiedene denkbare Bausteine im Model untersucht. Favorisiert wurde hiernach eine direkte 3-5 -Disulfidbrücke, die aufgrund der großen S-S-Bindungslänge eine aussichtsreiche Verknüpfung darstellt (Abb. 3.23). So ist die Länge der Verknüpfung der natürlichen Phosphordiesterbindung sehr ähnlich. Abbildung 3.23: links: geometrische ptimierung der Core -Sequenz für das 5 -sc-3 sg- Replikationssystem; rechts: Vergleich von Phosphordiesterbrücke und Disulfid-Verknüpfung Im termolekularen Komplex würden nach dem Modell bei dieser Modifikation die reaktiven Zentren in eine räumliche ähe gezwungen. Auch scheint bei diesem System die Basenstaplung wenig gestört zu werden.. Der strukturelle Vorteil gegenüber anderen Thiolmodifikationen macht eine Autokatalyse für dieses System sehr wahrscheinlich, sodass dieses Replikationssystem zum auptziel der nachfolgenden Untersuchungen wurde. Zur Darstellung der festgelegten ligonucleotidsequenz d(ttccg-cggaa) war die Synthese von 5 -Thio-cytidin und 3 -Thio-guanosin erforderlich.

57 Allgemeiner Teil Synthese eines 5 -Mercapto-cytidin- Phosphoramidit Zur Synthese des 5 -Thiol-ligonucleotids benötigte man das Phosphoramidit des Cytidins mit geschützter Thiol-Funktion. Eine solche Verbindung ist kommerziell nicht erhältlich und wurde daher ausgehend von Desoxycytidin 35 synthetisiert. Die Einführung einer Benzoylschutzgruppe in 4-Position erfolgte gemäß der Transient Protection Eintopfsynthese nach Jones. [81] (C 3 ) 3 SiCl Si Cl 1) 2) 3 / 2 Si Abbildung 3.24: Synthese von 4--Benzoyl-2 -desoxycytidin 37 nach Jones [81] ierbei wurden die 3 - und 5 - ydroxylfunktionen vorübergehend mit Trimethylsilylchlorid geschützt, um anschließend die Basenschutzgruppe Benzoylchlorid selektiv einzuführen. Die Silylgruppen wurden durch Behandlung mit wässriger Ammoniaklösung wieder entfernt (Abb. 3.24). Zur Einführung das Schwefels am 5 -Ende erschienen prinzipiell zwei Wege sinnvoll. Eine literaturbekannte Synthese verläuft über ein 5 -Iodo-cytidin, welches mit Tritylmercaptan umgesetzt wird. Die Thiolmodifikation erfolgt hier bei gleichzeitiger Einführung der [82, 83] geeigneten Schutzgruppe. Gewählt wurde eine Methode, bei der die Mitsunobu-Reaktion von 37 mit Thioessigsäure das 5 -Thioacetat des Desoxycytidins in guter Ausbeute liefert. Dieses 5 -Acetylthio-cytidin 38 sollte ursprünglich zum Phosphoramidit 39 umgesetzt und dann in der ligonucleotidsynthese eingesetzt werden. Das Amidit reagierte jedoch nicht in gewünschter Weise. Das 5 - Acetylthio-cytidin wurde daher in einem weiteren Syntheseschritt zum Thiol 40 verseift und ohne Reinigung mit DMT-Chlorid in 80%iger Essigsäure zum 5 -DMT-Thio-cytidin 42 umgesetzt. Die Umsetzung zum Phosphoramidit 42 erfolgte mit dem Phosphitylierungsreagenz 41 (Abb. 3.25).

58 Allgemeiner Teil Cl DEAD, PPh P 3 S C 3 CS C S 1. a/ Et 2. DMT-Cl P C S Cl P C S P C Abbildung 3.25: Synthese des 5 -DMT-5 -Thiol-Phosphoramidits von Desoxycytidin 41 Ausgehend von 4--Benzoyl-2 -desoxycytidin 37 lag die Gesamtausbeute an Amidit 41 über 4 Stufen bei 46% der Theorie. Das Amidit 41 wurde nun zur automatisierten ligonucleotidsynthese eingesetzt. ach dem bei modifizierten Phosporamiditen üblichen Protokoll wur de eine 0,15 M Lösung von 41 zweimal für 5 Minuten umgesetzt. Die anschließende Analyse zeigte, dass die Kopplungseffizienz sehr schlecht war. Das gewünschte Produkt der Sequenz S CGGAA konnte nachgewiesen werden, aber auptprodukt war das 4mer GGAA. Es ist bekannt, dass bei modifizierten Phosphoramiditen die Ausbeuten gegenüber Standardamiditen schlechter sind. [84] Gute Ausbeuten konnten erst bei viel höherer Konzentration und längeren Reaktionzeiten erzielt werden. Die besten Resultate konnten bei einer 0,35 M Amiditkonzentration und Kopplungszeiten von zweimal 10 Minuten erzielt werden. Auch unter diesen Bedingungen wurden noch größere Mengen der Abbruchsequenz GGAA erhalten. Tabelle 2: 5 -Thiol-ligonucleotide Sequenz S CGGAA Cyst CGGAA Modifikation 5 -Thio-cytidin 5 -Cysteamin M r (berechnet) M r (gemessen)

59 Allgemeiner Teil 53 Ein Vorteil des Amidits 41 gegenüber anderen 5 -thiolmodifizierten Phosphoramiditen liegt in der Verwendung der DMT-Schutzgruppe. Die literaturbekannten Amidite tragen eine Trityl-Schutzgruppe und müssen daher postsynthetisch mit Silbersalz-Lösung entschützt werden. Es sind zusätzliche Arbeitsschritte zur Entfernung des Silbers und zur Isolierung des ligonucleotids notwendig. Die Entschützung an 41 konnte im Rahmen der Phosphoramiditsynthese durch Verwendung von 6%iger Dichloressigsäure erreicht werden, sodass die anschließende Ammoniakentschützung direkt das freie 5 -Thiol-ligonucleotid lieferte. Insgesamt standen jetzt zwei 5 -modifizierte Thiol-Bausteine zur Verfügung (Tab. 2). Verglichen mit der postsynthetische Cystamin-Modifikation 32 (Kap.3.5) waren die erzielten Ausbeuten an 5 -Thiol-ligonucleotiden über das modifizierte Amidit schlecht und der synthetische Aufwand hoch. Für eine optimierte Verknüpfung im Replikationssystem waren diese und weitere Synthesen jedoch erforderlich Synthese von 3 -Mercapto-Desoxyguanosin Die Thiolmodifikation am 3 -Ende gestaltet sich noch aufwendiger, da hier die Beibehaltung der Stereochemie beachtet werden muss. Modifikationen am 3 -Ende werden daher zum Beispiel in einer mehrstufigen Synthese durch doppelte Inversion mit Reaktionen durchgeführt, die streng nach einem S 2-Mechanismus ablaufen. [85, 86] 3 -Mercaptopyrimidin-Desoxynucleotide sind literaturbekannt. Sie wurden über die entsprechenden 2,3 -Anhydro-ucleotide 43 dargestellt (Abb. 40). Entsprechende beschriebene Synthesen von 3 -Amino-Desoxynucleotiden verliefen ebenfalls über die Anhydro-Verbindung. [87] R Bz Bz R R Bz Ms uc uc Abbildung 3.26: Schema der 3 -Modifikation von Pyrimidin-ucleotiden

60 Allgemeiner Teil 54 Eine entsprechende Synthese für 3 -Mercaptopurine wurde jedoch nicht beschrieben. Ein 3 -Mercapto-guanosin ist zwar bekannt, die Synthese verlief hier aber ausgehend von 3 -Mercapto-Thymidin über eine trans-glycosylierungsreaktion. [88] erdewijn veröffentlichte eine Synthese von 3 -Amino-guanosin, die der doppelten Inversion bei den Pyrimidin-ucleosiden sehr ähnlich ist. [89] ier wird die erste Inversion durch eine Benzoyl-Schutzgruppenwanderung vom 5 -zum 3 - erreicht. Der nucleophile Angriff [87, 89] erfolgt hier also nicht von der Base sondern von der Schutzgruppe am 5 -Ende. Dieser Syntheseweg wurde auch für die Darstellung des 3 -Mercapto-guanosins eingeschlagen. Ausgehend von Desoxyguanosin 44 wurde nach dem Transient-Protection Verfahren nach Jones die Isobuttersäure-Schutzgruppe eingeführt. [81] Cytidin mit Isobuttersäureanhydrid. Die Schützung erfolgte analog zum Me 3 Si 2 2 (C 3 ) 3 SiCl 3 / 2 SiMe 3 Cl (CF 3 S 2 ) S CF3 Abbildung 3.27: Transient protection von Desoxyguanosin nach Jones und anschließende Schützung liefert 48 Die anschließende selektive 5 -Benzoylschützung konnte durch langsames Zutropfen von einem Äquivalent Benzoylchlorid in Pyridin erreicht werden. Zur von erdewijn [89] beschriebenen Benzoyl-Schutzgruppenwanderung (Abb. 3.27) wurde 47 zunächst bei -30 C mit Trifluormethansulfonsäureanhydrid zu 48 umgesetzt. Die anschließende Abspaltung des Trifluormethansulfonats durch Zugabe von Wasser bei 0 C führte zur Wanderung der Benzoylschutzgruppe und damit zu 50. Die Reaktion verläuft vermutlich über ein Acyloxoniumion 49, wobei der 5 -Alkohol unter den basischen Reaktionsbedingungen die bessere Abgangsgruppe ist, was zur Bildung des 3 -Benzoats 50

61 Allgemeiner Teil 55 führt. [90] Das Produkt 50 konnte durch Ausfällen aus Dichlormethan in hoher Reinheit mit einer Ausbeute von 27% erhalten werden. S CF3 - CF 3 S Abbildung 3.28: Mechanismus der Benzoyl-Schutzgruppenwanderung Anschließend wurde in 5 -Position eine Dimethoxytrityl-Schutzgruppe eingeführt. Die Entschützung der 3 -ydroxygruppe mit ethanolischer atiumhydroxid-lösung lieferte 52. Die Einführung des Schwefels in 3 -Position erfolgte, wie schon an der 5 -ydroxylgruppe des Cytidins, durch eine Mitsunobu-Reaktion. 50 DMT-Cl Pyridin 51 a/ Et DEAD, PPh 3, C 3 CS 52 S 53 Abbildung 3.29: Synthese von 3 -Acetylthio-guanosin Um bei dieser Umsetzung zum 3 -Thioacetat 53 gute Ausbeuten zu erzielen wurde das ucleophil Thioessigsäure im Überschuss eingesetzt und die Reaktionszeit verlängert. Die erneute Inversion der Konformation am 3 -C-Atom lieferte das gewünschte ucleosid in einer vollständig geschützten Form. ach säulenchromatographischer Reinigung wurde das Produkt als farbloser Schaum erhalten. Die Gesamtausbeute der Synthese von 53 lag über alle fünf Stufen bei 10%.

62 Allgemeiner Teil Darstellung von 3 -Thio-xylo-guanosin Die MR-Untersuchungen des isolierten Produktes der Benzoyl-Schutzgruppenwanderung 50 und der Folgeprodukte (51, 52) lieferten keinen eindeutigen Aufschluss über die Konfiguration am 3 -C. Auch der Vergleich der gemessenen Kopplungskonstanten von 5 -DMT-dG 54 und 5 -DMT-dxG 51 zeigte nur geringfügige, nicht eindeutige Unterschiede. Es war daher nicht zweifelsfrei zu belegen, dass das gewünschte Produkt 50 aus der Benzoyldes 3 -Thioacetat 52 Wanderung isoliert wurde und die Folgeprodukte die gewünschte Konfiguration am 3 -C besaßen. Da einfache MR-Experimente keinen achweis über die Stereochemie lieferten, wurde zur eindeutigen Strukturaufklärung auch das diastereomere 3 -Thioacetat 55 synthetisiert. Ausgehend vom basengeschützten Desoxyguanosin 53 erfolgte hier eine 5 -DMT-Schützung. Die anschließende Mitsunobu-Reaktion mit 54 unter identischen Bedingungen wie zuvor bei 51 lieferte das gewünschte Produkt nach säulenchromatographischer Reinigung (Abb. 3.30). Die Ausbeute der Synthese von 55 über 2 Stufen lag bei 60%. Der Vergleich der beiden diastereomeren Verbindungen 52 und 55 lieferte in der ESI-Massenspektrometrie identische Spektren. Auch die R -Werte sind nahezu identisch. ier ist nur im direkten Vergleich eine f geringfügige Unterscheidung der Rf-Werte möglich. DMT-Cl Pyridin DEAD, PPh 3, C 3 CS SAc 55 Abbildung 3.30: Synthese von 3 -Acetylthio-xylo-guanosin 55 Durch den Vergleich der MR- Spektren der beiden 3 -Mercapto-guanosin-Derivate 52 und 55 sollte die rientierung der Thiol-Modifikationen eindeutig unterschieden werden.

63 Allgemeiner Teil MR-Untersuchungen der 3 -Thio-guanosine Zur Charakterisierung des 3 -Acetylthio-guanosins 52 und des entsprechende Diastereomer 3 -Acetylthio-xylo-guanosin 55 wurden ein- und zweidimensionale MR-Experimente durchgeführt, die die Konfiguration am 3 -C-Atom aufklären sollten. Die Bestimmung der vicinalen Kopplungskonstanten des -3 mit den 2 - und 4 -Protonen aus den 1 -MR- genügte nicht für eine eindeutige Bestimmung der Konfiguration, da die Spektren Diederwinkel sich hier nicht stark unterscheiden. Die 3 -Thioacetat-Gruppe zeigte aber für beide Verbindungen einen sehr unterschiedlichen Einfluss auf die chemische Verschiebung der C-2-Protonen (ppm) C 3 -C C-3 -endo 5 -C C 1 -C (ppm) SAc-dG 52 C-2 -endo (ppm) C 3 -C C C-3 -endo C 1 -C (ppm) dxg 3 -SAc- 55 C-2 -endo Abbildung 3.31: Vergleich der 3 -modifizierten Guanosin-Derivate im MQC-MR- Experiment

64 Allgemeiner Teil 58 Im 3 -Acetylthio-guanosin 52 wurde durch den Einfluss der Carbonylfunktion des Thioacetats eine große Aufspaltung der Signale von -2 und -2 beobachtet. Durch den Anisotropieeffekt wird das Signal von -2 zu tieferem Feld verschoben. Eine Verschiebung zu tieferem Feld ist ebenfalls für das 3 - zu beobachten. Eine Betrachtung der beiden bevorzugten Konformationen C-2 -endo und C-3 -endo des Zuckers in 52 zeigt, dass für beide Konformationen ein Anisotropieeffekt durch die Carbonylfunktion an C-2 zu erwarten ist. Im Fall des 3 -Acetylthio-xylo-guanosins 55 ist dieser Einfluss der Carbonylfunktion nicht zu beobachten (Abb. 3.31). Ein Anisotropieeffekt durch eine starke Abschirmung der C-2- Protonen ist bei dieser Konfiguration nicht gegeben. Eine Betrachtung der Konformationen C-2 -endo und C-3 -endo des Zuckers in 55 deutet für beide Konformationen auf eine sterische Beeinträchtigung der Acetylfunktion hin (Abb. 3.31). Durch die Schutzgruppe am C-3 wird bei diesen Guanosin-Derivaten 52 und 55 eine gute Unterscheidbarkeit im 1 -MR erreicht. Eine weitere Aussage über die Konfiguration konnte mit MBC-Experimenten (etereonuclear Multiple-Bond Correlation) getroffen werden. Ähnlich wie beim MQC-Experiment werden hier 3 J C, -Kopplungen beobachtet. Die Experimente sind für kleine Kopplungskonstanten ( n J C, = 8 z) optimiert und werden daher zur Untersuchung von Korrelationen aus long-range -Kopplungen über mehr als eine Bindung hinweg eingesetzt. Je nach Abweichung der C,-Kopplungen von 8 z ändert sich die Intensität der Kreuzsignale. Die 3 J C, -Kopplungen geben Aufschluss über den Torsionswinkel und sind bei der Konformationsanalyse von Interesse. Analog der vicinalen 1, 1 -Kopplungen wird die Abhängigkeit der Signalintensität vom Torsionswinkel durch eine Karplus-Kurve beschrieben. schwachen Signal zu rechnen. [91] Bei einem Winkel um 90 ist daher mit einem sehr Zur Analyse der Guanosin-Derivate sollten die Kreuzsignale der 3 -- und der 1 -C-Kerne im MBC- Spektrum genutzt werden. ach dem Modell ist hier der größte Unterschied in den Torsionswinkeln der beiden Diastereomeren zu erwarten. Eine Unterscheidung der C-2 endo- und C-3 -endo-konformeren von 52 und 55 ist auch hier aufgrund des großen Einflusses der Konformationen auf die C-Torsionswinkel erforderlich. In beiden Verbindungen sollte ein Konformer favorisiert sein, wodurch eine Unterscheidung der Konfigurationen an C-3 möglich wird. Je nach Konformation liegen die C- Torsionswinkel bei etwa 90 bzw. bei 150 (Abb. 3.32).

65 Allgemeiner Teil 59 Abbildung 3.32: Torsionswinkel im 3 -Acetylthio-guanosin bei unterschiedlicher 3 Konfiguration; Karplus-Kurve zur Abhängigkeit der J C, -Kopplungskonstante vom Diederwinkel Φ Anhand der Signale der C-3 -Protonen ließen sich die unterschiedlichen Torsionswinkel bei den bevorzugten Konformationen im Experiment belegen. ohe Intensitäten der Kreuzsignale der 3 J C, -Kopplungen des 3 - wurden für das Guanosin-Derivat 52 mit C-2, C-4 und C-5 beobachtet, während die Signalintensität der C-1 -Kopplung sehr gering ist. Dies deutet darauf hin, dass der Diederwinkel klein ist, was bei der vorgeschlagenen Konfiguration am C-3 für eine C-3 -endo-konformation spricht (Abb. 3.33). Beim Guanosin 55 wurden den Torsionswinkeln im Molekül entsprechend intensive Signale für die Kopplungen mit C-1, C-2 und C-4 beobachtet. Der kleine Torsionswinkel zum C-5 lieferte hier nur ein schwaches Kopplungssignal. Dieses Ergebnis entspricht der vorgeschlagenen Konfiguration bei einer C-3 -endo-konformation (Abb. 3.33).

66 Allgemeiner Teil C 3 -C (ppm) C C-3 -endo C 1 -C (ppm) SAc-dG (ppm) 2 -C 3 -C C-3 -endo 5 -C C 1 -C C-2 -endo (ppm) SAc-dxG 55 Abbildung 3.33: MBC-MR-Experimente zur Bestimmung der Torsionswinkel im Guanosin; die 3 J C, -Kopplung des 3 - mit C-1 in 3 -SAc-dxG 55 deutet auf einen großen Torsionswinkel hin Die gemessenen Signalintensitäten entsprachen den Erwartungen und bestätigen damit die unterschiedlichen Konformationen der Thiolmodifikationen am 3 -Kohlenstoff. Insgesamt wurde mit den MR-Experimenten eine eindeutige Unterscheidung und Charakterisierung der Diastereomeren 52 und 55 erreicht.

67 Allgemeiner Teil 61 Das ursprünglich zur Strukturaufklärung synthetisierte xylo-g sollte auch zur Synthese von thiolmodifizierten ligonucleotiden verwendet werden. Im geometrisch optimierten Modell zeigt sich, dass das Ligationsprodukt mit einem Cysteamin-modifizierten ligonucleotid bezüglich der Bindungslänge der Phosphordiesterbrücke ähnlich ist (Abb. 3.34). Abbildung 3.34: links: geometrische ptimierung der Core -Sequenz für das 5 -Cysteamin- 3 xsg-replikationssystem; rechts: Vergleich von Phosphordiesterbrücke und Disulfid- Verknüpfung Die flexible Verknüpfung könnte für eine Replikation mit sterisch anspruchsvollen Abgangsgruppen auch besser geeignet sein als die direkte 3-5 -Modifikation. Zum Aufbau der ligonucleotidsequenzen mit 3 -Modifikationen nach dem Phosphoramiditverfahren musste nun zunächst eine geeignete Festphase synthetisiert werden. ieran sollten die Guanosin-Derivate 52 und 55, nach Freisetzung der 3 -Thiole durch Verseifung, als Starter-ucleoside gekoppelt werden können.

68 Allgemeiner Teil Synthese von Festphasen zur 3 -Thiolmodifikation Die Synthese von 3 -Thiol-ligonucleotiden verlangt nach einer Festphase, die eine zum Phosphoramidit-Verfahren kompatible Schützung des Thiols gewährleistet. Die kommerziell erhältliche Disulfidfestphase 34 genügt diesen Anforderungen nur bedingt, da ein langsame Reduktion durch die Phosphoramidite eine schleichende Abspaltung von der Festphase bewirkt. Als mögliche Alternative wurde eine Festphase synthetisiert, in der das 3 -Thiol als Thioester verknüpft ist. Dass die Thioester-Bindung dem Phosphoramidit Verfahren standhält ist bekannt, da eine entsprechende Festphase bereits beschrieben wurde. [92] In diesem der Schwefel aber an der Festphase gebunden. Fall war Um eine brauchbare Festphase zu erhalten wurde sowohl eine, der käuflichen entsprechende, Disulfid-Festphase als auch eine Thioester-Variante synthetisiert. Zu Testzwecken wurden zunächst 3-Mercaptopropanol-Festphasen dargestellt. Das 4,4 -Dimethoxytrityloxy-3-mercaptopropan 59 wurde ausgehend von Brompropanol 56 synthetisiert (Abb. 3.35). DMTCl KSAc a Br Br DMT S Pyridin DMF S DMT Et DMT Abbildung 3.35: Synthese von 59 ausgehend von Brompropanol 56 Zunächst wurde die ydroxylfunktion DMT-geschützt. Die Thiolfunktion wurde durch Umsetzung von 57 mit Kaliumthioacetat zu 58 und anschließende Verseifung mit a erhalten. Die Ausbeute an Thiol 59 lag bei 40% über alle Stufen. Zur besseren andhabung wurde die Verbindung in acetylierter Form als 58 gelagert. Bei Bedarf wurde das Thiol freigesetzt, durch Ausschütteln mit Chloroform isoliert und ohne weitere Reinigung eingesetzt. Die Reaktion mit Bernsteinsäureanhydrid lieferte den Thioester 60, die Kopplung auf die Amino-CPG (Controlled Pore Glass) Festphase erfolgte durch Aktivierung mit BTU. ierbei handelt es sich um ein mildes Kopplungsreagenz für die Peptidsynthese (Abb. 3.36).

69 Allgemeiner Teil 63 S CPG 2 DMT S DMT S DMT C 2 Cl 2,DIEA DMF, DIEA, CPG BTU 61 Abbildung 3.36: Darstellung einer Mercaptopropyl-Festphase 61 Das Capping der verbleibenden freien Aminofunktionen mit Essigsäureanhydrid führte zur gewünschten Festphase 61. Die Beladung der Festphase wurde über die Extinktion des DMT- Kations nach Detritylierung einer Probe mit 37µmol/g bestimmt. Zur Darstellung einer disulfidverknüpften Festphase wurde eine Strategie gewählt, bei der die Immobilisierung auf einer Thiolfestphase durch Disulfidaustausch mit PySSPy-Aktivierung erfolgen sollte. Der Syntheseaufwand bliebe so gering, da für verschiedene Anwendungen verschiedene Thiolbausteine an eine Festphase gebunden werden könnten. Zur Immobilisierung waren prinzipiell drei verschiedene Strategien anwendbar: - Reaktion eines aktivierten Thiolbausteins mit einer reduzierten Thiolfestphase, - Postsynthetische Aktivierung einer Thiolfestphase zur anschließenden Umsetzung mit einem freien Thiol, - Disulfidaustausch eines freien Thiols mit einer aktivierten Festphase. Alle drei Methoden sind beschrieben und nutzbar. Bei der Verwendung von freien Thiolfestphasen wurde jedoch von Problemen durch die reduzierende Wirkung der Festphase [93, 94] berichtet. S S S S ligonucleotid PyS ligonucleotid S S PyS S S ligonucleotid ligonucleotid Abbildung 3.37: angenommener Mechanismus zur reduzierenden Wirkung einer [93] Thiolsepharose-Festphase Freie Thiolgruppen auf der Festphase können mit benachbarten Disulfiden interagieren und sorgten hier anscheinend für eine erneute Freisetzung der immobilisierten Moleküle. Auch durch ein anschließendes Capping ließ sich dieser Effekt nicht vollständig unterdrücken. [93] Aufgrund der beschriebenen Probleme wurde daher die Synthese einer aktivierten Festphase gewählt. Die reduzierende Wirkung ist hier nicht vorhanden da keine freien Thiolfunktionen

70 Allgemeiner Teil 64 auf der Festphase entstehen. Alle synthetisierten Thiolbausteine könnten ohne weitere Syntheseschritte an eine aktivierte Thiolfestphase gebunden werden. Zur Vorbereitung einer disulfidverknüpften Thiol-Festphase wurde eine Maskierung und gleichzeitige Aktivierung der Thiolfunktion in 6-Mercapto-1-hexanol 62 als 2-Mercaptopyridyl-Derivat 63 eingeführt. Die Kopplung auf Amino-CPG erfolgte nach Umsetzung mit Bernsteinsäureanhydrid durch Aktivierung mit BTU und anschließendes Capping verbliebener Aminofunktionen mit Essigsäureanhydrid. Die Beladung der aktivierten Disulfid-Festphase 65 wurde UV-spektrometrisch ermittelt. Durch Reduktion mit TCEP konnte die Beladung anhand des gebildeten Thiopyridons mit 75µmol/g bestimmt werden. S PySSPy SSPy Me DMF,DIEA SSPy CPG 2 DMF, DIEA, BTU CPG 65 S DMT SSPy 3 CPG DMF 3 S S DMT Abbildung 3.38: Darstellung einer Mercaptopropyl-Festphase Die Reaktion der Festphase mit einem 15fachen Überschuss an 4,4 -Dimethoxytrityloxy- 3-mercaptopropan lieferte das gewünschte Festphasenmaterial 66 (Abb. 3.38). Die Beladung der Festphase wurde UV-spektrometrisch über das DMT-Kation bestimmt und lag bei 48 µmol/g. Beide Festphase 61 und 66 wurden nun zur ligonucleotidsynthese eingesetzt. Als Sequenz wurde die Zielsequenz des Replikationssystems d(ttccg) gewählt. Die Synthese mit der Disulfidfestphase verlief ähnlich wie bei der zuvor verwendeten käuflichen Festphase. Im Kopplungsprotokoll war eine permanente Verschlechterung der Kopplungseffizienz durch den reduzierenden Einfluss der Phosphoramidite zu beobachten. Das 3 -thiolmodifizierte ligonucleotid konnte mittels MALDI-TF-MS charakterisiert werden.

71 Allgemeiner Teil 65 Die entsprechende Synthese mit der Thioester-Festphase 61 verlief ohne wesentliche Verschlechterung der Kopplungseffizienz. Die PLC-Aufreinigung lieferte ein auptprodukt und es waren keine Abbruchsequenzen zu beobachten. Bei der synthetisierten Sequenz handelte sich jedoch nicht um das gewünschte Thiol-ligonucleotid. Ein Ellmann-Test auf Thiolgruppen verlief negativ und die MALDI-Untersuchungen zeigten eine um 48 Masseneinheiten zu große Masse. Eine mögliche Erklärung hierfür wäre die xidation des Thioesters 67 mit Iod zum Sulfon 68. Die anschließende Entschützung mit Ammoniaklösung könnte schließlich die Sulfonsäure 69 liefern (Abb. 3.39). Eine derartige xidation erreicht man zwar normalerweise nur mit stärkeren xidationsmitteln wie Wasserstoffperoxid, für die xidation von Thiolen mit Iod ist als ebenreaktion jedoch die xidation zur Sulfonsäure bekannt. Zur Bestätigung der Richtigkeit dieser ypothese wurde eine Kontrollreaktion durchgeführt. Die xidation des entsprechenden mit der Disulfid-Festphase synthetisierten ligonucleotids mit Iod lieferte augenscheinlich neben dem Disulfid auch das Produkt, das bei der erprobten Synthese an der Thioesterfestphase 61 beobachtet werden konnte. Sowohl die Massen als auch die Retentionszeiten bei der PLC-Analyse beider ligonucleotide stimmten überein. C P ligonucleotid I 2 / S S C ligonucleotid P ligonucleotid P S CPG CPG Abbildung 3.39: xidatio n an einer Thioester-Festphase 61 zur Sulfo nsäure 69 Aufgrund der vollständigen xidation bei der Thioester-Festphase wurde eine weitere utzung, auch unter variierten Reaktionsbedingungen, ausgeschlossen. Man griff statt dessen auf die Disulfid-Festphase zurück. Zur Darstellung der ligonucleotide mit 3 -Thiol-Modifikation wurden nun die Leader- ucleoside auf die Festphase 65 gekoppelt. Die beiden diastereomeren

72 Allgemeiner Teil Acetylthio-guanosine 52 und 55 wurden hierfür mit ethanolischer a verseift und ohne weitere Aufreinigung mit der aktivierten Festphase umgesetzt. Es wurde hier, bezogen auf die Beladung der Festphase, ein 50facher Überschuss an Thiol verwendet. Die Beladung wurde erneut UV-spektrometrisch bestimmt und betrug für beide Festphasen 72 und 73 etwa 55µmol/g (Abb. 3.40). a Et 52 S DMF CPG S 70 3 SSPy 72 S S 3 CPG Abbildung 3.40: Darstellung der 3 -Thio-dG-Festphase 72; die Festphase 73 mit 3 -ThiodxG 71 wurde analog hergestellt. Ein großer Kostenvorteil bei der Synthese der Disulfid-Festphasen gegenüber anderen ligonucleotid-festphasen wird hier deutlich. Da keine Kopplungsreagenzien erforderlich sind, kann das eingesetzte ucleosid ohne aufwendige Reinigung problemlos zurück- gewonnen werden. Beid e Guanosin-Festphasen 72 und 73 wurden nun zur ligonucleotidsynthese eingesetzt. Als Sequenz wurde auch die Zielsequenz des Replikationssystems d(ttccg) gewählt. Zusätzlich wurde die Sequenz d(aagcg) mit beiden Festphase dargestellt. iermit sollte die nichtautokatalytische Reaktion untersucht werden. Für die Ligation mit den nichtkomplementären 5 -Thiolbausteinen war eine templatgesteuerte Synthese ausgeschlossen. Anhand der Kopplungsprotokolle der Synthesen war wie auch bei der Disulfidfestphase 66 eine langsame Reduktion der Disulfidbindung zu beobachten. Der Effekt war bei beiden Guanosin-Festphasen 72 und 73 aber viel schwächer als bei der Mercaptopropanol-Festphase.

73 Allgemeiner Teil 67 Aufgrund der sterischen inderung durch das Leader-ucleotid ist die Disulfidbindung vermutlich schlechter angreifbar. Die Ausbeuten wurden dadurch gegenüber der Thiolfestphase 66 stark verbessert, und die Festphasen sollte folglich auch für die Synthese längerer Sequenzen geeignet sein. Laut dem Kopplungsprotokoll des DA-Synthesizers wurde für ein 5mer eine Kopplungseffizienz von bis zu 98% erreicht (Tab. 3). Die anschließende Aufreinigung der synthetisierten ligonucleotide mittels RP-PLC lieferte gute Ausbeuten und die Analyse durch MALDI-TF-MS lieferte die berechnete Masse. Ein Ellmann-Test zum achweis von Thiolfunktionen verlief auch positiv. Augenscheinlich verlief dieser Test jedoch langsamer als bei anderen Thiolen, was auf eine verringerte ucleophilie des sekundären Thiols zurückgeführt werden kann, oder auch auf eine sterische inderung. Auch aufgrund dieser Beobachtungen sollten die 3 -Thiol-ligonucleotide in der Replikation als ucleophil dienen und die Aktivierung am 5 -Ende erfolgen. Tabelle 3: 3 -Thiol-ligonucleotide Sequenz TTCCG prs TTCCG S TTCCxG S AAGCG S AAGCxG S Modifikation 3-3 -Thio- 3 -ThioxyloGuanosin Guanosin xyloguanosin 3 -Thio- 3 -Thio- Mercaptopropyl- Guanosin M r (berechnet) M r (gemessen) Ausbeuten (gem. Kopplungsprotokoll) 65% 98% 97% 92% 94% Die 3 -Thiol-ligonucleotide zeigten bei kurzer Lagerung bereits eine Tendenz zur Ausbildung von Disulfidbindungen. Die xidation ist hier zwar gegenüber den Cysteaminund Mercaptopropyl-ligonucleotiden verlangsamt, eine oxidationsfreie andhabung war aber auch hier nicht möglich. Daher wurde zunächst nach einer Lösung für das xidationsproblem gesucht.

74 Allgemeiner Teil Reduktion und andhabung von thiolmodifizierten ligonucleotiden Bei der Synthese der ligonucleotide zeichnete sich bereits ab, dass das wohl größte Problem zur Durchführung der Replikationsexperimente die xidation des ucleophils darstellten würde. bei allen freien Thiol-ligonucleotiden wurde eine Autooxidation zum Disulfid beobachtet. Das Entgasen der Lösung und die Lagerung unter Argon brachten hier keine Abhilfe. Die Aufarbeitung nach der RP-PLC-Aufreinigung bereitet schon Probleme, da zur Entfernung des 4 C 3 -Puffers mehrfach mit einer 60% igen Ethanol-Lösung koevaporiert werden musste. ierbei wurde schon eine xidation zum Disulfid beobachtet. Es galt also zunächst, auf möglichst einfachem Weg eine Lösung von reduzierten Thiol- ligonucleotiden zu erhalten, die frei von Reduktionsmittel oder Puffer ist. ierzu wurden die gängigen Reduktionsmittel TCEP, DTT und 2-Mercaptoethanol erprobt. Während die Reduktion mit dem Phosphin TCEP nach 10 Minuten vollständig war, benötigte die Reduktion mit DTT und 2-Mercaptoethanol einige Stunden. Zur Entfernung des Überschusses an Reduktionsmittel wurden folgende Methoden erprobt: - Ausschütteln mit Essigester - Aufreinigung über C 18 -RP-Kartuschen oder AP-Säulen - Aufreinigung über RP-PLC Zur Analyse der erhaltenen Lösungen wurde die Konzentration über UV-Absorption bestimmt. Durch Reaktion mit Ellmann s Reagenz und durch PLC-Analyse wurde auf Reste an Reduktionsmittel getestet. Der Versuch DTT durch Ausschütteln mit Essigester zu entfernen führte nur zu einer sehr unvollständigen Entfernung des Reduktionsmittels. Auch die Verwendung von AP-Säulen war für keines der verwendeten Reduktionsmittel eine geeignete Trennmethode. Lediglich C 18 -RP -Kartuschen waren für eine vollständige Entfernung der Reduktionsmittel geeignet. Diese Trennmethode war jedoch mit Substanzverlusten von über 50% verbunden und wurde daher auch verworfen. Auch der Versuch eine Reduktion durch Ausschütteln mit organischen Lösungen wasserunlöslicher Phosphine wie Tris-(2-Cyanoethyl)-phosphin zu erreichen schlug fehl.

75 Allgemeiner Teil 69 Aufgrund dieser Ergebnisse wurde auf die PLC-Reinigung zurückgegriffen, bei der man die ligonucleotidlösung nur mit Wasser auf eine RP-18 Säule spülte und durch zehnminütiges Eluieren mit Wasser von Salzen und Reduktionsmittel befreite. Anschließend isolierte man das gereinigte ligonucleotid durch einen steilen Gradienten nach 40% Acetonitril. Durch das Fehlen eine Puffers war bei dieser PLC-Reinigung praktisch keine Trennleistung bezüglich mehr vorhanden. Es konnte daher nur zuvor gereinigte und vollständig reduzierte ligonucleotid-lösungen verwendet werden. Abbildung 3.41: PLC-Chromatogramm zur ligonucleotid-entsalzung; aufgrund der Überladung der Säule werden zwei Produktsignale erhalten Die PLC-Chromatogramme zeigten sehr breite Peaks, die sich über mehrere Minuten erstreckten. Dies hatte zur Folge das unter Standard-PLC-Bedingungen große Volumina an ligonucleotid-lösung erhalten wurden. Um zu möglichst konzentrierten Lösungen zu gelangen, wurden analytische RP-Säulen verwendet, die mit nmol ligonucleotid stark überladen wurden und mit einem geringem Fluss von 0,5 ml/min eluiert wurden (Abb. 3.41). Die Methode ist zeitintensiv und macht das anschließende Entfernen des Acetonitrils erforderlich. Die thiolmodifizierten ligonucleotide konnten in einer Argon-gefluteten Vakuumzentrifuge auf eine Konzentration von µm gebracht werden. Die erhaltene ligonucleotidlösung war frei von Reduktionsmitteln und Dimeren und die Substanzverluste waren gering. Eine oxidationsfreie Isolierung der ligonucleotide war so zwar erreicht, bei größeren Messreihen wäre aber weiterhin eine permanente sehr zeitaufwendige Auffrischung der Thiol-Lösung erforderlich gewesen. eben dem großen Zeit- und Arbeitsaufwand zur

76 Allgemeiner Teil 70 Vorbereitung der Messungen hätte ein solches vorgehen vermutlich auch große Auswirkungen auf die Reproduzierbarkeit der Messungen. Bei den meisten bisher untersuchten ligonucleotid-replikationssystemen wurde die Eduktbausteine aus definierten Stammlösungen pipettiert und die Aktivierung durch EDC- Zugabe erreicht. Konzentrationsschwankungen waren hier weitgehend auf Pipettierfehler beschränkt. [66, 77] Die Verwendung verschiedener Stammlösungen im neuen Replikationssystem würde dagegen für eine zusätzliche erhebliche Fehlerquelle bei Konzentrationsbestimmung sorgen. Zur besseren, längerfristigen andhabung der Eduktlösungen wurde daher nach einer reduzierenden Festphase gesucht, die eine Reduktion der entstehenden Disulfide ermöglichen, oder zumindest eine xidation verhindern sollte. Ein entsprechendes Material für die Reduktion von Peptiden ist kommerziell erhältlich. Das Festphasenmaterial ist hier mit DTT modifiziert. Aufgrund der hohen Kosten wurde dieses Reduktionsmittel jedoch nicht erprobt. Auch gibt es einige reduzierende Peptidfestphase auf [95, 96] Polystyrol-Basis, die für eine Anwendung im wässrigen jedoch nicht geeignet waren. der Stattdessen wurde versucht, TCEP 70 über eine Amidbindung auf eine geeignete Festphase zu koppeln (Abb. 3.42). Eine derartige Festphase sollte je nach Reduktionskraft in Kartuschen zur Reduktion von ligonucleotid-lösungen verwendet werden, oder reduzierte Stammlösungen durch Lagerung über einer solchen Festphase in reduzierter Form erhalten. der die Reduktion der gebildeten Disulfide könnte durch Spülen über eine mit Festphase präparierte Kartusche erfolgen. P 70 PEGA 2 PEGA P Abbildung 3.42: Schema zur Synthese einer reduktiven TCEP-Festphase Die Anforderungen an die Festphase sind zum einen eine großporige polare berfläche, die eine Wechselwirkung mit großen Molekülen erlaubt, zum anderen auch eine hohe Beladung, die für eine effektive Reduktion sorgen soll. Die genaue Verwendung der Festphase war zunächst unklar, sodass verschiedene Festphasen erprobt wurden.

77 Allgemeiner Teil 71 Bei der utzung in Form von Kartuschen mit reduzierender Festphase, die von der ligonucleotid-lösung durc hspült werden erschien Amino-CPG ( Sigma) am besten geeignet. Da diese Festphase kaum quillt, kann sie mit kleinen definierten Volumina verlustfrei umspült werden. Aufgrund dieser Eigenschaften wird die Festphase auch standardmäßig in der ligonucleotidsynthese verwendet. Vorraussetzung für diese Art der utzung ist eine hohe Reduktionskraft der Festphase. Für die Reduktion in einer Lösung durch Zugabe von Festphase sind gute Quelleigenschaften notwendig, da hierdurch die reduzierenden Gruppen der Festphase für große Moleküle gut zugänglich werden. Aufgrund ihrer exzellenten Quelleigenschaften erschienen hier die Polymer-Festphase Amino-TG (ovabiochem) und vor allem Amino-PEGA (ovabiochem) geeignet. Die utzung einer reduzierenden Festphase als Zusatz sollte auch bei geringerer Reduktionskraft möglich sein. Die Festphase könnte auch nur zur Stabilisierung einer reduzierten ligonucleotidlösung genutzt werden. Es wurden zahlreiche Versuche unternommen TCEP auf den ausgewählten Festphasen zu immobilisieren. In DMF wurden Kopplungsreagenzien wie DCC, CDI und BTU erprobt, im wässrigen wurde die Kopplung mit EDC versucht. Die Festphasen wurden nach den Umsetzungen gewaschen und im ochvakuum getrocknet. Die Reduktionskraft der Festphase wurde anschließend mit einem Ellmann-Test überprüft. Keine der Festphasen zeigte eine reduzierende Wirkung, die Waschlösungen der Umsetzungen zeigten jedoch einen positiven Ellmann Test. Es ist zu vermuten, dass in keinem Fall eine signifikante Immobilisierung auf der Festphase gelang und nicht eine xidation des TCEP für den negativen Ellmann-Test sorgte. Anstelle einer TCEP-Festphase wurden die Synthesen von Thiolfestphasen versucht. ier war verglichen mit Phosphin-Derivaten mit einer geringeren Reduktionskraft zu rechnen, Thiolfestphasen können aber mehrfach zurückgewonnen werden.

78 Allgemeiner Teil Reduzierende Thiolfestphasen ach einer Vorschrift von Axén wurden zunächst reduzierende Agarose-Beads synthetisiert. [97] Durch Polymerisation von Agarose auf Kieselgel wurden Beads 74 erzeugt, die durch Umsetzung mit Epichlorhydrin 75 lieferten. ach Epoxidöffnung mit atriumthiosulfat und Reduktion mit DTT erhielt man reduzierende Agarose-Beads 76. 1) a Cl 2 S 2 3 Agarose Agarose Agarose 2) DTT Abbildung 3.43: Darstellung thiolmodifizierter Agarose-Beads S Die Beladung der Beads wurde indirekt über einen Ellmann-Test bestimmt. Eine definierte Menge der aktivierten Festphase wurde dazu mit einer 1 M Cystamin-Lösung versetzt. ach 30 Minuten wurde dann die Cysteamin-Konzentration der Lösung über den Ellmann-Test im UV bestimmt. Die Beladung war jedoch mit 20µM/g zu gering um eine ausreichende Reduktionskraft zu erzielen, sodass nach Alternativen gesucht werden musste. Es wurden die Immobilisierung von DTT-Derivaten an den zuvor verwendeten Amino- Festphasen CPG, TentaGel und PEGA versucht. Die Verknüpfung sollte wie bei den Agarose-Beads über eine Epoxidöffnung erreicht werden (Abb. 3.44). S DMTCl DMTS Cl S SDMT DMTS Ac SDMT PEGA 2 PEGA S 81 S R Dichloressigsäure C 2 Cl 2 PEGA DMTS 80 SDMT R Abbildung 3.44: Synthese der DTT-PEGA-Festphase 81 ierzu wurde DTT 77 am Schwefel selektiv DMT-geschützt. Die anschließende Umsetzung mit Epichlorhydrin lieferte das Epoxid 79, das durch Epoxidöffnung an der Festphase

79 Allgemeiner Teil 73 immobilisiert wurde (80). Die Deblockierung mit Dichloressigsäure lieferte die gewünschte Festphase 81, die durch Reduktion mit atriumborhydrid oder TCEP aktiviert werden kann. Die DTT-Modifikationen wurden für alle Festphasen in gleicher Weise durchgeführt. Die Beladung der Festphasen wurde über die Extinktion des DMT-Kations bestimmt und war bezogen auf die erstellerangaben in allen Fällen hoch. Tabelle 4: DTT-Festphasen Festphase Amino-CPG Amino-TG Amino-PEGA Beladung (ersteller) 0.1 mmol/g mmol/g 0,3-0,4mmol/g Beladung (gemessen) 0.95 mmol/g 0.23 mmol/g 0.34 mmol/g Eine Überprüfung der Reduktionskraft durch einen Ellmann-Test, wie er zuvor bei den Agarose-Beads durchgeführt wurde, erschien hier nicht sinnvoll, da hiermit keine Aussage über die Reduzierbarkeit von Makromolekülen gemacht werden kann. Stattdessen wurde die Reduktionsleistung der Festphasen auf die Thiol-ligonucleotide verglichen. In Tests zur Reduktionskraft der Festphasen versetzte man oxidierte Thiol-ligonucleotidlösungen im Konzentrationsbereich von µM mit den Festphasen und analysierte entnommene Proben in Zeitabständen von 30 Minuten. Eine vollständige Reduktion der Disulfide konnte jedoch auch nach mehrstündiger Reaktionszeit für keine Festphase beobachtet werden, eine partielle Reduktion wurde bei jeder Festphase beobachtet. Augenscheinlich erfolgte die Reduktion mit der PEGA-Festphase schneller, was auf die hervorragenden Quelleigenschaften und die gute Durchdringbarkeit für Makromoleküle zurückzuführen ist. [98] Bei Zugabe der Festphasen zu reduzierten ligonucleotidlösungen konnten diese über Wochen stabilisiert werden. Da das DTT hier jedoch über ein sekundäres Amin an die Festphase gebunden ist, bindet die kationische Festphase trotz Capping die ligonucleotide, was zu einer stetigen Konzentrationsabnahme der Lösungen führt. Dieser Effekt konnte durch Zugabe von 0.1 M acl und der daraus resultierenden Maskierung der Ladungen unterdrückt werden. Für eine exakte Einstellung der Salzkonzentrationen im Ligationspuffer der Replikationsexperimente ist die Salzzuigabe jedoch von achteil, sodass noch ein weiterer Typ Festphase synthetisiert wurde, der diese Adhäsion nicht zeigte, die ligonucleotidlösungen aber reduziert hielt.

80 Allgemeiner Teil 74 Die besten Resultate konnten mit einer Cysteamin-modifizierten PEGA-Festphase erzielt werden. Zur Darstellung wurde Cysteamin 82 trityliert und nach Umsetzung mit Bernsteinsäureanhydrid über eine Amidbindung auf die Festphase gekoppelt (Abb. 3.45). 2 DMTCl S SDMT 2 Ac C Cl,Et SDMT C 2 Cl 2, Et 3, BTU PEGA 2 PEGA 86 S Dichloressigsäure C 2 Cl 2 PEGA Abbildung 3.45: Darstellung der Cysteamin-PEGA-Festphase SDMT Die Entschützung und Aktivierung der Festphase erfolgte analog den DTT-Festphasen mit Dichloressigsäure bzw. TCEP. Die Beladung wurde über die Extinktion des DMT-Kations bestimmt und lag bei 97% bezogen auf die Aminobeladung laut erstellerangaben. Die Cysteamin-PEGA Festphase erwies sich für die Lagerung der Thiol-ligonucleotide als sehr gut geeignet. Die ligonucleotid-stammlösung konnte durch Zugabe von etwas Festphase nicht nur über Wochen stabilisiert werden. Es war auch möglich partiell oxidierte Lösungen wieder vollständig zu reduzieren. Etwas problematisch war die andhabung der PEGA-Festphase, die im getrockneten Zustand stark verklebt und sich auch im gequollenen Zustand nur schwer portionieren oder überführen lässt. Die Cysteamin Festphase 86 wurde daher in Wasser gequollen und wurde in eine Polystyrol-Spritze mit eingesetztem porösem Diaphragma (Fritte) pipettiert und so gelagert. Bei Bedarf konnte die Festphase nun durch Aufziehen einer TCEP-Lösung aktiviert werden. ach etwa fünfzehn Minuten wurde die Reduktionslösung herausgedrückt und die Festphase durch die Fritte mit viel Wasser gewaschen. War das Waschwasser frei von Reduktionsmittel (Ellmann-Test), so wurde die erforderliche Menge an Festphase mit einem Spatel entnommen. Die restliche Festphase konnte in gleicher Weise vielfach wiederverwendet werden. Für jede Anwendung wurde die Festphase neu aktiviert, ohne hierbei merklich an Reduktionskraft zu verlieren.

81 Allgemeiner Teil 75 Zur erstellung einer Stammlösung von 3 -Thiololigonucleotiden wurde in beschriebener Weise reduziert, mit einigen Milligramm Cysteamin-Festphase versetzt und unter Argon bei -20 C gelagert. Zur Benutzung wurde die Festphase abzentrifugiert und aus der überstehenden Lösung die erforderliche Menge entnommen. Anschließend wurde wieder unter Argon bei -20 C gelagert. Ungeöffnet konnte eine Stammlösung auch nach zwei Wochen noch ohne messbare xidation verwendet werden. Bei häufiger Benutzung wurde durch RP-PLC-Analyse nach 2-3 Tagen die Bildung von Disulfiden beobachtet. Die Konzentration der Stammlösung wurde UV-spektrometrisch ermittelt und zeigte keine messbare Veränderung durch längere Lagerung. Mit der reduzierenden Festphase war es nun möglich, lagerfähige Stammlösungen beider Eduktbausteine herzustellen. ierdurch bestand nun die Möglichkeit eine größere Anzahl kinetischer Messungen über einen längeren Zeitraum ohne aufwendige Vorbereitungen durchzuführen. Die Lagerung in reduzierter Form wurde auf die 3 -Thiololigonucleotide TTCCG S TTCCxG S beschränkt, da nur diese Bausteine in der Replikation als ucleophil eingesetzt wurden und hierfür eine geeignete andhabung gefunden werden musste. Für die 5 -Thiol-ligonucleotide war diese Lagerung nicht erforderlich, da diese Bausteine als aktivierte Disulfide in der Replikation verwendet werden sollten.

82 Allgemeiner Teil Darstellung potentieller minimaler Replikasen Die Aktivierung am 5 -Thiol sollte mit DTB 23, PySSPy 24 und SDS 25 eingeführt werden. Die Abgangsgruppen zeigen eine charakteristische UV-Absorption, wodurch die Disulfid-Austauschreaktion UV-spektrometrisch verfolgbar wird. Die Verbindungen sind alle kommerziell erhältlich. Um den Einfluß einer stabilisierenden Abgangsgruppe auf die ligonucleotid-replikation zu verfolgen, wurden entsprechend modifizierte Abgangsgruppen synthetisiert. Ausgegangen wurde hierbei von Ellmann s Reagenz (DTB) und vom icotinsäuredisulfid (SDS). Die Modifikation kann hier über eine Amidbindung eingeführt werden. Wie die Modifikation aussehen sollte, war zunächst völlig offen. Eine Modifikation mit schon vorhandenen Polyaminen oder mit Peptiden bot sich an, da es vorgesehen war, eine Vielzahl strukturell verschiedener potentieller Replikasen auf möglichst einfachem Weg zugänglich zu machen. Erste Tests wurden ausschließlich mit DTB 23 durchgeführt. Es wurde versucht eine Modifikation mit Tetramethylspermin 18, aber auch mit Aminosäureestern und einfachen Aminen zu erreichen. Die Verwendung gängiger Kopplungsreagenzien wie BTU, DCC oder EDC lieferten jedoch nicht die entsprechenden Amide. Basische Bedingungen führten zur Zersetzung des DTB und eine säulenchromatographische Reinigung der Reaktionsgemische lieferte keine Trennung der Produkte. Literaturbekannte Modifikationen an DTB wurden von Annis et al. [99] und Janout et al. [100] beschrieben und verliefen ausnahmslos über Aktivester. Die Aufarbeitung erfolgte hier per PLC. Ein Aktivester 87 ließ sich durch Umsetzung mit -ydroxysuccinimid problemlos darstellen. Der durch Aktivierung mit DCC entstehende arnstoff wurde durch Ausfällen mit Ethylacetat weitgehend entfernt. Der gebildete Succimidylester 87 konnte so ohne weitere Aufreinigung eingesetzt werden.

83 Allgemeiner Teil 77 2 S S 2 23 DCC C 2 Cl 2, DMF 2 S S 2 87 Abbildung 3.46: Darstellung eines Succimidylesters von DTB ach Umsetzung mit Tetramethylspermin 18 und anderen Aminen konnten die Produkte zwar in MALDI- oder ESI-MS-Spektren identifiziert werden. Die säulenchromatographische Reinigung war aber auch hier erfolglos. Da der synthetische Aufwand für die Replikasen gering gehalten werden sollte, wurde auf eine PLC-Reinigung verzichtet. Aufgrund der Probleme bei der Synthese in Lösung wurden stattdessen nun Festphasensynthesen zur Darstellung minimaler Replikasen erprobt. Am sinnvollsten und aussichtsreichsten erschien hier die Verwendung der automatisierten Peptidsynthese. Die -terminale Einführung des Disulfids auf der Festphase könnte eine Vielzahl von peptidischen potentiellen Replikasen zugänglich machen, und die Automatisierung sollte den synthetischen Aufwand gering halten. Die Peptidsynthesen nach der Fmoc-Strategie wurden am Peptidsynthesizer ABI 433A der Firma Applied Biosystems durchgeführt, wobei einige Veränderungen der ursprünglichen Einstellungen und Protokolle vorgenommen wurden. Als Lösungsmittel für die Kopplung wurde DMF und nicht MP verwendet und als Protokoll wurde das von aumann beschriebene sogenannte SlowMoc-Protokoll verwendet. [101] Es wurden beispielhaft drei Peptide synthetisiert, die sich in Struktur und Ladung unterschieden. Allen drei Sequenzen gemeinsam war die Länge von 9 Aminosäuren und das -terminale Glycin, was eine Disulfidmodifikation erleichtern sollte. Bei allen drei Peptiden wechselten sich hydrophile und hydrophobe Seitenketten ab, wobei die Lage und Abfolge der Seitenketten starke Wechselwirkungen mit dem Phosphat-Rückgrat und mit den Basen der ligonucleotide ermöglichen sollten. [ ]

84 Allgemeiner Teil 78 Seitenketten: kationisch anionisch hydrophob Peptid 88 Modifikationen: DTB, SDS Peptid 89 Peptid 90 Abbildung 3.47: Struktur der potentiellen Peptid-Replikasen 88-90; unterschiedlich geladene Seitenketten sollen für Unterschiede in der Wechselwirkung mit den ligonucleotiden sorgen Diese Struktur sollte, wie in ähnlicher Form bei den DA-bindenden Peptiden von Takanori et al. [103, 104], im Fall von Peptid 88 (Peptid1) für eine optimale stabilisierende Wechselwirkung mit den ligonucleotiden sorgen. Die drei kationischen Seitenketten sollten an das Phosphatrückgrat binden, während die hydrophoben Seitenketten mit den Basen wechselwirken. Eine Abstufung der DA-bindenden Eigenschaften sollte bei den anderen beiden Peptiden vorliegen. Das zwitterionische Peptid 89 (Peptid2) ist nach außen einfach positiv geladen und sollte schwach bindende Eigenschaften besitzen. Die Asparaginsäure- Seitenkette im Bereich der aktivierenden Thiolmodifikation sollte dieses Peptid 89 zu einer besseren Abgangsgruppe machen, während Peptid 90 (Peptid3) mit drei anionische Seitenketten keine Stabilisierung ermöglichen sollte, sondern als egativkontrolle dienen

85 Allgemeiner Teil 79 sollte. Ein entsprechender Trend sollte bei der Replikation unter dem Einfluss dieser Peptide sichtbar gemacht werden. Mit der Wahl dieser Peptide sollte nicht die minimale Replikase gefunden werden, sondern anhand von Beispielen die Reaktionsbedingungen für die Replikation erprobt, und die Eignung des Systems untersucht werden. Eine postsynthetische Modifikation der Peptide wurde auf der Festphase mit dem Succimidylester 87 durchgeführt (Abb. 3.48). Ein Teil der Festphase aus der Peptidsynthese wurde hierfür mit einem zehnfachen Überschuss an Aktivester über acht in DMF umgesetzt. C S S C Suc S S Suc 2 2 C 2 Cl 2, DMF DCC DMF, 16h R R 8 2 S S 2 R Abbildung 3.48: Syntheseweg zur Darstellung von DTB-Peptiden Die Abspaltung der Peptide vom arz erfolgte mit TFA in Gegenwart von Triisopropylsilan (TIS) und Wasser. ach 3 Stunden konnten die Peptide durch Fällung mit kaltem Diethylether isoliert und anschließend analysiert und charakterisiert werden. Die Analysen der DTB-modifizierten Peptide mittels RP-PLC und MALDI-TF-MS zeigten im wesentlichen drei Produkte: eben den unmodifizierten Peptiden erhielt man jeweils die einfach modifizierten Peptide und als auptprodukte die Dipeptide (Abb. 3.48; 3.49). Eine Zersetzung der labilen Disulfidbindung wurde nicht beobachtet.

86 Allgemeiner Teil 80 S R S S R S R S S Peptid1: GlyAlaArgGlnLeuLysValArgGly Peptid2: 2 2 R S S C GlyAspGlyLeuValAlaArgGlyLys C R S S 2 R = Peptid, Ell Peptid3: R S S GlyAlaAspValGluAlaAspValGly C Abbildung 3.49: Struktur der potentiellen Peptid-Replikasen Die Modifikation der Peptide mit SDS 25 wurde ganz analog durchgeführt. Es wurde wie zuvor beschrieben der Aktivester hergestellt und dann über acht an das jeweilige Peptid gekoppelt. ach dreistündiger Entschützung zeigte die Analyse der Produkte jedoch eine vollständige Spaltung der Disulfidbindung. Es konnten neben dem unmodifizierten Peptid nur die Thiopyridon-Modifikationen isoliert werden. Die Abspaltungsbedingungen waren für die thiopyridyl-aktivierten Peptide zu harsch und mussten daher verändert werden. Durch Verkürzung der Entschützungsdauer auf eine Stunde konnte eine fast vollständige Entschützung bei nur sehr geringer Zersetzung erreicht werden. Tabelle 5: Synthetisierte Peptide und Massenanalyse Peptid1 88 Peptid2 89 Peptid3 90 Sequenz 2 C GARQLKVRG 2 C GDGLVARGK 2 C GADVEADVG Masse M r theo M r gem M r theo M r gem M r theo M r gem Modifikation: DTB-(Peptid) DTB-Peptid SDS-(Peptid) SDS-Peptid

87 Allgemeiner Teil 81 Alle Peptide wurden per RP-PLC analysiert und mit MALDI-TF-MS charakterisiert. In allen Fällen wurde neben einem Dipeptid als auptprodukt das einfach modifizierte Peptid und auch unmodifiziertes Peptid identifiziert. Zur erstellung von ligonucleotid-peptid-konjugaten wurden die Peptide ohne weitere Reinigung eingesetzt, da jeder Reinigungsschritt mit größeren Substanzverlusten verbunden wäre. Dies war möglich, da die Analyse der Peptide gezeigt hat, dass bei der Modifikation der Peptide kaum reaktiven ebenprodukte entstehen. Abbildung 3.50: PLC-Plot des Ellmann-modifizierten Peptids 88; im Vergleich der Messwellenlängen werden zwei modifizierte und ein unmodifizierte Peptid identifiziert Für die Darstellung der disulfid-verknüpften Konjugate sollte ein großer Peptid-Überschuss eingesetzt werden, um ein Abreagieren der gebildeten Konjugate mit weiteren Thiololigonucleotiden zu verhindern. Entsprechend gering wurden die Auswirkungen des unmodifizierten und auch des einfach modifizierten Peptids auf die Konjugatbildung eingeschätzt.

88 Allgemeiner Teil Vorbereitungen für Replikationsexperimente: Mit den in den Kapiteln 3.7. bis beschriebenen Synthesen waren nun alle erforderlichen Verbindungen für die Replikationsexperimente durch Disulfid-Austausch-Reaktionen zugänglich. Es wurden insgesamt vier Thiolmodifikationen synthetisiert die für den Gebrauch in Replikationsexperimenten geeignet schienen (Abb. 3.51). 2 2 S P S P P S 2 P S Thiole 3 - Thiole Abbildung 3.51: Verwendete 3 - und 5 -Thiolmodifikationen Es sind vier Kombinationen möglich, von denen drei vielversprechend erschienen und in Replikationsexperimenten untersucht werden sollten. Die Struktur dieser Systeme sollte eine templatgesteuerte Reaktion möglich machen. Eine Kombination von 3 - S xg 100 und 5 - S C 98 erschien aus geometrischen Gründen nicht sinnvoll, da hier eine Annäherung der reaktiven Zentren im termolekularen Komplex vermutlich unmöglich ist. Dieses System wurde daher nicht untersucht. P S S P 2 2 P S S P 2 2 P S S P 2 2 Abbildung 3.52: Disulfidverknüpfung bei den drei Replikationssystemen

89 Allgemeiner Teil 83 Untersucht werden sollte das 3-5 -Th iolsystem 101, das 3 - S xg-5 Cysteaminsystem 102 und das 3 - S G-5 -Cysteaminsystem 103. Für diese Kombinationen wurde eine templatgeste uerte Ligation in Replikationsexperimenten erwa rtet (Abb. 3.52). Zur weiteren Vorbereitung kinetischer Untersuchungen waren nun die notwendigen Aktivierungen einzuführen. Ein primäres Ziel war es zunächst die drei ligonucleotidsysteme in geeigneter Weise für eine UV-verfolgbare Ligation zu aktivieren. ierfür wurden die auch in den Voruntersuchungen verwendeten Disulfide DTB 23 PySSPy 24 und SDS 25 genutzt. Um auch eine Untersuchung der Peptide als minimale Replikasen zu ermöglichen mussten zusätzlich ligonucleotid-peptid-konjugate mit den modifizierten Peptiden synthetisiert werden. Zur Aktivierung bzw. zur Peptid-Konjugation wurden die 5 -Mercapto-ligonucleotide gewählt. So war schon ein aktiviertes Cysteamin-ligonucleotid 33 aus den Voruntersuchungen vorhanden und eine einheitliche Aktivierung war Vorraussetzung für die Kombinierbarkeit der Systeme. Die 3 -Thiole 99 und 100 sollten als ucleophile in der Replikation verwendet werden Aktivierung von Thiololigonucleotiden Die Aktivierung mittels Ellmann s Reagenz am Cysteamin-ligonucleotid Cyst CGGAA 97 wurde bereits weiter oben beschrieben. Entsprechend ging man auch bei dem 5 -Thiol- ligonucleotid S CGGAA 98 vor. ach Reduktion mit TCEP wurde ohne Abtrennung des Reduktionsmittels in EPES-Puffer bei p 7,5 mit einem großen Überschuss an DTB 23 umgesetzt. ach etwa 30 Minuten bei 30 C wurde die Reaktion abgebrochen und mit RP-PLC aufgereinigt. Zur Entfernung des 4 C 3 -Puffers wurde mit Ethanol-Wasser mehrfach koevaporiert. Die Umsetzung mit SDS und PySSPy und auch die Aufreinigung beider ligonucleotidsequenzen verlief analog. Die Reagenzien wurden jedoch in Acetonitril gelöst und zu einer gepufferten ligonucleotid-lösung gegeben. Der große Überschuss an Aktivierungsreagenz ließ sich per PLC in allen Fällen gut vom Produkt trennen. Als ebenprodukt entstand in kleinen Mengen auch immer das Disulfid des ligonucleotids. Die Charakterisierung der aktivierten 5 -Thiol-ligonucleotide erfolgte über MALDI-TF und lieferte in allen Fällen neben dem Produktsignal auch die Masse des freien Thiols. Es handelt sich hierbei vermutlich um MALDI-Artefakte die durch eine partielle Spaltung der

90 Allgemeiner Teil 84 labilen Disulfidbindungen unter Lasereinwirkung entstehen (Abb. 3.53). Die ypothese wird dadurch gestützt, dass eine Variation der Laserenergie das Intensitätsverhältnis der Signale des Disulfids und des freien Thiols stark beeinflusst. Intens. [a.u.] Ell-S CGGAA m/z Intens. [a.u.] ST-S CGGAA m/z Intens. [a.u.] PyS-S CGGAA m/z Abbildung 3.53: MALDI-TF-Charakterisierung der aktivierten 5 -Thiol-ligonucleotide Das bei DTB-Aktivierung ebenfalls beobachtete um 16 Masseneinheiten verringerte Produktsignal wurde als ein für itrogruppen typischer MALDI-Artefakt identifiziert (Abb. 3.53). [101] Auf diese Weise wurden für jede ligonucleotid-modifikation drei Aktivierungen erhalten, deren Eignung für Replikationsexperimente zu untersuchen war.

91 Allgemeiner Teil 85 Tabelle 6: aktivierte 5 -Thiololigonucleotide Ell-S CGGAA 104 ST-S CGGAA 105 PyS-S CGGAA 106 M r theoretisch M r gemessen Ell-Cyst CGGAA ST-Cyst CGGAA PyS-Cyst CGGAA M r theoretisch M r gemessen Bei neutralem p-wert und bei 20 C konnten alle aktivierten ligonucleotid-bausteine über Wochen gelagert werden. Die entsprechenden ligonucleotid-peptid-konjugate sollten ebenfalls in analoger Weise hergestellt werden Darstellung von ligonucleotid-peptid-konjugaten Die Darstellung von ligonucleotid-peptid-konjugaten gestaltete sich aufwendiger als die einfache Aktivierung der ligonucleotide. Es standen nur begrenzte Mengen an Peptiden zur Verfügung. Daher war es für die Konjugation erforderlich, das reduzierte ligonucleotid vor der Umsetzung mit dem Peptid vom überschüssigen Reduktionsmittel zu befreien. Dies wurde durch PLC-Reinigung über eine C 18 -Säule mit einem Wasser-Acetonitril-Gradienten erreicht. Die Umsetzung mit den Peptiden wurde in EPES-Puffer bei p 7.5 und 30 C durchgeführt. Der Überschuss an Peptid wurde bei allen Konjugationsreaktionen etwa 30 fach gewählt. Die Reaktionen wurden per PLC über den Verbrauch des Eduktoligonucleotids verfolgt. Es zeigte sich, dass die Reaktionen des Thiololigonucleotids mit den anionischen Peptiden 93 und 96 entschieden langsamer verliefen als mit den entsprechenden kationischen Peptiden. Die Reaktionszeiten wurden daher hier entsprechend verlängert. Unabhängig von der Art der Aktivierung lag die Reaktionszeit für die kationischen Peptide bei etwa 2 Stunden, die Reaktion der anionischen wurde nach 4h abgebrochen.

92 Allgemeiner Teil 86 S 5 3 S 5 3 C G G A A C G G A A 5 -Thiol-ligonucleotide RS S 2 2 RS S RS S 2 RS S anionische Peptide RS S 0,2M EPES, p7,5; 30 C, 4h RS S kationische Peptide 0,2M EPES, p7,5; 30 C, 2h Abbildung 3.54: Syntheseschema zur Darstellung von ligonucleotid-peptid-konjugaten Insgesamt wurden auf diesem Weg zwölf ligonucleotid-peptid-konjugate hergestellt, deren Aufreinigung mittels Standard-PLC- Verfahren durchgeführt wurde. Als Laufmittel dienten 0,1 M Ammoniumhydrogencarbonat-Puffer und Acetonitril. Mit einem Gradienten bis 35% Acetonitril konnten die polyanionischen Konjugate vom Peptidüberschuss problemlos isoliert werden, da sich hier das Laufverhalten von Peptid und ligonucleotid- Peptid-Konjugat genügend unterschied. Die anderen Konjugate waren im Laufverhalten den Peptiden sehr ähnlich und konnten zunächst nur unzureichend vom überschüssigen Peptid- Edukt abgetrennen werden. Ein Wechsel des Laufmittels zu einem Triethylammoniumacetat- Puffer brachte ebensowenig Abhilfe wie die Verwendung einer Dowex-Ionentauschersäule. Eine gelelektrophoretische Trennung erschien aufgrund der kurzen ligonucleotidsequenz nicht sinnvoll. Isoliert werden konnten die Konjugate am Ende nur durch mehrmalige PLC-Reinigung mit 4 C 3 Puffer. Es konnte so, nach zwei bis drei Reinigungsschritten eine ausreichende Trennleistung erzielt werden. Auch die Verwendung eines zuvor PLC-gereinigten Peptids

93 Allgemeiner Teil 87 brachte keine Verbesserung, da auch hier der notwendige Peptid-Überschuss nur schwer vom Produkt zu trennen war. Trotz der durch die Aufreinigung bedingten geringen Ausbeuten an ligonucleotid-peptid- Konjugaten wurden für Kinetik-Experimente ausreichende Substanzmengen aller Konjugate erhalten..] Intens. [a.u m/z Abbildung 3.55: Maldi-Spektrum v on Konjugat 120, neben dem Produktsignal beobachtet man auch die Masse des ligonucleotids Die Identifizierung der Produkte wurde über MALDI-TF erreicht. Wie bei den anderen Disulfiden war auch hier eine partielle Fragmentierung durch Spaltung der Disulfid-Bindung zu beobachten. eben der Masse des Konjugates wurden auch immer die Massen des Peptids und des ligonucleotids gefunden (Abb. 3.55). Um die Probleme bei der Aufreinigung zu umgehen, wurde neben der Aktivierung in Lösung auch versucht, die Aktivierung des ligonucleotids bereits auf der Festphase einzuführen (Abb. 3.56). Dies hätte den Vorteil, dass die aufwendigen Reinigungsschritte zur Entfernung des Reduktionsmittels und des Peptid-Überschusses wegfielen und die anschließende PLC- Reinigung der ligonucleotid-peptid-konjugate wesentlich vereinfacht würde. Erprobt wurde diese Art der Modifikation mit Ellmann s Reagenz, da so die Reaktion mit dem auf der Festphase gebundenen 5 -S-ligonucleotid direkt anhand der charakteristischen Gelbfärbung verfolgt werden konnte.

94 Allgemeiner Teil 88 Abbildung 3.56: Syntheses chema für postsynthetische ligonucleotidmodifikationen an der Festphase; das geschützte Thiololigonucleotid würde aktiviert und auf der Festphase mit dem Peptid konjugiert, milde Entschützungsbedingungen sollten dann das Konjugat liefern. Als großes Problem erwies sich hier jedoch die Basenlabilität der Disulfidbindung, wodurch eine Standardentschützung mit Ammoniak von vornherein auszuschließen war. Im Folgenden wurden daher eine Vielzahl von milderen Entschützungsmethoden mit Lithiumhydroxid, ydrazin oder Ammoniakgas versucht, die aber alle erfolglos blieben. Der Syntheseweg wurde daher verworfen und die ligonucleotid-peptid-konjugate ebenfalls in Lösung synthetisiert. Für die Darstellung einer größeren Bibliothek an ligonucleotid-peptid-konjugaten ist eine geeignete Festphasensynthese erforderlich. Ein weiterer Ansatz wäre hier zum Beispiel die Umkehrung der Synthesestrategie zur ligonucleotid-modifikation eines zuvor en tschützten Peptids auf der Festphase. Die Vielzahl verschiedener ko mmerziell e rhältlicher Peptidfestphasen sollte hier einen geeigne ten Syntheseweg ermöglichen. Für die begrenzte Anzahl an Konjugaten wurde dieser Syntheseweg nicht verfolg t, sondern di e Darstellung in Lösung bevorzugt.